CN102586273A

CN102586273A - 一种杨树不定根发育关键基因PeWOX11a及其应用

Info

Publication number: CN102586273A
Application number: CN2012100177835A
Authority: CN
Inventors: 胥猛; 谢雯凡; 黄敏仁; 陈英; 王光萍; 潘惠新; 徐立安; 王明庥
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2012-01-19
Filing date: 2012-01-19
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-01-19
Also published as: CN102586273B

Abstract

本发明公开了一种杨树不定根发育关键基因PeWOX11a，其核苷酸序列如SEQNO1所示。本发明通过将PeWOX11a基因转入杨树，过量表达PeWOX11a基因的转基因杨不定根数目增多，茎上有不定根产生，而且在异位不定根上还能再生出新植株，说明PeWOX11a基因是控制杨树不定根发生发育的关键调节因子，在林木基因工程和无性系林业领域有重要应用价值。

Description

一种杨树不定根发育关键基因PeWOX11a及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杨树不定根发育关键基因PeWOX11a及其应用。

背景技术

杨树是世界中纬度平原地区栽培最为广泛的树种之一，也是我国重要的速生工业用材树种和绿化造林树种之一，对我国无性系林业可持续发展发挥了重要作用。随着速生高产杨树新品种的不断推广，各地杨树种植产业迅猛发展，目前我国杨树人工林面积已超过700万公顷，居世界首位。一般而言，杨树是适宜无性繁殖的树种，在各种无性繁殖方法中，硬枝扦插最为普遍。插穗生根难易程度直接影响造林成活率，且事关无性系的适应性和抗逆性。尽管大多数杨树都比较容易扦插生根，然而仍有许多优良无性系扦插生根困难。随着林木遗传改良工作和无性繁殖技术的发展，人们对于杨树扦插繁殖的重要性有了新的认识，意识到从理论和实践上加强对扦插生根的机理研究有其必要性和迫切性。

“根深叶茂”，两者是相辅相成的。在拟南芥、水稻、玉米等草本植物中，根系分子生物学研究引起广泛关注，并取得显著进展(Casson and Lindsey 2003；Hochholdinger and Zimmermann 2008；Péret et al.2009)。然而，长期以来，杨树遗传改良研究更多的是集中在地上部分的表型性状，而对根系发育性状的缺乏研究，迄今鲜有杨树扦插生根及其根系发育相关基因克隆及其功能研究的报道。杨树扦插生根性状属于多基因控制的数量性状，受较强的遗传控制(Zalesny et al.2005；Zhang et al.2009)。克隆控制这些重要性状的主效基因是林木后基因组时代的主要研究内容，不仅在探索林木根系发育生物学发面有重要的理论意义，而且在无性系林业生产上有潜在应用价值。

WUSCHEL-related homeobox(WOX)蛋白是同源异型盒蛋白家族中为植物所特有的一类转录因子，在植物胚胎发育、干细胞维持、器官发生及形态建成等过程中起着非常重要的作用(Deveauxet al.2008；van der Graaffet al.2009；Zhang et al.2010)。拟南芥有15个WOX转录因子成员，分属3个进化分枝：WUS分枝(WUS clade)包括AtWUS，AtWOX1-7；中间分枝(intermediate clade)包括AtWOX8，9，11，12；古老分枝(ancient clade)包括AtWOX10，13，14。

AtWUS基因是植物WOX家族的创始成员，它的克隆代表着同源异型盒超基因家族一个新亚类的发现(Lauxet al.1996；Mayer et al.1998；Haeckeret al.2004)。AtWUS基因的编码产物是维持干细胞数量的内源性信号分子，促进花药和胚珠发育(Ikeda et al.2009)。AtWOX1和PRESSED FLOWER1(PRS1/AtWOX3)基因作用在于从各分生组织细胞层招募创始细胞以形成营养器官和花器官(Shimizu et al.2009；Vandenbussche et al.2009)。AtWOX2、AtWOX8和AtWOX9基因在拟南芥胚胎发育过程中决定器官的特异性(Breuningeret al.2008；Palovaaraet al.2010)。AtWOX2和AtWOX8最初在卵细胞和合子中特异表达，随后分别在合子第一次分裂产生的基细胞和顶细胞的子细胞中表达；AtWOX9最初在合子第一次分裂产生的基细胞的子细胞中表达。AtWOX4基因在原形成层和维管形成层中特异表达，在次生生长过程中维持维管分生组织结构(Jietal.2010；Hirakawaet al.2010)。AtWOX5在根尖不活动中心特异表达(Haecker et al.2004)，然而AtWOX5和AtWUS在维持根尖和茎尖干细胞中的作用是可以互相替代的(Sarkaret al.2007)。AtWOX6/PRETTY FEWSEEDS2(PFS2)基因表达是胚珠正常发育所必需的，主要作用是在胚珠的形成中阻止细胞过早的分化(Park et al.2005)。OsWOX11是AtWOX11的同源基因，受控于生长素和细胞分裂素共同作用，主要在水稻不定根根原基及成熟初生根的分生组织中表达(Zhao et al.2009)。AtWOX13在雄蕊、初生根、侧根及胚胎发育过程中大量表达，而AtWOX14基因局限于侧根形成早期和花药中表达(Deveauxet al.2008)。

上述结果表明：高等植物WOX基因家族的表达都具有时空特异性，可能都以不同的作用机制参与植物顶端发育调控。它们与相关基因及植物激素之间的调控网络尚不十分清楚，在杨树中尚未有WOX基因家族功能研究的相关报道。

不定根发生既是植物器官发生和形态建成中最为基本的理论问题，又是植物无性繁殖和离体器官再生方面重要的实践问题，因此成为近年来植物功能基因组研究的一个热点。WOX基因家族在根尖干细胞维持、不定根根原基启动等过程中起着非常重要的作用，在杨树中克隆和开发利用这些基因资源，不仅有助于阐明植物生长发育的分子调节机制，而且还能促进林业优良品系的快速繁殖，对农、林与园艺业的发展具有不可估量的价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杨树不定根发育关键基因PeWOX11a。本发明的另一目的是提供一种杨树不定根发育关键基因PeWOX11a的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种杨树不定根发育关键基因PeWOX11a，其核苷酸序列如SEQ NO1所示。

含有权利要求1所述的杨树不定根发育关键基因PeWOX11a的载体。

含有权利要求1所述的杨树不定根发育关键基因PeWOX11a的宿主细胞。

杨树不定根发育关键基因PeWOX11a在调控杨树不定根的发生和发育中的应用。

杨树不定根发育关键基因PeWOX11a的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO2所示。

本发明以南林895杨初生不定根为材料，通过RACE技术克隆了PeWOX11a基因。同时，采用通路克隆技术构建其杨树过量表达载体pH35GS-PeWOX11a，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PeWOX11a可在杨树体内高效表达，从而调控不定根的发生和发育。其中，所PeWOX11a基因是杨树不定根发生发育关键基因。

所述载体质粒，在PeWOX11a基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，它能使PeWOX11a基因在杨树体内高效表达。

所述载体质粒，在PeWOX11a基因的3’端组装了强终止子NOS，可有效终止PeWOX11a基因的转录。

所述载体质粒组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选。

所述载体质粒组装LB和RB序列，促使组装于其间的PeWOX11a基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中。

有益效果：本发明通过将PeWOX11a基因转入杨树，过量表达PeWOX11a基因的转基因杨不定根数目增多，茎上有不定根产生，而且在异位不定根上还能再生出新植株，说明PeWOX11a基因是控制杨树不定根发生发育的关键调节因子，在林木基因工程和无性系林业领域有重要应用价值。

附图说明

图1是植物表达载体pH5GS的结构示意图；

图2是过量表达PeWOX11a基因的转基因杨半定量检测电泳图1％琼脂糖凝胶电泳图；

图3是过量表达PeWOX11a基因的转基因杨与未转基因杨的整体形态比较图；图中，左边为未转基因杨，右边为转基因杨；

图4是过量表达PeWOX11a基因的转基因杨与未转基因杨的根形态比较图；图中，左边为未转基因杨，右边为转基因杨；

图5是过量表达PeWOX11a基因的转基因杨继代培养苗10周后茎上产生异位根图；

图6是过量表达PeWOX11a基因的转基因杨继代培养苗茎上异位根再生出新植株图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例所使用的主要试剂盒和药品为：RNAplant Reagent(TIANGEN)，RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)，SuperScript^TM First-Strand Synthesis System(Invitrogen)，LR Clonase II enzyme Mix(Invitrogen)，pCR^TM8/GW/TOPO^T ^M vector(Invitrogen)，TaKaRa LA Taq(TaKaRa)，TaKaRa Taq(TaKaRa)，pMD-19T(TaKaRa)，5’-Full RACE Kit(TaKaRa)，3’-Full RACE Core Set Ver.2.0(TaKaRa)，所有引物合成及测序工作均由Invitrogen(上海)完成。其他未作出说明的均为常规要求。

实施例1895杨cDNA模板的准备

可按常规方法准备895杨cDNA，也可以采用如下方法准备：

总RNA的粗提：吸取1mL RNAplant Reagent裂解液于2mL离心管中，将适量经液氮研磨精细的南林895杨根材料加入其中，涡旋并充分混匀；室温水平放置离心管5-10min，彻底裂解核蛋白；4℃12000rmp离心2-5min，转移上清液至新的离心管；加入0.2mL 5M NaCl，轻轻混匀；再加入0.3mL氯仿，上下颠倒混匀；4℃12000rmp离心10min，转移上清液至新的离心管；重复氯仿抽提；加与所得上清液等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；4℃12000rmp离心10min，弃上清液；加入0.5mL新鲜配置的RLT buffer(1mL RLT加10μL β-巯基乙醇)，彻底涡旋；加入250μL无水乙醇，吹打混匀；将混合液转移至收集柱RNeasy mini column(Pink)中，12000rmp离心15s，弃滤液，离心管可重复使用；在收集柱RNeasy mini column中加入350μL RWI buffer，12000rmp离心15s，弃滤液和离心管；将新鲜配置的8％L DNase I incubation mix加入收集柱RNeasy mini colum膜中央，室温静置15min；在收集柱RNeasy mini column中加入350μL RWI buffer，12000rmp离心15s，弃滤液和离心管；将收集柱RNeasy mini column放入新的离心管，加500μL buffer RPE，12000rmp离心15s，弃滤液；重新加入500μL buffer RPE，12000rmp离心2min，弃滤液和离心管；将收集柱RNeasy mini column放入新的离心管，13000rmp离心1min；将收集柱RNeasy mini column放入新的RNA收集离心管，加入适量RNase-free water到膜中央，静置1min，12000rmp离心1min；将滤液重新加入收集柱RNeasy mini column，12000rmp离心1min，回收滤液，即得总RNA；用紫外分光光度计检测确定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，确认质量完好。

总RNA的纯化：将总RNA的体积用RNase-free水调整到100μL(确保RNA总量不超过100μg)；加入350μL RLT工作液(1mL RLT加10μL β-巯基乙醇)，充分混匀；加入250μL无水乙醇，充分混匀(不要离心)；将700μL混合液将到QIAGEN纯化柱中，12000rmp，离心15s；弃滤液，加入500μL工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，12000rmp，离心15s；弃滤液，重新加入500μL工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，12000rmp，离心2min；将纯化柱放入新的离心管，最大转速离心1min；将纯化柱重新放入新的RNA收集离心管，在纯化柱膜中央加适量RNase-free水，室温静置1min，最大转速离心1min；回收滤液即得纯化RNA样品；

第一链cDNA合成：采用SuperScriptTM First-Strand Synthesis System(Invitrogen)，以Oligo DT-Adaptor Primer引物引发进行第一链cDNA的合成。具体操作如下：

准备RNA/Primer混合液：1μg南林895杨Total RNA，1μL Oligo DT-Adaptor Primer(50ng/μL)，1μL 10mM dNTP mix，加DEPC-treated water到10μL；65℃温浴5min，而后迅速放置冰上至少1min；配制反转录混合液，依次加入试剂：2μL 10×RT buffer、4μL 250nnM MgCl₂、2μL 0.1M DTT、1μL RNase OUT^TM(40U/μL)、1μL SuperScript^TM RT(200U/μL)；将10μL反转录混合液加入10μL RNA/Primer混合液中，轻轻混匀，短暂离心；进行反转录程序：25℃，10min，50℃，50min，85℃，5min(终止反应)，然后置于冰上；加1μL RNase H，混匀，短暂离心，37℃温浴20min；冰上冷却后使用灭菌Milli-Q水1：50稀释后(～10ng/μL)-20℃保存备用。

实施例2通过RACE技术克隆PeWOX11a基因

以实施例1制备的895杨cDNA为模板，使用特异性引物来扩增PeWOX11a基因短片段，其中，扩增PeWOX11a短片段正向引物为：5’TGGACTCCAAAGCCAGAGCAA 3；扩增PeWOX11a短片段反向引物为：5’GCGAGATCTTGATCGTCGGTT 3：高保真PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer(Mg²⁺free)5.0μL；2.5mM dNTP Mixture 8.0μL；25mM Mg²⁺5.0μL；LA Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL；正向引物(10μM)2μL；反向引物(10μM)2μL；模板(895杨cDNA)1μL；加无菌ddH₂O补足50μL。反应程序：94℃，3min；94℃，40s，55℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，10min。对产物测序，获得的PeWOX11a基因短片段序列如SEQ NO3所示。

依据SEQ NO3的PeWOX11a基因短片段序列设计3’末端的RACE引物，进行3’RACE，获得3’cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序，在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中通过Blast确认上述片段与其它植物相关的基因同源。以相同的方法，根据获得的正确的3’cDNA末端片段序列设计5’末端的RACE引物，进行5’RACE，获得5’cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序，主要的引物和方法如下(未特别提及的均为常规操作)：

3’RACE引物：3′RACE gene-specific outer primer：5′TGAAACTGTGAGAATAAGGAAAC3’，3′RACE gene specific inner primer：5′TGGTTCTGTTGGTGATGCAAATG3’；3′RACE Outer Primer：5′GCGAGCACAGAATTAATACGACT3’，3′RACE Inner Primer：5′CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG3’。

3′RACE反应程序：

根据3’Full RACE Core Set Ver.2.0(TaKaRa)Protocol进行。

反转录(Reverse Transcription)：将表1的成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中，轻轻混匀，短暂离心，42℃温育1h，72℃温育15min；进入3′RACE巢式PCR步骤。

表1反转录体系

南林895杨Total RNA(实施例1制备)	1μg
		dNTP Mix(10mM each)	1μL
3′RACE Adapter(5μM)	1μL
		5×M-MLV Buffer	2μL
RNase Inhibitor(40U/μL)	0.25μL
		Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(200U/μL)	0.25μL
Nuclease-free Water	to 10μL

3′RACE巢式PCR：反应体系如表2所示，反应程序为：94℃，3min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，7min。

表2 3′RACE巢式PCR的反应体系

Outer 3′RACE Component	Amount	Inner 3′RACE Component
			10×LA PCR Buffer(Mg²⁺Free)	5.0μL	10×LA PCR Buffer(Mg²⁺Free)
MgCl₂(25mM)	5.0μL	MgCl₂(25mM)
			dNTP Mixture(each 2.5mM)	8.0μL	dNTP Mixture(each 2.5mM)
3′RACE gene-specific outer primer	2.0μL	3′RACE gene specific inner primer
			3′RACE Outer Primer(10μM)	2.0μL	3′RACE Inner Primer(10μM)
RT reaction product	1μL	Outer 3′RACE PCR product
			TakaRa LA Taq(5U/μL)	0.5μL	TakaRa LA Taq(5U/μL)
Nuclease-free Water	26.5μL	Nuclease-free Water
			Total volume	50μL	Total volume

纯化片段与克隆载体的连接反应：采用TaKaRa公司的pMD19-T simple Vetor克隆目的DNA分子，参考说明书，连接反应体系与程序稍有改进，具体为：

反应体系(5μL)：2.2μL纯化回收的PCR产物，0.3μL pMD-19Simple Vector，2.5μL Solution I。反应条件：16℃30min；4℃过夜。

大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌TOP10感受态细胞在冰上融化；取5μL纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100μL感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30min左右；42℃水浴中热击90sec，迅速置于冰上3-5min；加入800μL LB液体培养基，37℃，100rmp摇菌1h；4000rmp离心3min，吸掉上层800μL培养基，混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板上，37℃倒置培养过夜。

阳性克隆筛选及测序分析：从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中，37℃，250rmp摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测，反应体系如表3所示，反应程序为：反应程序为：94℃，3min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，28个循环；72℃，7min。菌液PCR检测为阳性的克隆送英骏生物技术公司(上海)测序鉴定，得3’cDNA末端片段序列，如SEQ NO6所示。在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中通过Blast确认上述3’cDNA末端片段序列片段与拟南芥/水稻AtWOX11/OsWOX11基因高度同源。

表3PCR检测反应体系

10×PCR Buffer(Mg²⁺free)	2.0μL
		MgCl₂(25mM)	1.5μL
dNTP Mixture (each 2.5mM)	1.3μL
		3′RACE gene specific inner primer(10μM)	1.0μL
3′RACE Inner Primer(10μM)	1.0μL
		菌液	0.1μL
TaKaRa Taq	1.0μL
		Milli-Q Water	12.1μL
Total volume	20.0μL

5′RACE反应引物：5′RACE Outer Primer：5′CATGGCTACATGCTGACAGCCTA3’，5′RACE Inner Primer：5′CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG3’；5′RACE gene-specific outer primer：5′ACACCAGAGGTTTGCTCCACTTC3’，5′RACE gene specific inner primer：5′TTGCACCACCACTAGCTTGTGCCTGTTG3’。

5′RACE反应程序：

根据5’-Full RACE Kit(TaKaRa)Protocol进行。

RNA处理(RNA Processing)：CIP反应，将表4成分加入到RNase-free的小离心管中，轻轻混匀，短暂离心；37℃温育1h；在CIP反应离心管加入表5的试剂，充分涡旋，室温高速离心(≥10000g)5min；转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μL氯仿，充分涡旋，室温高速离心(≥10000g)5min；转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μL异丙醇，充分涡旋，冰浴10min；12000g离心20min，用0.5mL预冷的70％乙醇冲洗沉淀，最大转速离心5min，小心弃乙醇，气干沉淀；以11μL Nuclease-free Water重悬沉淀，即得CIP’RNA，冰上放置进一步用于TAP反应，或者-20℃保存；

表4CIP反应体系

南林895杨Total RNA(实施例1制备)	10μg
		10×CIP buffer	2μL
Calf Intestine Alkaline Phosphatase(CIP)	2μL
		Nuclease-free Water	to 20μL

表5CIP反应试剂

Ammonium Acetate Solution	15μL
		Nuclease-free Water	115μL
acid phenol：chloroform	150μL

TAP反应：把表6的成分加入到一个RNase-free的小离心管中，轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1h，即得CIP/TAP-treated RNA；进入接头连接步骤，或-20℃保存反应物。

表6TAP反应体系

CIP’d RNA(from f above)	5μL
		10×TAP buffer	1μL
Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)	2μL
		Nuclease-free Water	2μL
Total volume	10μL

5′RACE接头连接：把表7的成分加入到一个RNase-free的小离心管中，轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1h，即得Ligated RNA；进入反转录步骤，或-20℃保存反应物。

表75′RACE接头连接体系

CIP/TAP-treated RNA	2μL
		5′RACE Adapter	1μL
10×RNA Ligase Buffer	1μL
		T4RNA Ligase(2.5U/μL)	2μL
Nuclease-free Water	4μL

反转录：将表8成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中；轻轻混匀，短暂离心；42℃温育1h，即得RT reaction；进入5′RACE巢式PCR步骤，或-20℃保存反应物。

表8反转录体系(5′RACE)

Ligated RNA	2μL
		dNTP Mix	4μL
Random Decamers	2μL
		10×RT Buffer	2μL
RNase Inhibitor	1μL
		M-MLV Reverse Transcriptase	1μL
Nuclease-free Water	to 20μL

5′RACE巢式PCR：反应体系、反应条件与3′RACE的巢式PCR一致。

PCR产物克隆测序与3′RACE克隆一致，得5’cDNA末端片段序列，如SEQ NO17所示。在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中，通过Blast确认上述片段与拟南芥/水稻AtWOX11/OsWOX11基因高度同源。

采用BioEdit软件对3′RACE和5′RACE序列进行比对拼接，并使用FGENESH(http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php？topic＝fgen)预测其阅读框。根据基因全长序列设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子)，再次进行PeWOX11a基因的全长扩增和测序验证。其中，PeWOX11a ORF正向引物为：5′ATGGAAGATAATCAAGGCCAAGAC3’，PeWOX11a ORF反向引物为：5′TTAAGTTGATCTTGAAACCAGGAAAT3′；高保真PCR反应体系如下：10×LA PCR Buffer(Mg²⁺free)5.0μL；2.5mM dNTP Mixture 8.0μL；25mM Mg²⁺5.0μL；LA Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.5μL；正向引物(10μM)2μL；反向引物(10μM)2μL；模板(895杨cDNA)1μL；加无菌ddH₂O补足50μL。反应程序：预变性94℃，3min；94℃，40s，55℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，10min。

PeWOX11a全长cDNA序列为915bp，包含一个765bp的完整阅读框，序列如SEQ NO1所示。PeWOX11a基因的表达蛋白，氨基酸序列如SEQ NO2所示。

实施例2WOX11a基因植物表达载体构建

利用通路克隆技术构建PeWOX11a基因的过量表达载体。使用特异PCR引物(实施例1的PeWOX11a ORF引物)，以895杨cDNA为模板，进行PCR扩增，将PeWOX11a基因ORF构建到入门载体。入门载体为pCR^TM8/GW/TOPO^T ^M vector(Invitrogen)。反应体系为：Fresh PCR product(purified)10-20ng；Salt solution 1μL；pCR^TM8/GW/TOPO^TM vector 1μL；加无菌ddH₂O补足6μL。反应程序为：室温静置30min。

大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌TOP10感受态细胞在冰上融化；将6μl连接产物，加入到100μl感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30min左右；42℃水浴中热击90sec，迅速置于冰上3-5min；加入800μl LB液体培养基，37℃，100rmp摇菌1h；4000rmp离心3min，吸掉上层800μl培养基，混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有spc的LB筛选培养板上，37℃倒置培养过夜。

从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证，带PeWOX11a基因的入门载体与植物表达载体pH35GS进行LR反应，反应体系为：linearized entry clone 100ng；purified destination vector(100ng/μL)1.5μL；LR ClonaseII enzyme mix 2μL；加TE(pH 8.0)补足10μL；。反应条件：25℃1h。经LR反应后PeWOX11a基因导入植物表达载体pH35GS中。载体质粒如图1所示，在PeWOX11a基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，它能使PeWOX11a基因在杨树体内高效表达；在PeWOX11a基因的3’端组装了强终止子NOS，可有效终止PeWOX11a基因的转录；在载体质粒上组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选；在载体质粒组装LB和RB序列，促使组装于其间的PeWOX11a基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中。通过PCR检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为pH35GS-PeWOX11a，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PeWOX11a可在杨树体内高效表达。

实施例3PeWOX11a基因的遗传转化

通过液氮冻融法将所构建的pH35GS-PeWOX11a过量表达载体转入农杆菌菌株EHA105(Invitrogen)，通过农杆菌介导将PeWOX11a基因转入杨树。实验结果如图2～6所示，其中，图2为过量表达PeWOX11a基因的转基因杨半定量检测；图3为过量表达PeWOX11a基因的转基因杨与未转基因杨的整体形态比较，图中，左边为未转基因杨，右边为转基因杨；图4为过量表达PeWOX11a基因的转基因杨与未转基因杨的根形态比较，图中，左边为未转基因杨，右边为转基因杨；图5为过量表达PeWOX11a基因的转基因杨继代培养苗10周后茎上产生异位根；图6为过量表达PeWOX11a基因的转基因杨继代培养苗茎上异位根再生出新植株。从结果可以明显得出，过量表达PeWOX11a基因的转基因杨不定根数目增多，茎上有不定根产生，而且在异位根上还能再生出新植株，说明PeWOX11a基因是控制杨树不定根发生发育的关键调节因子，在林木基因工程和无性系林业领域有重要应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种杨树不定根发育关键基因PeWOX11a及其应用

<130> 100

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 915

<212> DNA

<213> Populus x euramericana cv. 'Nanlin895'

<400> 1

gaaaaaaaac tagtttttct tcatttcaca gtaatggaag ataatcaagg ccaagaccct 60

aatagtccaa gcaaccatgc caccgaaaga agcgaaccgg tgaggtcacg gtggactcca 120

aagccagagc aaatattgat acttgagtcc atctttaaca gtggaatggt aaacccacca 180

aaggatgaaa ctgtgagaat aaggaaactt ctagaaaaat ttggttctgt tggtgatgca 240

aatgtcttct actggtttca aaaccgacga tcaagatctc gccgccggca acgccagatg 300

caggctagtc tggttgcagg agagcaaaca aataatcaac aggcacaagc tagtggtggt 360

gcaattcaat ataaaggttg taacacttct attgggtttg caaattctcc ttcttctgtt 420

caatccccgt cttcttatct tgttggttcc tcttcttctt atggagttgt tgatgaagat 480

catggtggag agagtctgta ttctttctct aatcaaatgg cctttcaaga agtggagcaa 540

acctctggtg taacttcaat tttataccca tcggagactt ctaatttgca ttaccaaact 600

gctggattca tcacagtttt catcaacggg attcccacag aagttccaag ggggccactt 660

gacatgaaag caatgtttgg tcaagatgta gtgttggtcc attcttctgg agtgcctgta 720

cccactaatg aatttgggtt tctaatgcag agcttgcatc atggtgaaag ctatttcctg 780

gtttcaagat caacttaaat cggtattaaa gctgcgtcaa gaagtgggag cttcctctac 840

atgttggttt gctaagcgga tgtattagga acaatatttt actatgatgg gcgattggga 900

agcaaaaaaa aaaaa 915

<210> 2

<211> 254

<212> PRT

<213> Populus x euramericana cv. 'Nanlin895'

<400> 2

Met Glu Asp Asn Gln Gly Gln Asp Pro Asn Ser Pro Ser Asn His Ala

1 5 10 15

Thr Glu Arg Ser Glu Pro Val Arg Ser Arg Trp Thr Pro Lys Pro Glu

20 25 30

Gln Ile Leu Ile Leu Glu Ser Ile Phe Asn Ser Gly Met Val Asn Pro

35 40 45

Pro Lys Asp Glu Thr Val Arg Ile Arg Lys Leu Leu Glu Lys Phe Gly

50 55 60

Ser Val Gly Asp Ala Asn Val Phe Tyr Trp Phe Gln Asn Arg Arg Ser

65 70 75 80

Arg Ser Arg Arg Arg Gln Arg Gln Met Gln Ala Ser Leu Val Ala Gly

85 90 95

Glu Gln Thr Asn Asn Gln Gln Ala Gln Ala Ser Gly Gly Ala Ile Gln

100 105 110

Tyr Lys Gly Cys Asn Thr Ser Ile Gly Phe Ala Asn Ser Pro Ser Ser

115 120 125

Val Gln Ser Pro Ser Ser Tyr Leu Val Gly Ser Ser Ser Ser Tyr Gly

130 135 140

Val Val Asp Glu Asp His Gly Gly Glu Ser Leu Tyr Ser Phe Ser Asn

145 150 155 160

Gln Met Ala Phe Gln Glu Val Glu Gln Thr Ser Gly Val Thr Ser Ile

165 170 175

Leu Tyr Pro Ser Glu Thr Ser Asn Leu His Tyr Gln Thr Ala Gly Phe

180 185 190

Ile Thr Val Phe Ile Asn Gly Ile Pro Thr Glu Val Pro Arg Gly Pro

195 200 205

Leu Asp Met Lys Ala Met Phe Gly Gln Asp Val Val Leu Val His Ser

210 215 220

Ser Gly Val Pro Val Pro Thr Asn Glu Phe Gly Phe Leu Met Gln Ser

225 230 235 240

Leu His His Gly Glu Ser Tyr Phe Leu Val Ser Arg Ser Thr

245 250

<210> 3

<211> 171

<212> DNA

<213> Populus x euramericana cv. 'Nanlin895'

<400> 3

tggactccaa agccagagca aatattgata cttgagtcca tctttaacag tggaatggta 60

aacccaccaa aggatgaaac tgtgagaata aggaaacttc tagaaaaatt tggttctgtt 120

ggtgatgcaa atgtcttcta ctggtttcaa aaccgacgat caagatctcg c 171

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PeWOX11a短片段正向引物

<400> 4

tggactccaa agccagagca a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PeWOX11a短片段反向引物

<400> 5

gcgagatctt gatcgtcggt t 21

<210> 6

<211> 694

<212> DNA

<213> Populus x euramericana cv. 'Nanlin895'

<400> 6

tggttctgtt ggtgatgcaa atgtcttcta ctggtttcaa aaccgacgat caagatctcg 60

ccgccggcaa cgccagatgc aggctagtct ggttgcagga gagcaaacaa ataatcaaca 120

ggcacaagct agtggtggtg caattcaata taaaggttgt aacacttcta ttgggtttgc 180

aaattctcct tcttctgttc aatccccgtc ttcttatctt gttggttcct cttcttctta 240

tggagttgtt gatgaagatc atggtggaga gagtctgtat tctttctcta atcaaatggc 300

ctttcaagaa gtggagcaaa cctctggtgt aacttcaatt ttatacccat cggagacttc 360

taatttgcat taccaaactg ctggattcat cacagttttc atcaacggga ttcccacaga 420

agttccaagg gggccacttg acatgaaagc aatgtttggt caagatgtag tgttggtcca 480

ttcttctgga gtgcctgtac ccactaatga atttgggttt ctaatgcaga gcttgcatca 540

tggtgaaagc tatttcctgg tttcaagatc aacttaaatc ggtattaaag ctgcgtcaag 600

aagtgggagc ttcctctaca tgttggtttg ctaagcggat gtattaggaa caatatttta 660

ctatgatggg cgattgggaa gcaaaaaaaa aaaa 694

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3' RACE gene-specific outer primer

<400> 7

tgaaactgtg agaataagga aac 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3' RACE gene specific inner primer

<400> 8

tggttctgtt ggtgatgcaa atg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3' RACE Outer Primer

<400> 9

gcgagcacag aattaatacg act 23

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3' RACE Inner Primer

<400> 10

cgcggatccg aattaatacg actcactata gg 32

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5' RACE Outer Primer

<400> 11

catggctaca tgctgacagc cta 23

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5' RACE Inner Primer

<400> 12

cgcggatcca cagcctactg atgatcagtc gatg 34

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5' RACE gene-specific outer primer

<400> 13

acaccagagg tttgctccac ttc 23

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5' RACE gene specific inner primer

<400> 14

ttgcaccacc actagcttgt gcctgttg 28

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PeWOX11a ORF正向引物

<400> 15

atggaagata atcaaggcca agac 24

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PeWOX11a ORF反向引物

<400> 16

ttaagttgat cttgaaacca ggaaat 26

<210> 17

<211> 398

<212> DNA

<213> Populus x euramericana cv. 'Nanlin895'

<400> 17

cgcggatcca cagcctactg atgatcagtc gatggaaaaa aaactagttt ttcttcattt 60

cacagtaatg gaagataatc aaggccaaga ccctaatagt ccaagcaacc atgccaccga 120

aagaagcgaa ccggtgaggt cacggtggac tccaaagcca gagcaaatat tgatacttga 180

gtccatcttt aacagtggaa tggtaaaccc accaaaggat gaaactgtga gaataaggaa 240

acttctagaa aaatttggtt ctgttggtga tgcaaatgtc ttctactggt ttcaaaaccg 300

acgatcaaga tctcgccgcc ggcaacgcca gatgcaggct agtctggttg caggagagca 360

aacaaataat caacaggcac aagctagtgg tggtgcaa 398

Claims

1.一种杨树不定根发育关键基因PeWOX11a，其核苷酸序列如SEQ NO1所示。

2.含有权利要求1所述的杨树不定根发育关键基因PeWOX11a的载体。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：所述载体在PeWOX11a基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S。

4.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：所述载体在PeWOX11a基因的3’端组装了强终止子NOS。

5.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：所述载体组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选。

6.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：所述载体组装LB和RB序列，促使组装于其间的PeWOX11a基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中。

7.含有权利要求1所述的杨树不定根发育关键基因PeWOX11a的宿主细胞。

8.权利要求1所述的杨树不定根发育关键基因PeWOX11a在调控杨树不定根的发生和发育中的应用。

9.权利要求1所述的杨树不定根发育关键基因PeWOX11a的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO2所示。