CN111979251B - 一种促进植株生长的中山杉ThSHR3基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进植株生长的中山杉ThSHR3基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。所述的ThSHR3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。ThSHR3基因序列比对及进化分析表明其属于SHR基因亚家族。本发明通过构建基因pH35GS‑ThSHR3载体转化山杨新，与对照植株相比，ThSHR3基因在山新杨中高效表达，目的基因的表达量上升500倍以上，同时植株生长速度较对照植株明显增强。说明ThSHR3基因是调控植株发育、影响植株形态的重要基因，在林木基因工程领域有重要的应用价值，可以用于调整植物生长发育速度或植物形态。

Description

一种促进植株生长的中山杉ThSHR3基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种促进植株生长的中山杉ThSHR3基因及其应用。

背景技术

中山杉(Taxodium hybrid‘zhongshanshan′)是江苏省中国科学院植物研究所从落羽杉属树木杂交组合中选育出的，具有一定超亲性状的优良无性系总称，具有生长迅速、抗逆性强、景观性好、成材率高等特点，已在我国沿海防护林建设、公路及城乡绿化、农田林网和滩涂造林等方面广泛应用。目前，中山杉无性系主要通过嫩枝扦插的方法进行繁殖，近些年林业工作者一直致力于通过中山杉扦插技术改良来提高中山杉的生根率，然而，在中山杉长期选育过程中发现，不同无性系间生根能力差异显著，即使优化扦插技术，也不能改变这一现象。且随着无性系生理年龄的增长，早期选育出的无性系生根力出现衰退，植株生长也出现矮化的现象，中山杉的生长及发育研究亟需深入。

SHR(SHORT-ROOT)是植物GRAS家族中与根系发生及形态建成密切相关的一个分支，对根尖干细胞微环境的特化和维持起着关键作用，调控根皮层、内皮层初始细胞及初始细胞子细胞的垂周和平周不均等分裂，进而影响植物的正常生长发育。拟南芥shr突变体植株根尖分生组织的基本组织子细胞不能发生不对称平周分裂，仅产生一层类似皮层的细胞，shr突变体植株表现出主根生长减弱，侧根数量减少，植株矮小，子叶颜色深暗等一系列表型。同时，拟南芥中过量表达SHR基因，根尖形态变化显著，基本组织发生大量的平周分裂，产生多个细胞层。同时，SHR基因是一个功能进化比较保守的基因，目前已在玉米、水稻、杨树、辐射松等植物中发现SHR家族成员均和根发育及植株生长息息相关。研究表明SHR转录功能的行使，通常需要依靠其下游另一个GRAS家族成员SCR(SCARECROW)。SCR与SHR形成SCR/SHR复合体共同激活下游基因表达，SCR/SHR复合体直接作用于CYCD6；1(D-typecyclin 6)蛋白，CYCD6；1是细胞发生平周分裂的标志性蛋白，保证根尖细胞会在早期和晚期分别自发地进行两次平周分裂，产生完整的基本组织。国内外学者对于不同植物SHR基因的挖掘、对SHR对根部细胞分裂调控、SHR对植物生长调节机制的解析一直处于探索之中。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种促进植株生长的中山杉ThSHR3。本发明所要解决的另一技术问题是提供上述一种调控中山杉植株生长及根发育的ThSHR3基因的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种促进植株生长的中山杉ThSHR3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的促进植株生长的中山杉ThSHR3基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

含有所述的促进植株生长的中山杉ThSHR3的载体。

作为优选，所述载体为pH35GS-ThSHR3。

作为优选，所述的载体中启动ThSHR3基因的启动子为P35S。

所述的促进植株生长的中山杉ThSHR3基因或任一所述的载体在促进植物生长中的应用。

所述的应用，包括以下步骤：

(1)构建促进植株生长的中山杉ThSHR3基因的载体；

(2)将所构建的载体转化到植物或植物细胞中；

(3)培育筛选得到植株的生长速度显著增强的植物。

所述的应用中，所述的植物为山新杨。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

与现有技术相比，本发明以中山杉植株为材料，通过RACE技术克隆了中山杉根发育相关的ThSHR3基因。进行了基因的序列比对和进化分析，同时，采用通路克隆技术构建其过量表达载体pH35GS-ThSHR3，该基因位于启动子P35S之后，在启动子P35S的驱动下，ThSHR3在转化的山新杨中高效表达，表达量呈500多倍上升。过量表达ThSHR3的转基因山新杨，植株的生长速度显著增强，生长4周的pH35GS-ThSHR3转基因杨树与对照相比，不定根的数量增多、长度增长，茎节间长度变长，叶片较对照植株也明显较大。说明ThSHR3基因是调控植物植株发育和影响植物形态的重要基因，在林木基因工程领域有重要的应用价值。

附图说明

图1是植物过表达载体pH35GS示意图；

图2是ThSHR3基因的序列进化分析图；

图3是过量表达ThSHR3转基因杨树与未转基因杨树整体表型对比图，图中左为转基因杨树，图中右为未转基因杨树；

图4是过表达ThSHR3转基因植株和未转基因植株ThSHR3基因的表达变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行。

实施例1：通过RACE技术克隆ThSHR3基因

1)RNA的提取及cDNA的反转

以2019年7月采集于南京中山植物园苗圃的中山杉406(Taxodium mucronatum

×T.distichum

)(T.hybrid‘Zhongshanshan 406’)不定根为材料。使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN公司)中山杉总RNA的提取。在进行提取RNA操作前，所有的枪头，离心管，研钵均应用0.1％DEPC水浸泡过夜，高压灭菌40min后烘干。所有溶液均应采用0.1％DEPC水配制。利用DNA酶(天根生化科技有限公司)处理提取的RNA，使其纯化。用NanoDrop 2000(Thermo Scientific公司)进行总RNA浓度和纯度的测定。并用2.0％琼脂糖凝胶电泳进行总RNA的分离。后采用Invitrogen公司的3′RACE和5′RACE试剂盒获得该基因的3′端和5′端间的核酸序列。

2)ThSHR3基因目的片段的获得

根据中山杉转录组测序结果进行筛选ThSHR3的Unigene序列，使用Oligo 6设计特异性的引物扩增ThSHR3基因的目的片段。其中，ThSHR3目的片段的正向引物为：5′-CACCTGCCCCACAGTAATATATTT-3′，5′-CAAGCAAGGCTTCCAGGC-3′。采用TakaRa LA Taq进行目的片段的扩增，PCR反应体系为：0.5μL LA Taq(5U/μL)，5.0μL 10×LA PCR Buffer(Mg²⁺Free)，5.0μL MgCl₂(25mM)，8.0μL dNTP Mixture(2.5mM each)，2.0μL Forward Primer(10μM)，2.0μL Reverse Primer(10μM)，1.0μL cDNA template，26.5μLMilli-Q Water。PCR反应程序为：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，35cycles；72℃10min；4℃Forever。

使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并用QIA quick Gel Extraction Kit试剂盒(QIAGEN)进行回收。将回收产物连接到pMD19-T Vector载体(TaKaRa)上，取无菌离心管置于冰上，反应体系包括Solution I(2.5μL)，pMD 18-T Vector(0.5μL)，回收产物(2μL)，总体积为5μL，将连接反应体系溶液混匀，16℃连接过夜。连接后转化大肠杆菌Escherichia coliDH5α感受态细胞，将上述连接液全量加入有100μL感受态细胞的EP管，冰中放置30min后42℃加热45s，冰中放置5min。加入800μL的SOC培养基，37℃100rpm培养1h。将培养物3500rpm离心4min，弃上清，留取约100μL的菌液。悬浮菌体，涂布带有Amp抗性的LB琼脂培养基进行培养。倒置于37℃培养箱中培养过夜，挑选白色单菌落进行菌落PCR，鉴定目的片段是否转入大肠杆菌。再将筛选到的阳性克隆菌液送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。

依据上述ThSHR3基因目的片段分别设计扩增基因3′RACE和5′RACE的引物，PCR筛选后进行克隆测序，最后将获得3′RACE片段及5′RACE片段进行拼接。

3)5′RACE

使用引物设计软件，注意引物设计时的相关原则，避免形成二聚体等，形成理想的Tm值。

第一链cDNA合成：1μL Oligo-(dT)₁₈(0.5ug/μL)，样品总RNA(500ng)，1μL dNTP混合物(10mg/μL Each)，去RNase水，共计12μL的反应体系65℃保温5min以使RNA变性，迅速冰上冷却1min，稍离心以收集管中物质，按顺序加入4μL 5×First strand buffer，2μL 0.1MDTT，1μL RNase抑制剂(40ug/μL)，轻轻混匀，稍离心收集反应液，42℃温育2min，加1μLSuperScriptTM II RT(200units)，枪头吸打混匀，42℃温育60min，70℃15min以终止反应。离心10-20s，将反应液置于37℃，加1μL(2units)RNase mix(或RNase H)，混匀后37℃温育30min，稍离心收集反应液，置于冰上进行后续实验。

cDNA的S.N.A.P柱纯化：准备S.N.A.P流程的1×洗脱缓冲液和70％乙醇洗涤液，4℃保存。将结合溶液平衡到室温。对于每个要纯化的样品，准备约100μL的灭菌蒸馏水平衡到65℃，备用。将120μL的结合溶液(6M NaI)加到第一链反应液中。将cDNA/NaI溶液转移到S.N.A.P柱中，13000×g离心20s。将内管从管中移走，将流出液转移到另一个离心管中，将内管再放回管中。加0.4mL的1X洗脱缓冲液(4℃)到旋转管中，13000x g离心20s，丢弃流出液，重复该洗脱步骤3次。用400μL 70％乙醇(4℃)洗涤2次。从管中移走最后的70％乙醇后，13000×g离心1min。将内管转移到1个新的回收管中，加50μL的灭菌蒸馏水(预热到65℃)到选择管中，13000x g离心20s以洗脱cDNA。

cDNA的TdT加尾：将6.5μL DEPC处理的水，5.0μL 5×加尾缓冲液，2.5μL 2mMdCTP，10.0μL S.N.A.P纯化的cDNA样品，加到1个管中轻轻混合，94℃温育3min，冰上冷却1min，稍离心收集管内物，冰上放置。加1μL TdT，轻轻混合，37℃温育10min后65℃10min使TdT热失活。稍离心收集管内物，冰上放置。

加尾cDNA的PCR：PCR管中加入31.5μL灭菌蒸馏水，5.0μL 10×PCR buffer，3.0μLMgCl₂(25mM)，1.0μL dNTP mix(10mM)，2.0μL巢式GSP 1(10uM)，2.0μL Abridged Anchorprimer(10mM)，5.0μL加dC的cDNA，0.5μL的Taq DNA聚合酶(5U/μL)。将PCR管直接从冰上转到已预平衡到初始变性温度(94℃)的热循环仪，94℃2min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min；4℃保存。取10μL产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

巢式扩增：将5μL的初始PCR反应液用TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA)。PCR管中加入33.5μL灭菌蒸馏水，5.0μL 10×PCR buffer，3.0μL 25mM MgCl₂，1.0μL10mM dNTP mix，1.0μL巢式GSP2(10uM)，1.0μL AUAP(10PM)，5.0μL PCR的稀释液，0.5μLTaq DNA聚合酶(5U/μL)。将PCR管直接从冰上转到热循环仪中，进行35个循环的PCR。

5′RACE的AAP引物(Abridged Anchour Primes)：

5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3′

5′RACE的AUAP引物(Abridged Universal Amplification Primer)：

5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′

本试验设计的用于5′RACE的引物如下：

ThSHR3GSP5R1(5′-TGAACGAATTGCATT-3′，反向引物)

ThSHR3GSP5R2(5′-TCAGATGCTTTGTAGTAGTTTGCTATG-3′，反向引物)

产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的片段，利用切胶试剂盒回收后，连接于takara公司的PMD19-T simple Vector，转化大肠杆菌Escherichia coliDH5α，通过含有Amp的LB筛选培养板进行筛选，将筛选出的单克隆菌落PCR检测后送至金斯瑞公司测序鉴定。

4)3′RACE

3′RACE与5′RACE的操作步骤基本相同，主要区别是不必加尾。本实验中，用于3′RACE的引物为Adapter primer(AP)：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，以及ThSHR33F(5′-AAGGTGTTCAATCAGAAGAGATTTA-3′正向引物)。

将测序获得的3′RACE及5′RACE产物利用Bioedit软件进行拼接，获得含有2019bp碱基的目的基因，Blast确认目的基因和其他物种HAM1基因高度同源，命名为ThSHR3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其包含1个1446bp的完整编码阅读框，其所编译表达蛋白序列482bp，如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：ThSHR3基因植物表达载体构建

利用Gateway定向克隆技术，将已获得的目的基因ORF片段转移到目的表达载体上，包含BP反应和LR反应两部分。本实施例所用的载体图如图1所示。

1)BP反应的目的是将基因片段转移到入门载体上，反应体系：vector ThSHR3 ORF片段10-20ng，Salt solution 1μL，pCRTM8/GW/TOPOTM vector(入门载体)1μL，加Nuclease-free Water至总体积6μL，轻轻混匀，22℃反应60min后转移至冰上；将前步6μL反应产物转化到TOP10感受态细胞中，涂于LB筛选培养平板，挑取单克隆进行菌液PCR检测，所用引物为基因特异性上游引物和载体上的T7引物，检测后的阳性克隆进一步测序验证。

2)LR反应的目的在于将已经重组入门载体的目标基因再克隆到目的载体中，反应体系：入门载体纯化后的质粒100ng，目的载体(100ng/μL)1.5μL，LR Clonase II enzymemix 2μL，加1×TE(pH8.0)至总体积8μL，涡旋后短暂离心，25℃温浴1h，加入1μLProteinase K solution，混匀，37℃温浴10min以终止反应；取2μL LR反应产物转化Top10感受态细胞，涂于LB筛选培养平板，挑取单克隆进行菌液PCR检测，所用引物为ThSHR3基因特异性上游引物和载体上的35s引物，检测后的阳性克隆进一步测序验证。验证后，回收纯化LR反应后的重组载体，即得到目的基因的表达载体，-20℃保存备用。

实施例3：ThSHR3基因的序列比对及进化分析

使用ClustalX2软件将ThSHR3的蛋白序列与其他植物的SHR蛋白序列进行比对。将ThSHR3的蛋白质序列与TAIR中的拟南芥蛋白序列AtSHR，杨树蛋白序列PeSHR1，PeSHR2，PeSHR3中山杉蛋白序列ThSHR1，ThSHR2进行比对。结果表明，ThSHR蛋白的N端不保守，而C端相对比较保守，和其他物种的SHR蛋白一样，ThSHR蛋白包括GRAS家族成员特有的LHRI、VHIID、LHRII、PFYRE和SAW基础序列。

进一步使用MEGA 7.0软件构建系统发育树，构建方法选用最大似然法，自举检测1000次。本研究将ThSHR3的氨基酸序列与其他物种中已公布的45个GRAS氨基酸序列进行系统进化树分析。Arabidopsis thaliana(拟南芥)：AtSCL1(At1g21450.1)；AtSCL3(At1g50420.1)；AtSCL4(At5g66770.1)；AtSCL5(At1g50600.1)；AtSCL6(At4g00150.1)；AtSCL7(At3g50650.1)；AtSCL8(At5g52510.1)；AtSCL9(At2g37650.1)；AtSCL11(At5g59450.1)；AtSCL13(At4g17230.1)；AtSCL14(At1g07530.1)；AtSCL15(At4g36710.1)；AtSCL16(At5g67411.1)；AtSCL21(At2g04890.1)；AtSCL22(At3g60630.1)；AtSCL23(At5g41920.1)；AtSCL26(At4g08250.1)；AtSCL27(At2g45160.1)；AtSCL28(At1g63100.1)；AtSCL29(At3g13840.1)；AtSCL30(At3g46600.1)；AtSCL31(At1g07520.1)；AtSCL32(At3g49950.1)；AtSCL33(At2g29060.1)；AtSHR(At4g37650.1)；AtSCR(At3g54220.1)；AtRGL3(At5g17490.1)；AtRGL2(At3g03450.1)；AtRGL1(At1g66350.1)；AtRGA(At2g01570.1)；AtPAT1(At5g48150.1)；AtLAS/SCL18(Atlg55580.1)；AtGAI(At1g14920.1)；Glycine max(大豆)：GmSHR(XP_003538789.1)；Prunus persica(桃树)：PpSHR(XP_007205058.1)；Capsicum chinense(辣椒)：CcSHR(PHU27341.1)；葡萄(XP_034691976.1)：VrSHR Vitis riparia；Populus×euramericana(美洲杨)：PeSHR1，PeSHR2，PeSHR3；Pinus massoniana(马尾松)：PmSHR(QCU71495.1)；Populus trichocarpa(毛果杨)：PtSHR(XP_006372828.1)；Pinus radiata(辐射松)：PrSHR(ABW20412.1)；Taxodiumhybrid′zhongshanshan′(中山杉)：ThSHR1(MF045148)，ThSHR2(MF045149)。结果表明：GRAS蛋白家族可划分为具有不同的特征的SHR、DELLA、PAT1、SCL9、SCR、LAS/SCL18、SCL4/7、HAM的8个分支。ThSHR3被划分到SHR分支，和其他物种的SHR蛋白聚为一类，ThSHR3和中山杉ThSHR1亲缘关系最近(如图2所示)。

实施例4：ThSHR3基因的遗传转化

通过液氮冻融法将ThSHR3基因转化农杆菌，后用叶盘法转化杂种山新杨。操作步骤：在EHA105感受态细胞中加入至少100ng回收纯化的表达载体，轻轻混匀，冰浴30min，液氮速冻1min，37℃热击3min，迅速置于冰上1-2min，加入800μL LB培养基，28℃，100rmp复苏3h，4000rmp离心3min，吸掉800μL LB培养基，混匀剩余菌液，涂抹于含有抗生素的LB平板，28℃倒置培养30-48h，PCR检测阳性克隆，将阳性克隆菌落扩繁，接种于120mL含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃摇菌(220rmp)培养24h左右，至OD₆₀₀值约0.5，将菌液分装于50mL的离心管中，1400rcf离心10min，收集菌体，用一定体积的MS(不加蔗糖)溶液重悬菌体至OD₆₀₀值0.5，乙酰丁香酮(As)至终浓度为20μM，25℃温和振荡(90rmp)菌液45min，将生长势基本一致，4-6周的山新杨组培苗，取顶芽下的2-3片舒展的叶片，延叶的边缘剪出伤口，片剪成大小合适的不等边形，转入制备好的浸染液中25℃温和振荡30min(250mL的三角瓶，90rmp)，取出叶盘，用滤纸吸干残余菌液，转入不含抗生素的MS1分化培养平板上暗培养48h，洗菌后转入不含抗生素的MS1分化培养平板上光培养1W，再将叶盘转入含抗生素的MS1分化培养平板上，进行筛选培养，当叶盘边缘长出抗性不定芽时，将其转入含抗生素的MS2茎伸长培养平板上培养，当抗性不定芽在茎伸长培养基中生长至1cm左右时，将其剪下转入含有抗生素的MS培养平板上进行抗性植株生根筛选，从而获得完整植株，扦插抗性植株的苗干于MS培养基上，进行插条的表型观测。生长4W后，从图3可以看出，ThSHR3的过量表达对植株的表型产生了一定的影响：与对照的野生型山新杨植株相比，转pH35GS-ThSHR3植株的生长速度显著增强，生长4W后，转基因杨树不定根的数量增多、长度增长，茎节间长度变长，叶片较对照植株也明显较大。转基因植株的平均高度为12.1cm，对照植株的平均高度为7.5cm。

实施例5：ThSHR3基因表达分析

以生长4周的转基因山新杨及未转基因山新杨为材料，取根部为材料，进行基因的表达分析检测。植物总RNA提取试剂盒(天根公司)提取叶片RNA。利用DNA酶处理提取的RNA，使其纯化。利用2％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并用紫外分光光度计在260nm和280nm下检测RNA的浓度与纯度。以1μg RNA为模板，利用HiScript Q RTSuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒(诺唯赞公司)进行反转录，合成第1链cDNA，存于-20℃冰箱备用。

利用软件Oligo 6.0设计内参基因GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate)和两个目的基因ThSHR3的qRT-PCR引物。利用Analitik Jena qTOWER2.2(德国)系统进行qRT-PCR。按照SYBR Green试剂盒(Rox)说明书操作，扩增程序为：55℃2min，95℃10min；95℃15s，60℃1min，进行40个循环。随后设置60℃至95℃，生成融解曲线。每个样品进行3个技术性重复，20μL的反应体系中包含：2μL稀释后的cDNA(稀释比例为1∶3，稀释后的cDNA浓度大约是350ng·μL^-1)，10μL FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)，6pmol上游引物，6pmol下游引物以及6.8μL ddH₂O。基因的相对表达量按照2^-ΔΔCt方法进行计算。试验数据经SPSS 19.0软件统计分析并绘图。数据采用Duncan法(P＜0.05)进行单因素方差分析。

本实验用于荧光实时定量PCR的引物序列如下：

ThSHR3_qRT-PCR：

正向引物5′-TGGAGGAGAGCTTTT-3′，

反向引物5′-CTCGCAGCCGCGCAG-3′。

GAPDH_qRT-PCR：

正向引物5′-CCATCGGAGCCCATTATCAG-3′，

反向引物5′-ACTATGTTCAACGCCGCTGC-3′。

定量结果如图4所示：转基因植株中ThSHR3基因的表达量是未转基因植株的500倍以上。结合转基因植株的表型变异分析，表明过表达ThSHR3基因可以有效促进植株的生长发育。

序列表

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

<120> 一种促进植株生长的中山杉ThSHR3基因及其应用

<130> 100

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2019

<212> DNA

<213> Taxodium mucronatum ♀ × T. distichum ♂

<400> 1

gaaaagcagt ggtatcaacg cagagtacat gggggacttt tgctggttct gttcattttg 60

ttacctgatc aacgaagggt gggaggatgt ggattagaac aacttattgc catcagcagt 120

tgcagttcca atggagaatt ctgcaaatct gtcaagcctg gaatgatctt tcttcttgca 180

gaacacctgc cccacagtaa tatatttcca ttcaccaagg atagataatg ttggatcttg 240

ttctccatat gctgcgagcc tgcaattaac tgcgagtcat ggcaaaaata tgagtcaaga 300

tagtgactat agtatcaagg tgttcaatca gaagagattt agcctactgc tgctatggat 360

agattgttta cctccagcat agcaaactac tacaaagcat ctgaacagtg cttcaatcct 420

agcaaatact cagaaggctg ctacacagac cagtttaatc tcccacccac ctacccaaaa 480

agccacacca tttcaaagca atgcaattcg ttcatggatg accaagactt gtcattcaag 540

cagttccttc cgttcaagga gatgttcaac agcaaccagg tggagaagcc caataccacc 600

accaaccaat tcatgaggcc cagttcaagc agatcggaat tctctgagct gaatttgagt 660

gaattcgcag cagaatcagg atcaaacggc agatgggcct cgaatcttct catggaatgt 720

gcaagagcca tagcgcagaa agaaacaggg cgaatgcagc atcttctatg gatgttaaac 780

gagatgtctt ctccttatgg agactacaaa cagaaactgg cgtcctattt cctacaggcc 840

ttgttctgta aaatcactga cactggcagc cgttgctaca gaaccctctg ctctgcagtg 900

gaaaagacat actctttcga ctcagcaaga aaaatgattc tgaaattcca ggagtcgagc 960

ccctggacaa ccttcggcca cgtggctgca aacggagcta tcttggaagc ccttgaagga 1020

gaaatgaagc ttataattga catgagcaac actttctgta cacagtggcc gactctgcta 1080

gaagccctcg ccactcgaag cgacgagacg cctcacctgc gcctcaccag cgtggtgaca 1140

agcaaagagg cggcggccat taaagtcatg aaggaaatcg ggcaccgaat ggagaaagcg 1200

aggcttatgg gggttccctt tgagttcagc gtgttgcacc accatcactt acaaagattc 1260

gatcttgaga ccgtccgcat acgccccgac gaagccctag caatcaactg cattcacagc 1320

ctgcagcgag tctcgaatcc gggccgcgac tcgattctct ggactttcca gtgcatgaac 1380

cctaagattg tcacagtcgt ggaagacgag atggacctca cctcagacga tttcctcgac 1440

tgtttcagcg agtggctgag gttctttaac ctcttctttg agtccctgga ggagagcttt 1500

tccagaacga gcaacgagag acttatgctg gaaagaacca gtgccaggag catggtgaat 1560

atactggcct gtgagggttc tgatgtgtgt gagcgccgtg agagggctgt gcagtgggct 1620

gcgcggctgc gagaccccgg attcgtaccc gcgaccttca gtgacgatgt ggtggatgaa 1680

gtgagggcgc tgctgaagcg atacaaggaa ggatgggctc actgtggcaa ctcagatggg 1740

atctttctca cttggaagga acagtgcgtc atttgggctt ccgcctggaa gccttgcttg 1800

taattaatgt cttttcggtc taggttgcgg ctttcttcct tttctccagt gccttagaag 1860

ttattttaaa aagataagaa tgtttgaata cataaacagt tatatgtaca tgttaaatgg 1920

ataatgagaa agctctgtcg gaatggtcta aactagagac gattcaatat atctacaact 1980

ttttctttca ggaaaaaaaa gaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2019

<210> 2

<211> 482

<212> PRT

<213> Taxodium mucronatum ♀ × T. distichum ♂

<400> 2

Met Asp Arg Leu Phe Thr Ser Ser Ile Ala Asn Tyr Tyr Lys Ala Ser

1 5 10 15

Glu Gln Cys Phe Asn Pro Ser Lys Tyr Ser Glu Gly Cys Tyr Thr Asp

20 25 30

Gln Phe Asn Leu Pro Pro Thr Tyr Pro Lys Ser His Thr Ile Ser Lys

35 40 45

Gln Cys Asn Ser Phe Met Asp Asp Gln Asp Leu Ser Phe Lys Gln Phe

50 55 60

Leu Pro Phe Lys Glu Met Phe Asn Ser Asn Gln Val Glu Lys Pro Asn

65 70 75 80

Thr Thr Thr Asn Gln Phe Met Arg Pro Ser Ser Ser Arg Ser Glu Phe

85 90 95

Ser Glu Leu Asn Leu Ser Glu Phe Ala Ala Glu Ser Gly Ser Asn Gly

100 105 110

Arg Trp Ala Ser Asn Leu Leu Met Glu Cys Ala Arg Ala Ile Ala Gln

115 120 125

Lys Glu Thr Gly Arg Met Gln His Leu Leu Trp Met Leu Asn Glu Met

130 135 140

Ser Ser Pro Tyr Gly Asp Tyr Lys Gln Lys Leu Ala Ser Tyr Phe Leu

145 150 155 160

Gln Ala Leu Phe Cys Lys Ile Thr Asp Thr Gly Ser Arg Cys Tyr Arg

165 170 175

Thr Leu Cys Ser Ala Val Glu Lys Thr Tyr Ser Phe Asp Ser Ala Arg

180 185 190

Lys Met Ile Leu Lys Phe Gln Glu Ser Ser Pro Trp Thr Thr Phe Gly

195 200 205

His Val Ala Ala Asn Gly Ala Ile Leu Glu Ala Leu Glu Gly Glu Met

210 215 220

Lys Leu Ile Ile Asp Met Ser Asn Thr Phe Cys Thr Gln Trp Pro Thr

225 230 235 240

Leu Leu Glu Ala Leu Ala Thr Arg Ser Asp Glu Thr Pro His Leu Arg

245 250 255

Leu Thr Ser Val Val Thr Ser Lys Glu Ala Ala Ala Ile Lys Val Met

260 265 270

Lys Glu Ile Gly His Arg Met Glu Lys Ala Arg Leu Met Gly Val Pro

275 280 285

Phe Glu Phe Ser Val Leu His His His His Leu Gln Arg Phe Asp Leu

290 295 300

Glu Thr Val Arg Ile Arg Pro Asp Glu Ala Leu Ala Ile Asn Cys Ile

305 310 315 320

His Ser Leu Gln Arg Val Ser Asn Pro Gly Arg Asp Ser Ile Leu Trp

325 330 335

Thr Phe Gln Cys Met Asn Pro Lys Ile Val Thr Val Val Glu Asp Glu

340 345 350

Met Asp Leu Thr Ser Asp Asp Phe Leu Asp Cys Phe Ser Glu Trp Leu

355 360 365

Arg Phe Phe Asn Leu Phe Phe Glu Ser Leu Glu Glu Ser Phe Ser Arg

370 375 380

Thr Ser Asn Glu Arg Leu Met Leu Glu Arg Thr Ser Ala Arg Ser Met

385 390 395 400

Val Asn Ile Leu Ala Cys Glu Gly Ser Asp Val Cys Glu Arg Arg Glu

405 410 415

Arg Ala Val Gln Trp Ala Ala Arg Leu Arg Asp Pro Gly Phe Val Pro

420 425 430

Ala Thr Phe Ser Asp Asp Val Val Asp Glu Val Arg Ala Leu Leu Lys

435 440 445

Arg Tyr Lys Glu Gly Trp Ala His Cys Gly Asn Ser Asp Gly Ile Phe

450 455 460

Leu Thr Trp Lys Glu Gln Cys Val Ile Trp Ala Ser Ala Trp Lys Pro

465 470 475 480

Cys Leu

Claims (8)

1.一种促进植株生长的中山杉ThSHR3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的促进植株生长的中山杉ThSHR3基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的促进植株生长的中山杉ThSHR3的载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为pH35GS-ThSHR3。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述的载体中启动ThSHR3基因的启动子为P35S。

6.权利要求1所述的促进植株生长的中山杉ThSHR3基因或权利要求3～5任一所述的载体在促进植物生长中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建促进植株生长的中山杉ThSHR3基因的载体；

(2)将所构建的载体转化到植物或植物细胞中；

(3)培育筛选得到植株的生长速度显著增强的植物。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述的植物为山新杨。

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