CN117843746A - 一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白的应用 - Google Patents
一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117843746A CN117843746A CN202410140081.9A CN202410140081A CN117843746A CN 117843746 A CN117843746 A CN 117843746A CN 202410140081 A CN202410140081 A CN 202410140081A CN 117843746 A CN117843746 A CN 117843746A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- powox11
- gene
- peony
- arabidopsis
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 119
- 235000006484 Paeonia officinalis Nutrition 0.000 title claims abstract description 81
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 244000170916 Paeonia officinalis Species 0.000 title 1
- 241000736199 Paeonia Species 0.000 claims abstract description 80
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 claims abstract description 53
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims abstract description 8
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 claims description 10
- 238000002788 crimping Methods 0.000 claims description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 18
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000011890 leaf development Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 8
- 101150066705 WOX11 gene Proteins 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 6
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 6
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 6
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 6
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 5
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 241000847925 Paeonia ostii Species 0.000 description 4
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 4
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 3
- 241000218976 Populus trichocarpa Species 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 244000194101 Ginkgo biloba Species 0.000 description 2
- 235000008100 Ginkgo biloba Nutrition 0.000 description 2
- 101000650154 Homo sapiens WW domain-containing oxidoreductase Proteins 0.000 description 2
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 2
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 2
- 101100049728 Oryza sativa subsp. japonica WOX9 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000218657 Picea Species 0.000 description 2
- 235000008124 Picea excelsa Nutrition 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 2
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 description 2
- 101150065399 WOX4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150010537 WOX5 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710089893 WUSCHEL-related homeobox 11 Proteins 0.000 description 2
- 102100027534 WW domain-containing oxidoreductase Human genes 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000021749 root development Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 2
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 2
- 101150000874 11 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100036791 Adhesion G protein-coupled receptor L2 Human genes 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000722956 Amborella trichopoda Species 0.000 description 1
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 1
- 241000228527 Ceratopteris richardii Species 0.000 description 1
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150032501 FUS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000011201 Ginkgo Nutrition 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000928189 Homo sapiens Adhesion G protein-coupled receptor L2 Proteins 0.000 description 1
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101150057259 LEC gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101100156776 Oryza sativa subsp. japonica WOX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000987906 Ostreococcus 'lucimarinus' Species 0.000 description 1
- 240000005373 Panax quinquefolius Species 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 108020005089 Plant RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000249899 Populus tomentosa Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000874833 Salvinia minima Species 0.000 description 1
- 241000195974 Selaginella Species 0.000 description 1
- 241000015737 Selaginella moellendorffii Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 101150004410 WOX12 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150072411 WOX6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150013974 WOX7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150031785 WUS gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000015709 bud dormancy process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000002856 computational phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000008124 floral development Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 235000002532 grape seed extract Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- PGNXLDQQCINNPZ-BURFUSLBSA-N n-methyl-n-[(2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl]undecanamide Chemical compound CCCCCCCCCCC(=O)N(C)C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO PGNXLDQQCINNPZ-BURFUSLBSA-N 0.000 description 1
- 235000012736 patent blue V Nutrition 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 230000014284 seed dormancy process Effects 0.000 description 1
- 230000011869 shoot development Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030118 somatic embryogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白的应用，属于生物技术领域。本发明将牡丹PoWOX11基因转化拟南芥后，通过表型对比发现牡丹PoWOX11基因可以推迟拟南芥的抽薹开花时间，同时影响其叶片发育，使对称轴上的叶片呈现对称性卷曲扭转；利用PoWOX11转基因拟南芥根部诱导愈伤组织，发现正常根部没有荧光，而只在形成愈伤组织的周围的根部处发现强烈的荧光表达，说明PoWOX11基因促进根诱导的愈伤组织形成。本发明以拟南芥为模式植物，通过探究PoWOX11基因在过表达拟南芥的各个组织中的表达特点，为牡丹建立完整的植株再生和遗传转化体系提供一定的理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白的应用。
背景技术
WOX(WUSCHEL-related homeobox)家族是真核生物体内的HB转录因子超家族，属于植物特有的转录因子，该家族成员含有保守的、可以被特定DNA序列识别并结合的同源结构域(Homeodomain，HD)，该结构域由60～66个氨基酸折叠成螺旋-转角-螺旋结构。Haecker等全面研究拟南芥基因组后，发现拟南芥的WOX基因家族共包含15条基因，可以分为3个分支：进化支/WUS支(WUS和WOX1-7)、中间支(WOX8-9和WOX11-12)和古老支(WOX10和WOX13-14)。除了在所有WOX家族成员中保守的HD外，拟南芥中的WOX转录因子还有四个主要的特异性基序，它们是WUS-box、EAR-like motif、STF-box和MAEWEST/WOX4-box。WUS/现代分支的成员在C末端附近有一个特定的WUS-box。在WUS、WOX5和WOX7同源物的C末端发现了一个EAR样基序，包括WUS和WOX5亚基序。MAEWEST/WOX4-box位于HD的N末端，仅存在于WOX1和WOX4同源物中，但其功能未知。STF-box仅在WOX1和WOX6同源物的C末端发现，并已被证明在叶片和花朵发育中具有STF(STENOFOLIA)抑制功能所必需。
WOX基因参与植物体胚建成和分生组织形成，与被认为具有胚胎发生能力的细胞特异性标记基因SERK、在促进细胞分裂中发挥作用的BBM、胚胎发生的主要调节因子和调控LEC基因家族其他成员(LEC2、FUS3和ABI3)激活的LEC1等一起形成植物体胚发育调控网络。WOX基因家族成员功能冗余，具有补偿性和特异性，处于调控网络途径的关键地位，在植物体胚发育调控网络中属于关键节点基因。
有研究表明：WOX家族成员功能广泛，在植物顶端分生组织的形成、干细胞的维持、侧生器官和花器官的形成、胚胎发育、激素信号转导以及抗逆代谢等多个过程中发挥作用，尤其对细胞增殖分化旺盛的区域具有重要的调控作用。在拟南芥中，WOX11和WOX12的功能互为冗余，参与不定根的发生和发育以及体外愈伤组织的形成，并在上游工作以激活AtWOX5和AtWOX7。现有技术已经报道了OsWOX11在水稻冠根发育中通过调节细胞分裂素信号传导的类似功能。OsWOX11还能控制根毛和根系发育，从而赋予抗旱性。BpWOX11基因诱导了与膨胀蛋白和细胞分裂途径相关的基因以促进桦树插条不定根形成。此外，转录因子WOX11的存在是OsYUCs(OsYUC3、OsYUC4、OsYUC8、OsYUC10、OsYUC11和OsYUC14)过表达诱导的冠根增殖所必需的。杨树WOX11/12a通过增强ROS清除来促进杨树的耐盐性，水稻中WOX11招募组蛋白H3K27me3去甲基化酶来促进水稻芽发育过程中相关基因表达。尽管WOX11已经在拟南芥、水稻和毛果杨中得到了广泛的研究，但在牡丹中的功能研究尚未见报道。
体细胞胚胎发生是植物离体再生的重要途径之一，是快速繁殖的有效途径，是未来牡丹组织培养的重点。目前牡丹中关于功能基因的研究主要集中在花叶颜色、花型、开花时间、抗逆性、采后、花芽休眠以及种子休眠几方面，而关于牡丹体胚功能相关基因的研究甚少。WOX基因家族处于植物体胚发育调控网络途径的关键地位，在植物体胚发育调控网络中属于关键节点基因。因此探究胚性基因WOX功能特性以及在整个体胚直接发生过程和过表达拟南芥的各个组织中的表达特点，对牡丹建立完整的植株再生和遗传转化体系具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明以拟南芥为模式植物，通过探究过PoWOX11基因在表达拟南芥的各个组织中的表达特点，为牡丹建立完整的植株再生和遗传转化体系提供一定的理论基础。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白在推迟拟南芥抽薹开花中的应用，所述牡丹PoWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述牡丹PoWOX11基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供一种推迟拟南芥抽薹开花的方法，包括将牡丹PoWOX11基因导入拟南芥中，获得稳定表达牡丹PoWOX11基因的转基因拟南芥植株，推迟所述转基因拟南芥植株的抽薹开花；所述牡丹PoWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明还提供一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白在调控拟南芥叶片形态中的应用，过表达牡丹PoWOX11基因使拟南芥叶片卷曲；
所述牡丹PoWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述牡丹PoWOX11基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步地，所述卷曲包括对称轴上的叶片呈现对称性卷曲扭转。
本发明还提供一种调控拟南芥叶片形态的方法，包括将牡丹PoWOX11基因导入拟南芥中，获得稳定表达牡丹PoWOX11基因的转基因拟南芥植株，使所述转基因拟南芥植株的叶片卷曲；所述牡丹PoWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，所述卷曲包括对称轴上的叶片呈现对称性卷曲扭转。
本发明还提供一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白在调控拟南芥体细胞胚胎发生中的应用，过表达牡丹PoWOX11基因促进拟南芥根部愈伤组织的形成；
所述牡丹PoWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述牡丹PoWOX11基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示
本发明还提供一种调控拟南芥体细胞胚胎发生的方法，包括在拟南芥中过表达牡丹PoWOX11基因，促进所述拟南芥根部愈伤组织的形成；
所述牡丹PoWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述牡丹PoWOX11基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明公开了以下技术效果：
本发明从栽培牡丹‘凤丹’中克隆出牡丹PoWOX11基因，对其序列和系统进化树进行分析，确定其属于WOX基因家族的古老支分支。将其转化拟南芥后，通过表型对比发现牡丹PoWOX11基因可以推迟拟南芥的抽薹开花时间，同时影响其叶片发育，使对称轴上的叶片呈现对称性卷曲扭转；利用PoWOX11转基因拟南芥根部诱导愈伤组织，发现正常根部没有荧光，而只在形成愈伤组织的周围的根部处发现强烈的荧光表达，说明PoWOX11基因促进根诱导的愈伤组织形成。本发明以拟南芥为模式植物，通过探究PoWOX11基因在过表达拟南芥的各个组织中的表达特点，为牡丹建立完整的植株再生和遗传转化体系提供一定的理论基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为牡丹PoWOX11基因的PCR电泳图；
图2为植物中WOX基因的系统发育进化树，其中PoWOX11用红色五角星突出标记，AC-WOX用墨绿色阴影突出显示，IC-WOX用浅蓝色阴影突出显示，WC-WOX用橙黄色阴影突出显示；
图3为6个物种中WOX11蛋白的多序列比对图和序列标识图；
图4为PoWOX11过表达的拟南芥生长表型，其中WT为野生型拟南芥PoWOX11为转基因过表达拟南芥；
图5为显微镜下观察PoWOX11基因在转基因拟南芥中根部的融合表达情况，其中a图中的标尺为100μm，b图中的标尺为200μm，a和b中从左到右依次分别为明场、绿色荧光蛋白(GFP)以及明场GFP合并，绿色荧光显示PoWOX11融合蛋白表达位置；
图6为PoWOX11基因在转基因拟南芥中不同部位的表达情况。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例
一、实验方法
1.材料
选用栽培牡丹‘凤丹’(Paeonia ostii)为材料，种子购自山东菏泽牡丹苗圃。挑选圆润饱满有光泽的‘凤丹’种子室温清水中浸泡2～3天，剥去表皮，以流水冲洗2h，75％酒精灭菌30s，无菌水洗涤3～5次，2％次氯酸钠溶液20min灭菌，无菌水洗涤3～5次，吸干表面水分，剥取种胚，置于牡丹体胚诱导培养基中进行体胚诱导培养，用于后续基因克隆以及其在拟南芥中过表达的功能研究。所用转基因材料为哥伦比亚野生型(Col-0)拟南芥，在人工气候室的花盆中培养，光/暗周期为16h/8h，温度为24±1℃，相对湿度约为60～70％。
2.方法
2.1总RNA与cDNA合成
通过快速通用植物RNA提取试剂盒(Quick RNAIsolation Kit，华越洋，中国)，以无菌牡丹组培苗为材料进行RNA提取，分光光度计测定RNA浓度，1％琼脂糖凝胶电泳确定RNA条带完整性后将RNA保存于-80℃超低温冰箱备用。以提取的RNA为模板，参照反转录试剂盒reverse transcription system(A3500，Promega)的步骤进行反转录合成cDNA第一条链。
2.2牡丹PoWOX11基因克隆
根据引物设计原理利用SnapGene(V2.3.2)软件设计引物(表1中的SEQ ID NO.1～2)，以cDNA为模板，通过LATaq kit的高保真酶(TaKaRa，Kusatsu，Japan)进行目的序列的扩增，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带与marker序列对应长度一致时说明获得目标序列，克隆得到牡丹PoWOX11基因的CDS序列。紫外切胶台上进行切胶，参照DNA纯化回收试剂盒(Tiangen，Beijing，China)步骤对产物进行回收。将胶回收产物使用pMD19-T VectorCloning Kit(TaKaRa，Kyoto，Japan)试剂盒连接克隆载体，连接体系连接半小时以上，用作转化。取大肠杆菌DH5α感受态细胞，按照pMD19-TVector Cloning Kit(TaKaRa，Kusatsu，Japan)试剂盒步骤进行转化，后在含AMP氨苄的LB固体琼脂培养基上均匀涂板，37℃倒置培养12-16h挑选单克隆进行菌落PCR，将阳性单克隆摇菌，使用TIANGEN天根公司质粒小提试剂盒(TIAN prep Mini PlasmidKit，DP103-03，Beijing，China)提取质粒并取10μL质粒溶液送安升达(Anshengda，Beijing，China)公司测序，验证得到正确的目标序列。
表1引物序列
2.3生物信息学分析
使用ProtParam(ExPASy-ProtParam tool)对牡丹PoWOX11序列进行基本理化性质分析。使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html)分析PoWOX11蛋白的二级结构。使用Plant-mPLoc(Plant-mPLoc server(sjtu.edu.cn))预测PoWOX11蛋白的亚细胞定位。
通过同源搜索从Ensembl Plants(Ensembl Plants)、Plant TranscriptionFactor Database(PlantTFDB，PlantTFDB-Plant Transcription Factor Database@CBI,PKU(gao-lab.org))和NCBI(National Center for Biotechnology Information(nih.gov))公开数据库搜索得到拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、核桃(Juglans regia)、葡萄(Vitis vinifera)、毛果杨(Populus trichocarpa)、无油樟(Amborella trichopoda)、可可树(Theobroma cacao)、挪威云杉(Picea abies)、江南卷柏(Selaginella moellendorffii)、水蕨(Ceratopteris richardii)、银杏(Ginkgo biloba)和绿藻(Ostreococcus lucimarinus)的WOX蛋白序列，采用Clustal W进行多序列比对，采用MEGA 11软件用邻接法(Neighbor-joining method)和1000次bootstrap重复，其他参数为默认设置，对所获得的所有物种的WOX蛋白序列和牡丹PoWOX11蛋白序列一起构建系统进化树。基于完整的WOX氨基酸序列根据系统进化树分支结果，为牡丹WOX目标基因命名。
用DNAMAN软件对拟南芥、水稻、核桃、葡萄、毛果杨和牡丹的WOX4蛋白的氨基酸序列进行多序列比对分析。在线网站WEBLOGO(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)用于绘制序列标识图。
2.4牡丹PoWOX11基因转拟南芥功能验证
将PoWOX11基因克隆到植物表达载体pBI121中，通过农杆菌介导花序侵染法获得稳定遗传的35S::PoWOX11过表达转基因拟南芥植株。将T3代过表达转基因拟南芥和野生型对照置于相同的培养条件下种植培养。
2.5荧光定量分析
取T3代转PoWOX11基因拟南芥的根(root)、茎(stem)、叶(leaf)、花(flower)和果实(fruit)各部位组织，提取RNA后进行cDNA第1链的反转录，ddH2O稀释10倍后作为模板，采用表1中的引物(SEQ ID NO.3～6)，使用TB Green Premix Ex TaqⅡ荧光定量试剂盒(TliRNaseH Plus，TaKaRa)，在QTOWER实时荧光定量PCR仪(analytikjena，Germany)上完成反应。PCR反应体系为TB Green Premix Ex Taq 5μL；Template 1μL；Primer(F+R)0.4μL；ddH2O补足至10μL，共设置3个生物学重复，反应条件为95℃预变性90s；95℃变性5s，60℃解链30s，40个循环；溶解曲线60到95℃，每15s升温1℃。以AtActin为内参基因，以拟南芥根组织的表达量为对照组，相对表达量采用2-ΔΔCT法计算，分析PoWOX11在各部分组织的相对表达量。
二、结果与分析
1.牡丹PoWOX11基因克隆与序列分析
克隆得到长度符合预期的牡丹PoWOX11核苷酸序列见图1，其CDS序列长度为768bp。测序结果表明，牡丹PoWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
SEQ ID NO.7：
ATGGAAGATCATGACCCTAACAGTCCAAGGCATGGATCAGAGAGAAATGAGCCTGTTAGATCAAGGTGGACTCCAAAGCCAGAGCAAATCTTGATACTCGAGTCCATTTTCAATAGTGGAATGGTAAATCCTCCAAAAGATGAAACGGTGAGGATAAGGAAGCTACTTGAGAAATTTGGTTCAGTTGGGGATGCAAATGTCTTCTACTGGTTTCAAAACCGGCGGTCAAGATCTCGCCGCCGGCAACGCCAGATTCAAGCAAGTCTTGTGGGAGAGAAGTCTACTGATCATCATCACCTGGCACAACAACTCACTGATGGTGGCGGTGCAATTCAATATCAAACTAGTTTCGCCTGTACAGGCAGCTTCTCCCCTTCTCCCACTTTCACTCTCTCTCCATCTTCTTGTCTTGCTGGTTCCTCTTCTTCTTCATCTGGAGTTAATATGGGCGAAGATGGGGTTAATGATTTCTTCTCCATCTCTAATCAAATGGGTCTTCCGGATATGGAGCATAGCTCGGCTATAACATCAATTTTGTGCCCTTCAGATACTTCAAATGTGCACTACCAATCTGGATTCATCACAGTGTTCATTAATGGGGTTGCAACAGAGGTTCCAAGGGGGGCCCTTGACATGAAAGCAATGTTTGGTCAAGATTTCGTGTTGGTTCATTCCTCTGGAATGCCAGTCCCATTCAATGAATATGGTTTTACAATGCAAAGCTTGCAGCATGGTGAAAGCTATTTCCTAGTTTCAAGAACCACTTAA。
分析牡丹PoWOX11基因的基本理化性质，其开放阅读框为765bp，编码255个氨基酸，相对分子质量约为28.17kDa，理论等电点为6.13，不稳定系数II为67.96，总平均亲水性为-0.46，脂肪系数为61.88，推测此蛋白属于不稳定亲水性蛋白。牡丹PoWOX11的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
SEQ ID NO.8：
MEDHDPNSPRHGSERNEPVRSRWTPKPEQILILESIFNSGMVNPPKDETVRIRKLLEKFGSVGDANVFYWFQNRRSRSRRRQRQIQASLVGEKSTDHHHLAQQLTDGGGAIQYQTSFACTGSFSPSPTFTLSPSSCLAGSSSSSSGVNMGEDGVNDFFSISNQMGLPDMEHSSAITSILCPSDTSNVHYQSGFITVFINGVATEVPRGALDMKAMFGQDFVLVHSSGMPVPFNEYGFTMQSLQHGESYFLVSRTT。
对牡丹PoWOX4蛋白进行亚细胞定位预测发现其定位在细胞核。通过SOPMA分析牡丹PoWOX11蛋白的二级结构，结果发现牡丹PoWOX11蛋白的二级结构由20.11％α-螺旋、15.76％β-折叠、9.24％延伸链和54.89％无规则卷曲组成。
2.牡丹PoWOX11蛋白的系统进化树分析
为进一步了解牡丹PoWOX11基因家族的进化关系，将PoWOX11基因与来自12个物种共108条序列进行多序列比对并构建进化树(图2)。采用MEGA 11通过NJ法对WOX蛋白的全长序列进行进化分析，来自13个物种共109条WOX序列被分为3支：现代支(WC-WOX)、中间支(IC-WOX)和古老支(AC-WOX)，根据进化关系将牡丹WOX蛋白确定为PoWOX11。其中，PoWOX11在古老支分支，与葡萄的亲缘关系较近。
3.牡丹PoWOX11蛋白的多序列比对和保守结构域分析
选择模式物种拟南芥、水稻以及亲缘关系较近的核桃、葡萄和毛果杨等6个物种中相同亚支的WOX11共7条蛋白序列进行多序列比对分析，发现牡丹PoWOX11蛋白也包含同源异形结构域HD且高度保守。同源结构域比对结果表明，HD同源结构域中的高度保守的残基位点很多，其中VGDANVFYWFQNRRSRSRRR(SEQ ID NO.9)残基位点连续高度保守，其中深蓝色表示的氨基酸序列相似度为100％，粉红色表示的氨基酸序列相似度≥75％，天蓝色表示的氨基酸序列相似度≥50％(图3)。
4.PoWOX11基因过表达拟南芥的表型分析
4.1PoWOX11转基因拟南芥的表型
在拟南芥上开展了PoWOX11的异源表达与表型分析。在转基因拟南芥的表型观察过程中发现在相同的培养条件下，第28天时，野生型拟南芥株系已经抽薹开花，但PoWOX11转基因株系未见抽薹开花，且PoWOX11转基因株系叶片较野生型拟南芥更为卷曲，如图4所示，由图4可以看出红色三角形标识出的拟南芥叶片表型最明显，在对称轴上的叶片呈现对称性卷曲扭转，说明PoWOX11可能与叶片发育相关。
4.2PoWOX11转基因拟南芥的荧光观察
为了解基因在愈伤组织诱导中的作用，在显微镜下观察PoWOX11在转基因拟南芥根诱导的愈伤组织中的发光情况，发现正常根部没有荧光，而只在形成愈伤组织的周围的根部处发现强烈的荧光表达(图5)，说明PoWOX11在根诱导的愈伤组织形成过程中发挥重要的作用，促进拟南芥根诱导的愈伤组织形成。
5.表达模式分析
采用RT-qPCR的方法对转基因拟南芥中PoWOX11基因在拟南芥各部位组织(根、茎、叶、花和果实)的表达量进行分析(图6)，结果显示，PoWOX11在茎和叶中高表达，在根中有一定表达量，在花中有极低表达量，在果实中几乎不表达。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白在推迟拟南芥抽薹开花中的应用，其特征在于，所述牡丹PoWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述牡丹PoWOX11基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.一种推迟拟南芥抽薹开花的方法，其特征在于，包括将牡丹PoWOX11基因导入拟南芥中，获得稳定表达牡丹PoWOX11基因的转基因拟南芥植株，推迟所述转基因拟南芥植株的抽薹开花；所述牡丹PoWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白在调控拟南芥叶片形态中的应用，其特征在于，过表达牡丹PoWOX11基因使拟南芥叶片卷曲；
所述牡丹PoWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述牡丹PoWOX11基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述卷曲包括对称轴上的叶片呈现对称性卷曲扭转。
5.一种调控拟南芥叶片形态的方法，其特征在于，包括将牡丹PoWOX11基因导入拟南芥中，获得稳定表达牡丹PoWOX11基因的转基因拟南芥植株，使所述转基因拟南芥植株的叶片卷曲；所述牡丹PoWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述卷曲包括对称轴上的叶片呈现对称性卷曲扭转。
7.一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白在调控拟南芥体细胞胚胎发生中的应用，其特征在于，过表达牡丹PoWOX11基因促进拟南芥根部愈伤组织的形成；
所述牡丹PoWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述牡丹PoWOX11基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
8.一种调控拟南芥体细胞胚胎发生的方法，其特征在于，包括在拟南芥中过表达牡丹PoWOX11基因，促进所述拟南芥根部愈伤组织的形成；
所述牡丹PoWOX11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述牡丹PoWOX11基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410140081.9A CN117843746B (zh) | 2024-02-01 | 2024-02-01 | 一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410140081.9A CN117843746B (zh) | 2024-02-01 | 2024-02-01 | 一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117843746A true CN117843746A (zh) | 2024-04-09 |
| CN117843746B CN117843746B (zh) | 2024-06-07 |
Family
ID=90540121
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410140081.9A Active CN117843746B (zh) | 2024-02-01 | 2024-02-01 | 一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117843746B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114457094A (zh) * | 2022-03-08 | 2022-05-10 | 国际竹藤中心 | 一种牡丹PoAGL15基因及其氨基酸序列和应用 |
-
2024
- 2024-02-01 CN CN202410140081.9A patent/CN117843746B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114457094A (zh) * | 2022-03-08 | 2022-05-10 | 国际竹藤中心 | 一种牡丹PoAGL15基因及其氨基酸序列和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MENGSI XIA: "A Preliminary Investigation on the Functional Validation and Interactions of PoWOX Genes in Peony (Paeonia ostii)", HORTICULTURAE, vol. 8, no. 266, 20 March 2022 (2022-03-20), pages 1 - 22 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117843746B (zh) | 2024-06-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chatthai et al. | The isolation of a novel metallothionein-related cDNA expressed in somatic and zygotic embryos of Douglas-fir: regulation by ABA, osmoticum, and metal ions | |
| US11732270B2 (en) | Compositions and methods for manipulating the development of plants | |
| Terrier et al. | Generation of ESTs from grape berry at various developmental stages | |
| CN116284300B (zh) | 一种增强马铃薯抗旱性的扩展蛋白基因StEXLB1及其应用 | |
| CN106868018B (zh) | 白桦BpSPL9基因及其编码蛋白和应用 | |
| CN113717983A (zh) | 龙眼基因DlGRAS34、蛋白及其在调控植株开花中的应用 | |
| Xin et al. | Overexpression of the Ginkgo biloba WD40 gene GbLWD1-like improves salt tolerance in transgenic Populus | |
| Saravanan et al. | Genetic engineering of sugarcane for drought and salt tolerant transgenic plants expressing the BcZAT12 gene | |
| CN112592393B (zh) | 水稻早衰控制基因es1-3及其应用 | |
| CN117417957A (zh) | 一种增加水稻香味的方法 | |
| CN116769000A (zh) | 转录因子SmMYB13在提高植物耐旱性中的应用 | |
| ES2364932B1 (es) | Alteración en la expresión de la proteína della u ortóloga para alterar el patrón de crecimiento de las plantas y el contenido de metabolitos del fruto. | |
| CN108823220B (zh) | 一种苹果中蜡质合成相关基因MdCER1的克隆及其应用 | |
| CN114426975B (zh) | 番茄谷氧还蛋白SlGRXC9基因及应用 | |
| CN117843746B (zh) | 一种牡丹PoWOX11基因及其编码蛋白的应用 | |
| CN117946234B (zh) | 一种牡丹PoWOX4基因及其编码蛋白的应用 | |
| Liu et al. | Identification and expression analysis of PeWOX5 and PeWOX13 genes in hybrid poplar | |
| KR100827348B1 (ko) | 비생물적 스트레스 내성 유도 고추 유전자 ＣａＡＢＳ1 | |
| CN117946234A (zh) | 一种牡丹PoWOX4基因及其编码蛋白的应用 | |
| US9267146B2 (en) | Increasing cell wall deposition and biomass density in plants | |
| CN118086322A (zh) | 一种牡丹PoWOX1基因和其编码蛋白的应用 | |
| Zheng et al. | Construction and characterization of a cDNA library from floral organs and fruitlets of Citrus reticulata | |
| KR100588713B1 (ko) | 열매 및 종자 발달 조절용 유전자 | |
| CN112831509B (zh) | 番茄SlOST1基因及应用 | |
| CN112239493B (zh) | 蜡梅CpWRI-L4基因及其编码的蛋白与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |