CN114457094A

CN114457094A - 一种牡丹PoAGL15基因及其氨基酸序列和应用

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Publication number: CN114457094A
Application number: CN202210220246.4A
Authority: CN
Inventors: 张闻博; 江泽慧; 胡陶; 常艳婷; 马艳军; 邓雅云; 夏梦思; 张雪
Original assignee: International Center for Bamboo and Rattan
Current assignee: International Center for Bamboo and Rattan
Priority date: 2022-03-08
Filing date: 2022-03-08
Publication date: 2022-05-10

Abstract

本发明公开了一种牡丹PoAGL15基因及其氨基酸序列和应用，该基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，由该基因编码的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本发明提供的牡丹PoAGL15基因与体胚发生相关，会在早期胚中进行积累和表达，并且在牡丹体胚成熟后期具有重要的调控作用，能够加快牡丹离体繁育的效率。将其构建真核表达载体，转化拟南芥，能够增强拟南芥叶片愈伤组织的诱导并使叶片增大。本发明提供的牡丹PoAGL15基因及其氨基酸序列不仅可以为牡丹建立完整的植株再生和遗传转化体系提供一定的理论基础，而且可以应用到其它植物的育种中去。

Description

一种牡丹PoAGL15基因及其氨基酸序列和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种牡丹PoAGL15基因及其氨基酸序列和应用。

背景技术

AGL15(AGAMOUS-like 15)隶属于MADS-box基因家族MIKC亚族，是该家族中唯一出现在所有具有胚性的细胞组织中且会优先在植物胚(幼胚、胚乳、胚柄细胞等)和体胚发育过程中表达的基因成员。在花器官形成、花期调控、营养器官发育、种子以及体细胞胚发生中均发挥着重要作用，可以启动体细胞胚胎发生转录因子，AGL15同时参与生长素、赤霉素、乙烯等多种激素调控途径增强胚胎发生能力从而促使体细胞胚的形成，是植物体细胞胚胎发生过程中的具有研究价值的功能基因。

体细胞胚胎发生是植物离体再生的重要途径之一，是快速繁殖的有效途径，是未来牡丹组织培养的重点。尤其是不经过愈伤组织阶段的体胚直接发生成苗途径，可大大加快牡丹离体繁育的效率，为植物基因工程等研究提供良好的实验材料受体。

目前牡丹中关于花型、花色以及调控花期相关的重要基因大部分已被挖掘，而与体胚发生相关的功能基因研究鲜有报导。因此探究胚性基因AGL15功能特性以及在整个体胚直接发生过程表达的特点，对牡丹建立完整的植株再生和遗传转化体系具有重要意义。对于目前已经报道的与牡丹体胚发生相关的基因，并未发现其有增强植物叶片愈伤组织的诱导并使叶片增大的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牡丹PoAGL15基因及其氨基酸序列和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的牡丹PoAGL15基因与体胚发生相关，会在早期胚中进行积累和表达，并且在牡丹体胚成熟后期具有重要的调控作用，将其构建真核表达载体，转化拟南芥，能够增强拟南芥叶片愈伤组织的诱导并使叶片增大。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

方案一：本发明提供一种牡丹PoAGL15基因，来源于牡丹品种‘凤丹’(P.ostii)，该基因的序列表如SEQ No.1所示。

方案二：本发明提供一种由上述牡丹PoAGL15基因编码的蛋白，其氨基酸的序列表如SEQ No.2所示。

方案三：本发明提供一种含有上述牡丹PoAGL15基因的表达盒、重组表达载体或重组微生物。

方案四：本发明提供一种上述牡丹PoAGL15基因或其编码的蛋白在植物体胚发生过程中的应用。

方案五：本发明提供一种制备转基因植物的方法，包括以下步骤：

将牡丹PoAGL15基因通过含有PoAGL15基因表达盒的重组表达载体通过使用农杆菌介导法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株，得到转基因植物。

与现有技术相比，本发明公开了以下技术效果：

本发明提供了一种牡丹PoAGL15基因及其氨基酸序列和应用，该基因与牡丹体胚发生相关，会在早期胚中进行积累和表达，并且在牡丹体胚成熟后期具有重要的调控作用，能够加快牡丹离体繁育的效率，为牡丹建立完整的植株再生和遗传转化体系提供一定的理论基础。

将该基因构建真核表达载体，转化拟南芥，能够增强拟南芥叶片愈伤组织的诱导并使叶片增大，该功能的验证使牡丹PoAGL15基因及其氨基酸序列的特性能够应用到其它植物的育种中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为RNA琼脂糖凝胶电泳检测图，图中M为DL2000 maker条带；1-10分别为体胚不同发育阶段及0d；5d；10d；15d；20d；子叶生长期；体胚形成期；次生胚萌发；次生胚生长；体胚的成熟的RNA条带；

图2为目的基因PCR扩增电泳图M.DL2000 maker；L1.目的条带；

图3为PoAGL15基因CDS序列及所推导的氨基酸序列，实线标注的为MADS域，虚线标注的为K-box域；

图4为PoAGL15蛋白质二级结构预测；

图5为PoAGL15蛋白质三级结构预测；

图6为PoAGL15与其他植物同源氨基酸序列对比分析；

图7为PoAGL15与其他植物系统进化分析，RcAGL15-2表示Rosa chinensis中AGL15蛋白质；

图8为PoAGL15基因在体胚发生过程中的表达模式；

图9为转PoAGL15基因拟南芥的生长情况，横坐标从左到右代表野生型拟南芥，拟南芥转基因后的不同株系AGL15-1、AGL15-2、AGL15-5、AGL15-6。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例中所用材料为于2018年8月从山东菏泽大田中采收牡丹‘凤丹’(P.ostii)种子，采回后放入实验室﹣4℃冰箱内保存备用。以凤丹种胚为外植体通过体胚直接发生途径的组织培养后，获得凤丹体胚发生过程中10个连续培养阶段(0d；5d；10d；15d；20d；子叶生长期；体胚形成期；次生胚萌发期；次生胚生长期；成熟期)的植物组织材料(分别从1-10进行编号)，用于后续基因克隆以及其在体胚发育过程中表达特性的研究。

所用拟南芥来自于哥伦比亚(Columbia)野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana，col),由实验室长期保存并使用。

所用LB液体培养基为10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，pH7.0

所用LB固体培养基为每升LB液体培养基加15g琼脂(Agar)制得。

实施例1总RNA提取和cDNA合成

利用快速通用植物RNA提取试剂盒(Quick RNAIsolation Kit，华越洋，中国)，以无菌牡丹组培苗的体胚各发育时期的材料进行RNA提取。需要注意的是，牡丹各阶段植物组织大多富含多糖多酚等物质，不易获得污染小、未降解的高质量RNA，因此在提取时要注意使细胞充分裂解，操作迅速准确防止RNA不稳定而发生降解。用NanoDrop 2000核酸定量仪分光光度计测定RNA浓度，1％琼脂糖凝胶电泳确定RNA是否条带完整，RNA保存于-80℃，将各阶段所提总RNA取等量混合作为反转录模板。

采用反转录试剂盒reverse transcription system(A3500，Promega)反转录合成cDNA第一条链。具体步骤如下：

(1)按表3-1的反转录体系加入各组分；

(2)轻轻混匀后置于42℃孵育30min；

(3)放置于85℃恒温水浴锅中5s；

(4)立即放回冰盒中放置5min，得到的cDNA模板放入﹣20℃冰箱中保存，待用。

反转录反应体系如表1所示。

表1反转录反应体系

经过NanoDrop 2000核酸定量仪测定体胚直接发生过程中10个时期所提总RNA的OD260/280比值均在2.0-2.1，OD260/230均在1.8-2.0之间，经过1％琼脂糖凝胶电泳检测，RNA条带清晰明亮，28S RNA条带亮度约为18S RNA条带亮度的两倍，没有拖尾现象(图1)，表明所提各时期总RNA无蛋白污染纯度高，无降解完整性好。

实施例2‘凤丹’PoAGL15基因的克隆

设计特异性引物见表2，以反转录所获得的cDNA第一链作为模板，进行PoAGL15基因的扩增。PCR反应程序为94℃预变性，1min；进行35个循环：98℃变性，10s；56℃退火，30s；72℃，延伸1min；最后72℃，延伸10min。

表2引物序列

PCR扩增产物经琼脂凝胶电泳检测后显示，有明显的目的条带如图2所示，得到长度符合预期的核苷酸序列。将单一目的条带参照TIANGEN天根公司DNA纯化回收试剂盒(Universal DNA Purification Kit)进行回收，回收产物与pMD19-T Vector载体在室温下连接过夜12h后在大肠杆菌DH5α感受态细胞中转化，后在含AMP氨苄的LB固体琼脂培养基上均匀涂板，培养12-16h挑选单克隆进行菌落PCR，将阳性单克隆摇菌，使用TIANGEN天根公司质粒小提试剂盒(TIAN prep Mini Plasmid Kit)提取质粒并进行质粒PCR以验证可靠性，验证正确后送Invitrogen^TM英潍捷基公司测序，最终获得PoAGL15基因编码区全部序列如下：

ATGGGTCGAGGTAAGATTGAGATCAAGAGGATCGAGAATGCAAATAGCAGACAAGTCACTTTCTCTAAGAGACGTGCTGGATTGCTGAAGAAGGCGAAGGAACTTGCGATTCTTTGTGATGCTGAGGTTGCGGTTATAATTTTCTCTAATACCGGAAAGCTTTTTGAGTTCTCGAGTTCTGGCATGAAGCGAACACTTACAAGATATACGAAGTGTCAGAATTCTTCAGAGACGGCTATTGTGGAATACAAAGCAGAGAAACAAGATTCAATGGAGGCGGAAATTCTTAAAGATGAAATCACAAACCTACAAATGAAACAATTGCGGTTGTTGGGTAAGGAACTTACAGGCTTGAGCTTAAAAGATTTGCAGCACCTAGAACAACAGCTGAATGAAGGGTTATTATCCGTTAAGGAGAGGAAGGAGCAATTATTGATGGAACAATTAGAGCAGTCAAGAGTACAGGAAAAGCGAGCTATGCTGGAGAATGAAACTTTGCGCAGACAGGTTGAGGAGCTTCGAGGATTCTTTCCATCAACGGATAATTCACTGCCGTCTTATCTTGAGTACTATCCAGTAGAAAGGAAACATTCCATGCCAAAAAATGGTGTAATTGGTCCTGACGTGCTCTGCAACTGTGCAATGGAGAAAGAAGATTCAGACACCACCTTACAATTGGGGCTTCCATCTGATGTTTATCGGAAGAGGAAGGTACCCGAGAGAGAGAGCTGTTCCAACAATTCGGGAAGTCAAATTGGCATGGTCTGA

该基因序列用DNAMAN 7.0软件推导成氨基酸序列如下：

MGRGKIEIKRIENANSRQVTFSKRRAGLLKKAKELAILCDAEVAVIIFSNTGKLFEFSSSGMKRTLTRYTKCQNSSETAIVEYKAEKQDSMEAEILKDEITNLQMKQLRLLGKELTGLSLKDLQHLEQQLNEGLLSVKERKEQLLMEQLEQSRVQEKRAMLENETLRRQVEELRGFFPSTDNSLPSYLEYYPVERKHSMPKNGVIGPDVLCNCAMEKEDSDTTLQLGLPSDVYRKRKVPERESCSNNSGSQIGMV

PoAGL15基因编码区序列长768bp，共编码255个氨基酸。在N端第1-61位和第91-168位氨基酸分别含有MADS-box基因家族的两个保守结构域即MADS域和K-box域(图3)。

实施例3生物信息学分析

一、PoAGL15蛋白理化性质及结构功能分析

利用Protparam进行蛋白质基本理化性质分析、WOLF PSORT进行亚细胞定位预测、SOPMA预测蛋白质二级结构组成和特点；SWISS-MODEL和PyMol获取并可视化蛋白质三维结构。结果显示：

PoAGL15所编码蛋白质分子式为C₁₂₅₆H₂₀₇₆N₃₆₂O₄₀₁S₁₄，相对分子质量为29113.32，蛋白等电子值为7.57，不稳定指数为54.36，亲疏水性指数为-0.654(小于0表现出亲水性)，脂溶指数为83.33，推测该蛋白为不稳定的亲水性蛋白且流动性极强。亚细胞定位预测结果为nucl：12.5，cyto_nucl：7，plas：1说明蛋白极可能定位在细胞核中。蛋白质二级结构中大部分由α-螺旋和无规则卷曲组成，这两种结构占总结构比例达86.67％(图4)。通过SWISS-MODEL进行建模预测，如图5所示获得第2位氨基酸到第78位氨基酸以及第61位氨基酸到第140位氨基酸两个在保守结构域中的蛋白质三维结构，发现其β-折叠结构仅出现在MADS域中。

二、PoAGL15基因同源性分析及系统进化树构建

利用NCBI中Blast和ClustalX进行同源性分析；NCBI中CDD Tool进行保守结构域的预测，结果显示：

PoAGL15所编码的氨基酸序列与NCBI中序列一致性较高的17种其他植物中已知的AGL15氨基酸序列在ClustalX进行多序列比对同时利用MEGA6.0构建系统进化树：麻风树(JcAGL15，XP_012065634.1)、蓖麻(RcAGL15，XP_002534454.2)、橡胶(HbAGL15，XP_002534454.2)、胡桃(JrAGL15，XP_018817259.1)、欧洲栓皮栎(QsAGL15，XP_023925149.1)、枣(ZjAGL15，XP_015881556.1)、桃(PpAGL15，XP_007219474.2)、梅(PmAGL15，XP_008231548.1)、月季(RcAGL15#，XP_024186607.1)、甜樱桃(PaAGLK15，XP_021821687.1)、葡萄(VvAGL15，XP_010659213.1)、东京晚樱(PyAGL15，PQQ19640.1)、橙(CsAGL15，KDO83296.177)、克莱门柚(CcAGL15，XP_006438919.1)、相思子(ApAGL15 XP_027356129.1)、木薯(MeAGL15，XP_021625470.1)、可可(TcAGL15，XP_017975249.1)其序列平均相似度高达72.18％，其中麻风树的JcAGL15所编码的氨基酸序列相似性最高，达80.00％，与蔷薇科蔷薇属植物月季(Rosa chinensis)相似度最低为69.00％。结果见图6，其中上标“*”表示完全保守占40.00％。上标“：”表示高度保守占18.43％，上标“.”表示较高度保守占7.06％。用MEGA 6.0邻接法Neighbor-joning method构建无根系统进化树，其中Bootstrap值设置为1000，Partial deletion值设为30，分析探讨其系统进化关系。结果如图7所示，PoAGL15和葡萄VvAGL15聚在同一个小支上，说明与葡萄的亲缘关系最近。

实施例4PoAGL15基因在体胚发生过程中的表达模式

以选择泛素连接酶Ubiquitin ligase-3(E3)作为内参基因，根据PoAGL15基因CDS序列和qRT-PCR引物设计原则，设计荧光实时定量引物见表1，荧光定量PCR采用荧光定量试剂盒

Premix ExTaqTM(Perfect Real Time)，反应在QTOWER实时荧光定量PCR仪(analytikjena)上进行，采用两步法：95℃预变性，3min；进行40个循环：95℃变性，5s；62℃退火，20s。溶解曲线60到95℃，每15s升温1℃。每个反应设置3次生物学重复，3次技术重复。以第0d基因表达量为对照，采用2-ΔΔCT法计算基因在体胚直接发生过程中10个时期的转录表达特性，结果如图8所示，S1-S10分别表示：0d；5d；10d；15d；20d；子叶生长期；体胚形成期；次生胚萌发期；次生胚生长期；成熟期。发现PoAGL15第5d、10d、以及体胚成熟期这3个阶段其相对表达量分别为568.480、530.054和526.347呈现出水平相一致的高水平表达特征，而在第20d种胚两片子叶完全张开颜色变绿时其相对表达量最低仅为6.513。随后在体胚形成(S6)阶段其相对表达量上升至178.115而后下降形成一个“小峰”。PoAGL15的表达量在两个时间内的变化较为剧烈：一是在培养第10d到第15d过程中表达量迅速降低，二是在次生胚生长到体胚成熟过程中基因表达量又迅速上升。可推测牡丹中PoAGL15基因会在早期胚中进行积累和表达，并且在牡丹体胚成熟后期也具有重要的调控作用。

实施例5 PoAGL15基因表达载体构建及转化拟南芥功能验证

一、基因表达载体的构建

基因表达载体为pHG-AGL15，所用引物及酶切位点如表3所示。

表3引物列表

1)采用高保真酶PCR反应构建质粒

20μl PCR反应体系为2μl 10×缓冲液，2μl 2mM dNTPs，2μl DNA模板，1μl DMSO，0.8μl 10pmol/μl上、下游引物，0.5U kod DNA聚合酶(KOD-401,TOYOBO)，加水补足20μl。

PCR扩增程序为94℃预变性4min，94℃变性30s，50～64℃退火30s，68℃延伸1min/kb，40个循环，68℃保温8min。

2)DNA电泳，回收与酶切：

电泳：每个反应管中加入适量10×上样buffer，在1％-3％(10ul EB，1～3g琼脂糖/100ml 0.5×TBE缓冲液)的琼脂糖凝胶上进行电泳。在0.5×TBE缓冲液中以5～10V/cm进行电泳，结束电泳，在凝胶成像系统中拍照。

琼脂糖凝胶DNA回收(GK2042，捷瑞生物)：将DNA目标条带小心割下,放入1.5ml EP管中，向管中加入400ul的banding B,放入70℃水浴中，直到凝胶完全溶解，向管中加入100ul的异丙醇，室温放1分钟，5000rpm离心1分钟过柱，重复步骤3，加500ul wash buffer12000rmp洗两次，10000rmp离心1分钟，向柱中加入40ul双蒸水，37℃放置2分钟，12000rmp离心1分钟收集。

酶切：40μl酶切体系为质粒(30ul)，4μl 10×酶切缓冲液，4μl 10×BSA(加或不加参考说明书)，6U限制性内切酶(NEB)，加水补足40μl，在37度水浴处理1h左右。

3)质粒构建步骤：

PCR片段经琼脂糖凝胶回收后，与酶切回收的空载体混合，加入EasyGenoDNA重组体系连接(#VI201-02，天根生物)，10ul重组体系为：5ul 2×EasyGeno Assembly Mix，2.5ul酶切载体DNA，2.5ul片段DNA。将反应体系加入250ul EP管中，放50℃水浴30分钟后转化大肠杆菌涂板，放37℃培养箱16小时后，挑菌，送测序(测序结果在“质粒构建测序结果”文件夹中)，PHG-AGL15质粒测序正确，提质粒放在-20℃长期保存。

4)质粒的提取

接种一单菌落于3ml含适当抗生素的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜；取1.5ml培养物(低拷贝质粒取3ml)，12,000rpm离心30秒；吸尽上清液，悬浮菌体于100μl溶液Ⅰ(Glucose 50mmol/L，EDTA 10mmol/L，Tris-HCl 25mmol/L，pH 8.0)中；加入200μl新鲜配制的溶液Ⅱ(NaOH 0.2mol/L，SDS 1％)，立即轻轻上下混匀；加入150μl溶液Ⅲ(KAc5mol/L，pH 4.8)，快速上下混匀，室温放置5分钟；12,000rpm，离心10分钟；转移上清至另一离心管，加入2倍体积的乙醇，混匀；12,000rpm离心10分钟；去上清，70％乙醇洗涤DNA沉淀，12,000rpm离心1分钟，去除上清；真空干燥沉淀；溶于60μl含10μg/ml RNase A的双蒸水中。

二、转化农杆菌获得阳性克隆和测序验证

(一)转化根癌农杆菌及鉴定

1)取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中；每100μl感受态加0.1μg(体积不大于10μl)质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟；加入700μl无抗生素的LB液体培养基，于28℃，200rpm振荡培养2～3小时；6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含卡那霉素50μg/ml的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。随机挑选1个单菌落，做菌落PCR，鉴定正确的农杆菌单克隆做标记待用；

2)用无菌枪头挑取做标记的农杆菌单克隆接种到1.5ml含相应抗生素的LB液体培养基(用50ml蓝盖离心管)中30度，200rpm振荡培养24小时；

3)按1％比例将过小摇的农杆菌培养物接种加入100ml含有抗生素的LB液体培养基中，30℃，振荡培养到OD₆₀₀＝1.0左右；

4)20℃，4,000rpm，离心15min，收集菌体；

5)将菌体用转化Buffer(表4)吹打均匀，重悬至OD₆₀₀＝1.0左右。

表4菌体转化Buffer

三、化拟南芥及转基因拟南芥筛选

培养基的配制：拟南芥的培养基用1/2MS(0.8％琼脂粉，不含蔗糖，pH5.8)。

种子消毒：70％乙醇1分钟，加1ml 7％的次氯酸钠溶液(含有1滴吐温)消毒10分钟，颠倒混匀5分钟，用无菌水冲洗5次；

把消毒后的种子用100μl无菌水重悬，用1ml枪头吸取，点到1/2MS培养基(培养基中加入筛选抗生素：50μg/ml KAN或30μg/ml HYG或50μM Glufosinate-ammonium草铵膦)平板上；

平皿封口，4度冰箱内春化48h，放入到人工气候室中开始萌发生长。植物生长环境为相对湿度60％；恒温20-22度；光照周期为16h光照，8h黑暗；光照强度为80-200μmol/M2/S；

8-15天后观察，区分出阳性移栽到种植土中。

通过农杆菌介导花序侵染法获得稳定遗传的35S::PoAGL15过表达转基因拟南芥植株。将T2代过表达转基因拟南芥和野生型对照置于相同的培养条件下种植培养，结果发现：该基因显著增强了拟南芥叶片愈伤组织诱导并使叶片增大(图9)，野生型叶面积为69.55mm²，转基因拟南芥株系AGL15-1、AGL15-2、AGL15-5、AGL15-6的叶面积分别为183.89mm²、120.13mm²、109.28mm²、164.77mm²，分别比对照增加了164.40％、72.72％、57.13％、136.91％，均达到了极显著水平。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 国际竹藤中心

<120> 一种牡丹PoAGL15基因及其氨基酸序列和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggtcgag gtaagattga gatcaagagg atcgagaatg caaatagcag acaagtcact 60

ttctctaaga gacgtgctgg attgctgaag aaggcgaagg aacttgcgat tctttgtgat 120

gctgaggttg cggttataat tttctctaat accggaaagc tttttgagtt ctcgagttct 180

ggcatgaagc gaacacttac aagatatacg aagtgtcaga attcttcaga gacggctatt 240

gtggaataca aagcagagaa acaagattca atggaggcgg aaattcttaa agatgaaatc 300

acaaacctac aaatgaaaca attgcggttg ttgggtaagg aacttacagg cttgagctta 360

aaagatttgc agcacctaga acaacagctg aatgaagggt tattatccgt taaggagagg 420

aaggagcaat tattgatgga acaattagag cagtcaagag tacaggaaaa gcgagctatg 480

ctggagaatg aaactttgcg cagacaggtt gaggagcttc gaggattctt tccatcaacg 540

gataattcac tgccgtctta tcttgagtac tatccagtag aaaggaaaca ttccatgcca 600

aaaaatggtg taattggtcc tgacgtgctc tgcaactgtg caatggagaa agaagattca 660

gacaccacct tacaattggg gcttccatct gatgtttatc ggaagaggaa ggtacccgag 720

agagagagct gttccaacaa ttcgggaagt caaattggca tggtctga 768

<210> 2

<211> 768

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Thr Gly Gly Gly Thr Cys Gly Ala Gly Gly Thr Ala Ala Gly Ala

1 5 10 15

Thr Thr Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Thr

20 25 30

Cys Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Ala Gly Cys

35 40 45

Ala Gly Ala Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala Cys Thr Thr Thr Cys Thr

50 55 60

Cys Thr Ala Ala Gly Ala Gly Ala Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly

65 70 75 80

Ala Thr Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Cys Gly

85 90 95

Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys Thr Thr Gly Cys Gly Ala Thr Thr Cys

100 105 110

Thr Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly Thr

115 120 125

Thr Gly Cys Gly Gly Thr Thr Ala Thr Ala Ala Thr Thr Thr Thr Cys

130 135 140

Thr Cys Thr Ala Ala Thr Ala Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Cys

145 150 155 160

Thr Thr Thr Thr Thr Gly Ala Gly Thr Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly

165 170 175

Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly Cys Gly Ala

180 185 190

Ala Cys Ala Cys Thr Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Thr Ala Thr Ala

195 200 205

Cys Gly Ala Ala Gly Thr Gly Thr Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr Cys

210 215 220

Thr Thr Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Gly Gly Cys Thr Ala Thr Thr

225 230 235 240

Gly Thr Gly Gly Ala Ala Thr Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly

245 250 255

Ala Gly Ala Ala Ala Cys Ala Ala Gly Ala Thr Thr Cys Ala Ala Thr

260 265 270

Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala Ala Thr Thr Cys Thr Thr

275 280 285

Ala Ala Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Cys Ala Ala

290 295 300

Ala Cys Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala

305 310 315 320

Ala Thr Thr Gly Cys Gly Gly Thr Thr Gly Thr Thr Gly Gly Gly Thr

325 330 335

Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys Thr Thr Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr

340 345 350

Thr Gly Ala Gly Cys Thr Thr Ala Ala Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr

355 360 365

Gly Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Thr Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala

370 375 380

Cys Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly Gly Thr

385 390 395 400

Thr Ala Thr Thr Ala Thr Cys Cys Gly Thr Thr Ala Ala Gly Gly Ala

405 410 415

Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Ala Thr Thr Ala

420 425 430

Thr Thr Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Ala Gly

435 440 445

Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Ala Ala Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala

450 455 460

Gly Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys Gly Ala Gly Cys Thr Ala Thr Gly

465 470 475 480

Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Thr Thr

485 490 495

Thr Gly Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Gly Thr Thr Gly Ala

500 505 510

Gly Gly Ala Gly Cys Thr Thr Cys Gly Ala Gly Gly Ala Thr Thr Cys

515 520 525

Thr Thr Thr Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Gly Gly Ala Thr Ala

530 535 540

Ala Thr Thr Cys Ala Cys Thr Gly Cys Cys Gly Thr Cys Thr Thr Ala

545 550 555 560

Thr Cys Thr Thr Gly Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Thr Cys Cys Ala

565 570 575

Gly Thr Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Cys Ala Thr Thr

580 585 590

Cys Cys Ala Thr Gly Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Gly

595 600 605

Thr Gly Thr Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Gly Ala Cys

610 615 620

Gly Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Thr Gly Thr Gly

625 630 635 640

Cys Ala Ala Thr Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala

645 650 655

Thr Thr Cys Ala Gly Ala Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Ala

660 665 670

Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly Gly Gly Cys Thr Thr Cys Cys Ala Thr

675 680 685

Cys Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Thr Ala Thr Cys Gly Gly Ala Ala

690 695 700

Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Cys Cys Cys Gly Ala Gly

705 710 715 720

Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Ala

725 730 735

Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys Gly Gly Gly Ala Ala Gly Thr Cys Ala

740 745 750

Ala Ala Thr Thr Gly Gly Cys Ala Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly Ala

755 760 765

Claims

1.一种牡丹PoAGL15基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种如权利要求1所述牡丹PoAGL15基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种含有如权利要求1所述牡丹PoAGL15基因的表达盒、重组表达载体或重组微生物。

4.一种如权利要求3所述的基因或权利要求2所述的蛋白在植物体胚发生过程中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，还包括增强愈伤组织诱导和增大植物叶片中的应用。

6.一种制备叶片增大转基因植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述牡丹PoAGL15基因导入受体植物中，得到转基因植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述受体植物包括牡丹或拟南芥。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PoAGL15基因通过含有PoAGL15基因的重组表达载体导入受体植物中。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述含有PoAGL15基因的重组表达载体通过使用农杆菌介导法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。