CN117417957A - 一种增加水稻香味的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物育种领域，具体涉及一种增加水稻香味的方法。本发明公开了一种高效的水稻香味基因的特定靶标，以及基于该靶标开发的增加水稻香味的方法。
Description
技术领域
本发明属于植物育种领域，具体涉及一种增加水稻香味的方法。
背景技术
在植物生物学中，香味是一个迷人而复杂的现象。它不仅赋予植物独特的特征，而且往往对人类和其他生物产生深远的影响。香味是水稻重要的食味品质性状，具有独特香味特性的稻米倍受消费者的欢迎，在主粮和食品加工上中具有非常重要的价值。水稻香味是由于编码甜菜醛脱氢酶的BADH2(betaine aldehyde dehydrogenase)基因序列8个碱基的缺失、3处碱基的变异和终止密码子的提前产生，导致甜菜醛脱氢酶基因BADH2原有功能丧失，从而使甜菜醛脱氢酶的作用底物2-乙酰基-1-吡咯啉的代谢途径中断，香味物质2-乙酰基-1-吡咯啉不断积累，致使水稻的叶片和籽粒产生香味(Louis M.T.Bradbury；TimothyL.Fitzgerald；Robert J.Henry；Qingsheng Jin；Daniel L.E.Waters.The gene forfragrance in rice.Plant Biotechnology Journal,2005,3(3):363-370)。
水稻传统育种方法效率低下，且存在一定的不可预见性，使得香味水稻育种进展缓慢，虽然分子标记技术，减少了育种家在筛选中所花费的时间，但仍然具有庞大的工作量。而基因编辑技术的兴起，为这一领域带来了新的突破口。CRISPR/Cas9基因编辑技术在各种作物育种中应用很广泛，它可以定向修饰和改造与香味相关的基因，并且周期短、效率高，能有效地弥补传统育种的不足。
因此，通过基因编辑技术编辑BADH2基因可以获得具有香味的水稻，是非常有应用价值的。然而，BADH2基因非常长，可以进行编辑的靶标也非常多，究竟哪个靶标既具有较高的编辑效率，又能获得香味物质增加更多的水稻材料，还能保证水稻的其他农艺性状不发生变化，这依然是不清楚的。
发明内容
为解决上述问题，本发明通过生物信息预测筛选出22个靶标，连同其他公开资料中已经公开的靶标一起进行了测试。通过编辑效率、香味增加程度等指标综合评估了各靶标的表现，获得了一个编辑效率和香味增加程度均较高的靶标。
具体来说，本发明涉及以下几方面内容：
本发明提供一种增加水稻香味的方法，其特征在于，使用基因编辑方法编辑水稻BADH2基因；其中，基因编辑选取的靶标序列为
TGATGAAGCAGCATGGGACA。
在一些实施方案中，上述使用的编辑方法为CRISPR/Cas9技术。
本发明还提供一种用于增加水稻香味的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：
(1)能够识别上述靶标序列的gRNA分子；
(2)编码(1)所述gRNA的DNA分子；
(3)表达(1)所述gRNA的载体。
在一些实施方案中，上述的gRNA分子的序列为
UGAUGAAGCAGCAUGGGACAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccg uuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu。
本发明还提供一种突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.7任意一个所示。
本发明还提供一种突变蛋白，其特征在于：所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.8～SEQ ID NO.10任意一个所示。
本发明还提供上述的方法，试剂盒，突变基因，突变蛋白在增加水稻香味中的应用。
本发明的有益效果在于：BADH2基因非常长，可以进行编辑的靶标也非常多，究竟哪个靶标既具有较高的编辑效率，又能获得香味物质增加更多的水稻材料，还能保证水稻的其他农艺性状不发生变化，这依然是不清楚的。本发明通过生物信息预测筛选出23个靶标，连同其他公开资料中已经公开的，共36个靶标一起进行了测试。通过编辑效率、香味增加程度等指标综合评估了各靶标的表现，获得了一个编辑效率和香味增加程度均较高的靶标。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
在本发明中，以下定义和方法可以更好地定义本发明和指导本领域的普通技术人员实施本发明，除非另作说明，根据本领域普通技术人员的常规的用法来理解术语。
所述“水稻”是指亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)，并且包括可以与水稻交配的所有植物品种，包括野生水稻种。
术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的DNA分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。
术语“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列前的调节序列(5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。所述基因编辑载体采用转化方法被引入到植物中，所述转化方法包括但不限于，农杆菌(Agrobacterium)介导转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。
所述农杆菌介导转化法是植物转化的常用方法。将要引入到植物中的外源DNA克隆到载体的左和右边界共有序列之间，即T-DNA区。所述载体被转化到农杆菌细胞中，随后，所述农杆菌细胞用于感染植物组织，包含外源DNA的载体的所述T-DNA区被插入到植物基因组中。转化后，必须从转化的植物组织再生转基因植物，并且利用适合的标记选择具有外源DNA的后代。
术语“引物”是一段分离的核酸分子，其通过核酸杂交，退火结合到互补的目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下，沿目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其他常规的核酸扩增方法。引物的长度一般是11个多核苷酸或更多，优选的是18个多核苷酸或更多，更优选的是24个多核苷酸或更多，最优选的是30个多核苷酸或更多。这种引物在高度严格杂交条件下与目标序列特异性地杂交。尽管不同于目标DNA序列且对目标DNA序列保持杂交能力的引物是可以通过常规方法设计出来的，但是，优选的，本发明中的引物与目标序列的连续核酸具有完全的DNA序列同一性。
在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。
除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。
在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas ofProtein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用诸如32P的可检测基团或其它可检测标志物来标记。因而，例如，可以通过标记基于实施方案序列的合成寡核苷酸制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA及基因组文库的方法通常为本领域已知。可以在严紧条件下进行所述序列的杂交。如本文所用，术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”表示如下条件，即在该条件下，相对于与其它序列杂交，探针将以可检测的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)与其靶序列杂交。严紧条件是序列依赖性的并且在不同环境中有所不同。通过控制杂交严紧性和/或控制清洗条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探针法)。可选择地，可以调节严紧条件，以允许一些序列错配，以便检测较低的相似度(异源探针法)。通常，探针长度少于约1000或500个核苷酸。通常，严紧条件是如下的条件，即在该条件中，盐浓度为pH 7.0至8.3下，少于约1.5M Na离子，通常约0.01M至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度条件为：当用于短探针时(例如10到50个核苷酸)，至少约30℃；当用于长探针时(例如大于50个核苷酸)，至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺缓冲液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)杂交，50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中清洗。示例性的中度严紧条件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中清洗。示例性的高严紧条件包括37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，60℃至65℃下在0.1×SSC中最后清洗至少约20分钟。任选地，清洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4小时至约12小时。特异性通常依赖杂交后的清洗，关键因素在于最后清洗溶液的离子强度和温度。DNA-DNA杂合体的Tm(热力学熔点)可以近似自Meinkoth andWahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的公式：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一价阳离子的克分子浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“甲酰胺％”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而L是杂合体的碱基对长度。Tm是(确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。每1％的错配对应使Tm降低约1℃；因而，可以调节Tm、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以将Tm降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和pH下的特异序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述Tm低4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述Tm低6℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述Tm低11℃下进行杂交和/或清洗。
除非另外指明，本说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、反应条件等的所有数字应被理解为在所有情况下用术语“约”来修饰。如本文所使用的术语“约”，当指代可测量的值例如质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量时，意味着涵盖在一些实施例中与规定量相比±20％的变化、在一些实施例中与规定量相比±10％的变化、在一些实施例中与规定量相比±5％的变化、在一些实施例中与规定量相比±1％的变化、在一些实施例中与规定量相比±0.5％的变化、以及在一些实施例中与规定量相比±0.1％的变化，因为此类变化适合于执行所披露的方法和/或使用所披露的组合物、核酸、多肽等。因此，除非相反地指出，在本说明书和所附权利要求书中所列出的数值参数是可以取决于试图通过本申请披露的主题获得的期望特性而变化的近似值。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:alaboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1基因编辑香味水稻的创制
一、靶标设计
本实施例中利用Cas9和靶向水稻BADH2基因(LOC号Os08g0424500)每个外显子和前后20个碱基的内含子作为靶区域，在CRISPR/Cas9(http://www.rgenome.net/cas-designer)网站进行靶标的设计，选取所有同源分数大于66％且错配为0的靶标，挑选结果如表1所示(1～23)。此外，还收集了已公开文献中水稻BADH2的编辑靶标进行比较，表1(24～36)。
表1水稻BADH2基因上的靶标设计
二、基因编辑载体构建
本实施例中利用Cas9和靶向水稻BADH2基因的sgRNA在GR913(黄两优913的恢复系)中针对BDHA2基因的进行编辑，具体操作方法可按照本领域常规的方式进行，主要包括以下几步：
1.PCR扩增
2.酶切链接
3.转化及PCR鉴定
4.获得质粒。
三、籼稻品种的遗传转化：
基因编辑必须通过将基因编辑载体转化入细胞内表达后才能实现，利用农杆菌介导方法，以籼稻GR913健康成熟种子为外植体，因编辑载体pYL-HU-fgr-GR913转化入细胞对OsBadh2基因的DNA序列进行精准修改，具体操作流程如下：
1)诱导水稻愈伤组织：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，放入100ml无菌烧杯中，倒入70％酒精(15ml)消毒2min；倒去酒精，加入100ml 30％次氯酸钠(NaClO)溶液，浸泡30min；倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30min。将种子放在无菌滤纸上吸干，置入成熟胚诱导培养基中，每皿20-30颗；操作完毕用封口膜(MicroporeTM Surgical Tape)封好培养皿，在28℃光照培养箱培养。在暗培养条件下诱导愈伤组织，需要7～10天；在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织(淡黄色，致密呈球状)，置入继代培养基中，在28℃暗培养1周继代。
2)农杆菌培养：挑取转化有目的表达载体的农杆菌单克隆于15ml YEP培养液中(含相应的抗生素)，28℃，250rpm振荡培养12～16h至菌液OD600为0.8-1.0。
3)共培养和抗性愈伤组织的选择：将培养好的菌液于室温下，4000rpm离心10min，去上清。将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液，水平摇床上80rpm共培养30min；将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40min；将愈伤组织置于有一张无菌滤纸的共培养基上，25℃暗培养3天。
4)选择培养：愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停振荡。再用含300mg/L羧苄青霉素钠(Carb)的无菌水清洗2遍，每次在水平摇床上摇晃30min，最后置于无菌滤纸上沥干2小时。将晾干的愈伤转入含300mg/L羧苄青霉素钠(Carb)和相应筛选压力的选择培养基上，28℃暗培养14天，共进行两轮选择，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。
5)抗性愈伤组织的诱导分化和生根：挑取从不同愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤3-5颗，移入装有分化培养基的塑料广口瓶中，用封口膜封好，放入恒温(25℃)培养室中(16h/8h)，等待分化成苗(约40天)。待苗长至3cm左右，用剪刀从苗基部剪去老根和愈伤组织，放入生根培养基中壮苗(约1周)。
6)炼苗移栽：将苗根部和茎叶分化完好的试管挑出，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水(防止培养基长菌)，炼苗2～3天，然后洗去琼脂，移栽苗到温室土钵中，待植株生长至3页是，取少量叶片提取DNA进行转基因鉴定和基因编辑分析检测转基因植株阳性。检测引物对为F：GATGATCGCCAAGTCCGAGC-3；R：CTTGATGATGAGGTCCTTCTTG。用1.5％琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，20分钟，目标条带为533bp左右的Cas9核酸片段，含有该片段的为阳性植株。
PCR体系：
PCR程序：
四、不同gRNA的编辑效率
对所有阳性事件的靶标片段进行扩增测序，比对原始序列计算不同靶标的编辑效率。根据序列扩增条带和测序结果确定靶标区域是否被编辑，统计不同靶标所获得的编辑植株数。
不同gRNA的编辑效率如表2所示。
表2不同gRNA的编辑效率
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由结果可以看出，以2号靶点“TGATGAAGCAGCATGGGACA”进行编辑获得的突变植株最多，收种数最多。
实施例2靶标2的编辑形式分析
对2号靶点编辑可结实的12个突变植株的编辑情况进行深度测序分析，如表3所示。结果显示，12个材料里有4个材料为纯合材料，纯合率为33.33％。
表3突变材料靶标测序结果
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“-”表示缺失，黑体表示插入
实施例3水稻靶标性香味物质的检测
水稻香味基因为隐形遗传，只有纯合的植株才可能表现出香味，因此只选取纯合株系的种子进行香味物质检测，并以GR913为对照，采取顶空吸附结合气相质谱色谱仪(GC-MS)的方法定量分析：
顶空固相微萃取法：将水稻籽粒脱壳，磨成粉状，称1g于50ml萃取瓶中，依次加入1mL超纯水和5μl浓度为2mg/L的三甲氧苄氨嘧啶(TMP)内标(溶剂为无水乙醇)，放入60℃的水浴锅中，平衡15min。将事先已在250℃进样口老化30min的极性纤维萃取头插至液面顶部1cm处，萃取30min。结束后抽回萃取头，立即插入GC-MS进行分析。
分析条件：萃取头在进样口解析5min，氦气1ml/min，进样口温度250℃，不分流进样；辅助温度235℃，离子源230，四级管150℃；初始温度40℃，保持2min后以2.3℃/min升至80℃，再以30℃/min升至235℃，保持5min。电离能量70eV，SIS模式，2-AP定量离子为111、83、TMP定量离子为121、79。
定量分析：根据标准物质出峰时间及响应值对水稻种子中2-乙酰1吡咯啉(2AP)进行定性分析，采用内标法进行定量分析，体根据标准物质出峰时间及响应值对水稻种子中2-乙酰1吡咯啉进行定性分析，采用内标法进行定量分析，计算公式为：2AP含量/(μg/kg)＝(A1/A2)×(M1/M2)×1000，其中：A1为待测物质峰面积；A2为内标物峰面积；M1为内标物质量/μg；M2为样品质量/g。
检测结果如表4所示，GR913-KO-9材料的的香味物质比受体对照显著增加。
表4不同材料的香味检测结果
由结果可以看出，通过第2个靶标对水稻BADH2进行编辑，在获得的材料中，水稻香味明显提高的占比为75％。
综上所述，利用CRISPR/Cas9技术，以“TGATGAAGCAGCATGGGACA”为靶标对水稻的BADH2基因进行编辑，可以高效率地获得具有香味的纯合编辑材料。能够识别上述靶标的gRNA序列为：UGAUGAAGCAGCAUGGGACAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccg uuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu
GR913-KO-5、GR913-KO-9、GR913-KO-11的编辑后突变基因序列分别如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.3所示；翻译的氨基酸序列如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种增加水稻香味的方法，其特征在于，使用基因编辑方法编辑水稻BADH2基因；
其中，基因编辑选取的靶标序列为TGATGAAGCAGCATGGGACA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用的基因编辑方法为CRISPR/Cas9技术。
3.一种用于增加水稻香味的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：
(1)能够识别权利要求1中所述靶标序列的gRNA分子；
(2)编码(1)所述gRNA的DNA分子；
(3)表达(1)所述gRNA的载体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的gRNA分子的序列为UGAUGAAGCAGCAUGGGACAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccg uuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu。
5.一种突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3任意一个所示。
6.一种突变蛋白，其特征在于：所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4～SEQ IDNO.6任意一个所示。
7.权利要求1-2所述的方法，权利要求3-4所述的试剂盒，权利要求5所述的突变基因，权利要求6所述的突变蛋白在增加水稻香味中的应用。
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| CN202311374893.1A CN117417957A (zh) | 2023-10-23 | 2023-10-23 | 一种增加水稻香味的方法 |
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| CN117448481A (zh) * | 2023-10-23 | 2024-01-26 | 黄冈市农业科学院 | 一种核酸检测方法及其应用 |
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| CN110592135A (zh) * | 2019-09-23 | 2019-12-20 | 浙江省农业科学院 | 一种CRISPR/Cas9编辑水稻香味基因Badh2的方法 |
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