CN112239493B - 蜡梅CpWRI-L4基因及其编码的蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及蜡梅CpWRI‑L4基因及其编码的蛋白与应用。本发明克隆得到克隆得到蜡梅CpWRI‑L4基因序列，序列长度为1203bp，包含1038bp的完整开放阅读框。将构建好的过表达载体35S::CpWRI‑L4对拟南芥花序进行浸染，发现单株的抽葶时间、第一朵花开放时间和第一个果荚出现时间均提前于野生型拟南芥植株；但是各过表达拟南芥植株的莲座叶数量相对于WT植株显著减少，株高也有明显降低。对35S::CpWRI‑L4/Col‑0拟南芥不同植株开花途径相关的内源基因进行表达分析时，发现CpWRI‑L4在拟南芥中的异源表达使拟南芥的4个内源基因(FT、SOC1、AP1、LFY)上调。由此可以看出，该基因可以促进植物提前开花。

Description

蜡梅CpWRI-L4基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个蜡梅CpWRI-L4基因、其编码的蛋白和应用。

背景技术

蜡梅(C.praecox)，属于蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(ChimonanthusLindl.)，花香怡人，花色柔和淡雅，与山茶，水仙，白梅一起被称为“雪中四友”。

APETALA2/ETHYLENE-RESPONSIVE ELEMENT-BINDING FACTOR(AP2/ERF)基因家族是一个庞大的基因家族，几乎存在于所有的植物中，在植物生长发育过程中具有重要作用，该基因家族所有成员至少含有一个AP2/EREBP结构域(AP2 domain)。AP2/EREBP结构域是由60～70个氨基酸组成的具有1个两亲性的α-螺旋和三个β折叠结构组成的高度保守的DNA结合区。DNA结合区中有2个保守元件：一个是RAYD元件(RAYD element)，它是一段由42个左右的氨基酸组成的氨基酸序列，有可能参与蛋白与蛋白之间的作用；另一个是YRG元件(YRGelement)，它是一段由20个左右的氨基酸组成的高度保守氨基酸序列，已有研究证明YRG区参与同DNA的结合。

BasalANT亚组转录因子包括WRI1、WRI2、ADAP(WRI3)、WRI4等。相对于euANT亚组成员，basalANT亚组成员的蛋白序列中的前模体区域没有WLGFSLS，PKLEDFLG和TFGQR这3个保守序列的插入，并且basalANT亚组成员的前模体区域一般只有44-81aa，比euANT亚组的R1结构域上游序列的长度(127-307aa)要短。BasalANT类基因与euANT类基因密切相关，但当前对转录因子basalANT的研究主要集中在油脂积累和胚胎发育以及相对应的代谢调控网络。

AP2亚家族可以调控植株开花及参与花器官发育，花分生组织特征建立，参与调控种子整个生育期。WRI作为AP2亚家族的一员，也对植物的生长发育、花期调控等方面产生作用。过表达AtWRI1的拟南芥表现出不良的农艺性状，生长受阻，生物量减少，但AtWRI1的缺失也会导致种子发芽和幼苗的发育受损。WRI1可以通过调控植物种子中与油脂的积累与储存相关基因的表达来提高种子的油脂含量，为芽的发生提供润滑从而促进种子的萌芽。拟南芥WRI1影响种子萌发和幼苗形态建成时的糖代谢过程，突变后导致萌发和形态建成延迟，但可被培养基中添加的糖缓解。Lee等发现WRI3在根，新兴幼叶和花朵中表达，与野生型植物相比，WRI3基因敲除突变体品系的发芽效率更高，并且突变体幼苗的生长速度更快。超量表达PhWRIL1的矮牵牛植株严重矮化，幼苗生长受到抑制，PhWRIL1超量表达的转基因植株叶片外植体的愈伤组织和芽的诱导与生长明显减少。油菜中过量表达BnWRI1基因，在萌发的种子中可以显著增加叶绿素含量，增加种子油分含量和转基因品系中种子大小和重量。BnWRI1的过度表达导致糖酵解，脂肪酸合成，脂质组装和开花的基因FT上调从而促进BnWRI1过表达植株花期提前，但对油菜的生长没有明显的副作用。

Yamaguchi等比较早之前发现WRI1参与植物对环境压力和生物胁迫的响应过程。李丹丹对大豆植株进行ABA处理，GmWRI1基因表达量大幅上调，2h时出现表达高峰。分别利用不同浓度的葡萄糖溶液处理大豆植株，结果发现，GmWRI1基因受葡萄糖诱导上调表达，且一定浓度范围内，随葡萄糖浓度的升高，该基因响应增强。用10％NaCl处理时，GmWRI1基因表达量在处理2、24h时出现两次表达高峰，处理24h时发生强烈应答。在缺水状态下，与野生型植物相比，AtWRI3突变体的存活率较低，结果表明，AtWRI3对于响应缺水引起的胁迫是必要的。但当超量表达AtWRI3时，转基因拟南芥植株生长受到抑制，同时耐盐性增强。郝翠翠对花生转录因子AhWRI1基因的克隆与功能研究中，发现AhWRI1-1基因对高盐、低温、干旱三种非生物胁迫均有响应。其中，在高盐、低温胁迫下表达量明显上调，说明AhWRI1-1基因在高盐、低温两种非生物逆境胁迫下对花生抗逆性具有正调控作用；用ABA对花生幼苗处理后，AhWRI1-2基因表达量大幅上调，处理8h时出现表达高峰，为对照的11.3倍。由此推断，在ABA信号途径中，AhWRI1-2为正向调控因子，为参与胁迫途径的ABA依赖型转录因子。

WRI基因是该基因家族中的一员，因其被发现得比较晚，因此对它的研究还较少，蜡梅的WRI基因未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供蜡梅CpWRI-L4基因及其编码的蛋白与应用。

首先，本发明提供蜡梅CpWRI-L4蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的蜡梅CpWRI-L4蛋白的基因。

优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在调控花期中的用途。

在本发明一个实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物提前开花。

本发明还提供一种使植物提前开花的方法，其为将含有所述基因的载体转入所述植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。

本发明通过基因克隆得到蜡梅CpWRI-L4基因序列，序列长度为1203bp，包含1038bp的完整开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。

利用NCBI等在线工具对蜡梅CpWRI-L4蛋白的氨基酸序列进行结构域分析，发现其含有2个AP2/EREBP结构域，此为AP2/ERF基因家族特征。利用EditSeq和ProtParam等软件对蜡梅CpWRI-L4基因序列分析，确定该基因编码345个氨基酸，预测分子式为C₂₀₇₁H₃₁₈₃N₅₄₅O₅₉₂S₂₄，原子个数为5306。对CpWRI-L4蛋白进行亚细胞定位预测，表明其定位在细胞核内。利用SignalP在线软件预测，显示CpWRI-L4蛋白不具有信号肽序列。此外，用TMHMM工具分析表明CpWRI-L4蛋白不具有跨膜结构域。将CpWRI-L4蛋白序列与拟南芥、葡萄等物种的AP2亚族基因编码的蛋白进行氨基酸序列与结构分析，发现该蛋白与其他物种的basalANT组基因的蛋白的序列和结构都比较相似。接着将此蛋白与其他物种的AP2/ERF家族基因的蛋白质序列构建NJ进化树，结果表明克隆得到的蜡梅基因属于basalANT类，并且与拟南芥WRI-L4蛋白同源性最高。

利用qRT-PCR对CpWRI-L4在蜡梅幼苗的不同组织、进行非生物胁迫处理(高温、低温、高盐)的蜡梅幼苗、成年蜡梅不同时期的花芽进行表达特性分析。实验结果显示CpWRI-L4在蜡梅的生殖器官(花的外瓣、雌蕊、雄蕊和幼果)中高表达，而在营养器官(茎和叶)的表达量较低，由此猜想该基因参与了蜡梅生殖器官，如花和果的发育；在花原基形成阶段的蜡梅花芽中，CpWRI-L4基因表达量一直处于最高的水平，在低温累积打破休眠阶段过渡至露瓣阶段，CpWRI-L4基因表达量急剧下降。由此我们可以预测，CpWRI-L4参与了蜡梅花原基形成，与蜡梅花芽分化有关，同时也有可能在低温累积打破休眠阶段起作用；对蜡梅进行非生物胁迫时，发现CpWRI-L4在高温、低温环境条件下表达量显著下调，而在高盐环境条件下表达量显著上调。结果暗示着CpWRI-L4可能同时响应低温、高温及高盐等非生物胁迫。

将构建好的过表达载体转入农杆菌菌株GV3101并转化野生型拟南芥(Col-0)，然后对收取的T₀代拟南芥种子进行Hyg抗性筛选。通过对T₀代转基因植株DNA检测以及T₂代纯合体转基因阳性植株qPCR鉴定，最终获得蜡梅35S::CpWRI-L4/Col-0拟南芥株系5个，T₂代纯合体单株12个。提取T₂代转基因株系的总RNA，通过实时荧光定量PCR分析T₂代不同转基因拟南芥株系和野生型拟南芥中CpWRI-L4基因的表达情况，结果表明CpWRI-L4基因在各转基因拟南芥株系中均有表达，只是表达水平不同。CpWRI-L4基因在OE7-6中的相对表达水平最高，分别是OE9-5和OE10-12中的2倍和12倍左右，在野生型拟南芥中没有该基因的表达；选取OE7-6，OE9-5，OE10-12三个株系与野生型拟南芥进行表型观察，发现OE7-6，OE9-5，OE10-12单株的抽葶时间、第一朵花开放时间和第一个果荚出现时间均提前于野生型拟南芥植株；但是各过表达拟南芥植株的莲座叶数量相对于WT植株显著减少，株高也有明显降低。对35S::CpWRI-L4/Col-0拟南芥不同植株(OE7-6，OE9-5，OE10-12)开花途径相关的内源基因进行表达分析时，发现CpWRI-L4在拟南芥中的异源表达使拟南芥的4个内源基因(FT、SOC1、AP1、LFY)上调。由此可以，该基因可以促进植物提前开花。

附图说明

图1所示为蜡梅CpWRI-L4基因ORF框的克隆。

M(maker)：DNA分子量标准DL2000；1、2、3：cDNA为模板；CK：阴性对照。

图2所示为图3-8AP2/ERF家族基因的系统进化关系。

图3所示为蜡梅CpWRI-L4基因在蜡梅不同组织中的相对表达量。

图4所示为蜡梅CpWRI-L4基因在不同花发育时期的相对表达量。**表示P<0.01水平上差异显著。

图5所示为蜡梅CpWRI-L4基因在不同非生物胁迫下的相对表达量。a、b、c、d、e表示P＜0.05水平上差异显著。

图6所示为pCAMBIA1300-CpWRI-L4的双酶切验证。M：DNA分子量标准DL2000；1～2：pCAMBIA1300-CpWRI-L4质粒双酶切。

图7所示为pCAMBIA1300-CpWRI-L4转化农杆菌GV3101的PCR鉴定。M：DNA分子量标准DL2000；1～8：农杆菌菌液PCR检测。

图8所示为转基因拟南芥的HYG抗性筛选。A：转基因拟南芥T0代筛选；B：转基因拟南芥T2代纯合体。

图9所示为CpWRI-L4转基因拟南芥T0代PCR检测。M：DNA分子量标准DL2000；1～10：抗性株系；WT：野生型。

图10所示为35S::CpWRI-L4/拟南芥T₂代不同单株CpWRI-L4基因的相对表达分析。**表示P<0.01水平上差异显著。

图11所示为蜡梅35S::CpWRI-L4/Col-0转基因拟南芥T₂代植株营养生长时期内源基因的相对表达量。a、b、c、d表示P＜0.05水平上差异显著。

图12所示为蜡梅CpWRI-L4转基因拟南芥T₂代植株表型观察。A：抽葶约1cm时莲座叶数；B：开花时间情况(25d)；C：株高情况；D：下胚轴情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1蜡梅CpWRI-L4基因的克隆及分子特征分析

将从转录组获得的蜡梅CpWRI-L4基因进行序列分析设计特异引物，以蜡梅cDNA第一链为模板，扩增蜡梅CpWRI-L4基因，PCR反应引物序列如下：

采用CpWRI-L4特异引物进行PCR扩增，将蜡梅CpWRI-L4基因开放阅读框PCR扩增结果进行电泳检测，结果显示目的条带特异(如图1)。将PCR产物克隆到pMD19-T载体中，转化大肠杆菌，用CpWRI-L4-F(10μM)，CpWRI-L4-R(10μM)特异引物检测，将PCR检测为阳性的单克隆进行测序，序列如SEQ ID No.1所示。

用EditSeq和ProtParam在线分析结果表明：克隆得到的基因的开放阅读框长1038bp，编码345个氨基酸的蛋白质(SEQ ID No.2所示)，预测其分子式为C₁₆₈₈H₂₅₇₆N₄₉₂O₅₄₃S；原子个数为5306，等电点pI值为6.11；不稳定系数(instability index)为52.25，由此可以推测该蛋白是一个不稳定的蛋白。脂肪系数(Aliphatic index)为54.41，亲水性系数(Grand average of hydropathicity)为-0.966，由此可以推测该蛋白是一个亲水蛋白。PSORT在线软件对CpWRI-L4蛋白进行亚细胞定位预测，表明其定位在细胞核内。SignalP在线软件预测，显示CpWRI-L4蛋白不具有信号肽序列，此外TMHMM工具预测表明CpWRI-L4蛋白不具有跨膜结构域。

用拟南芥(A.thaliana)、油菜(Brassica napus)、莲(N.nucifera)、葡萄(V.vinifera)、无油樟(A.trichopoda)、栓皮栎(Q.suber)、橡胶树(H.brasiliensis)、榴莲(D.zibethinus)、茶(Camellia sinensis)、咖啡树(Coffea eugenioides)、油棕(E.guineensis)、棉花(Gossypium hirsutum)、巨桉(Eucalyptus grandis)等物种的AP2/ERF基因家族的蛋白质序列构建进化树，根据Kim等人描述的方法进行序列比对和进化关系分析。使用集成在MEGA5中的邻接法获得邻接树。结果表明克隆得到的蜡梅基因属于basalANT类(图2)，被命名为CpWRI-L4(C.praecox Wrinkled-Like 4)。

实施例2蜡梅CpWRI-L4基因的表达特性分析

供本试验的植物材料是‘素心’蜡梅(C.praecox‘Concolor’)。其中所用的茎、叶、果、各花器官材料均采自成年蜡梅植株，非生物胁迫处理的植物材料用的是长势大概一致的四叶期蜡梅幼苗。以上蜡梅植株均种植于西南大学校园内，均为常规管理。

根据市售试剂盒提取个样本的总RNA，并反转录成cDNA。

选用蜡梅的Actin与Tublin基因作为蜡梅CpWRI-L4基因qPCR分析的双内参基因，运用Primer Premier 5.0软件设计内参基因和目标基因CpWRI-L4的qPCR特异性引物，后送至北京六合华大基因科技股份有限公司合成，引物序列见表1。本研究中所有引物均由Primer Premier 5.0软件进行设计、北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

表1蜡梅实时荧光定量PCR引物

以反转录获得的蜡梅cDNA第一链为模板，对蜡梅CpWRI-L4基因在蜡梅不同组织及不同开花时期花器官中的表达情况进行qPCR分析。试验数据通过Bio-Rad Manager^TMSoftware(Version 1.1)软件进行分析，用2^-△△CT法获得目的基因的相对表达量。

(1)蜡梅CpWRI-L4在蜡梅不同组织中的表达特性分析

通过实时荧光定量PCR对蜡梅CpWRI-L4基因在蜡梅各器官组织中的表达特性分析，发现该基因在蜡梅的果中的表达量相对最高为3.35，在外瓣中的表达量也处于较高水平，达到了2.24，但在内瓣和中瓣均处于非常低的水平，分别为0.37和0.20。在蜡梅花的雄蕊中，CpWRI-L4的表达量为1.84，略低于在外瓣中的表达量，但高于在雌蕊的表达量。在蜡梅的茎和叶中，CpWRI-L4的表达量大致相当，均低于在雌蕊中的表达，但稍高于在内瓣和中瓣内的表达(图3)。

(2)蜡梅CpWRI-L4在蜡梅不同时期花朵中的表达特性分析

在蜡梅花器官原基形成的起始阶段(3月8日),CpWRI-L4基因表达量较低，但是其后的整个花器官原基阶段(4月2日-5月25日)，CpWRI-L4基因表达量一直处于较高水平，特别是到在4月2日，CpWRI-L4基因表达量显著上升，约为3月8日的3.4倍。在休眠阶段(6月5日-9月23日)，CpWRI-L4基因表达量先减后增，其中在9月5日跌至最低水平。在子房成熟阶段(10月1日-11月2日)以及低温累积阶段(11月9日-12月9日)，CpWRI-L4基因表达量相对于休眠阶段有些许上升，但是仍低于花原基形成阶段。在露瓣阶段(DP，12月24日)，始花阶段(IB，12月26日)、盛开阶段(OF，12月30日)，CpWRI-L4基因表达量均显著低于低温累积阶段，与休眠阶段大致相当(图4)。

(3)蜡梅CpWRI-L4在非生物胁迫下的表达特性分析

当蜡梅处于低温胁迫环境时(4℃)，CpWRI-L4的表达量显著下调，其中在低温胁迫1小时后表达量就显著下降，并且在第12小时后下降到最低水平，之后缓缓升高。在第24小时时，CpWRI-L4的表达量为相对于第12小时上升显著，但也显著低于0小时，约为0小时的一半。在高温环境下(42℃)，CpWRI-L4的表达量也发生了显著下调，在第24小时时降到最低值。但当蜡梅受到盐胁迫时，发现CpWRI-L4的表达量显著上调，在受到盐胁迫后的第12小时达到最大值，之后慢慢下降，但也显著高于0小时(图5)。

通过实时荧光定量PCR对蜡梅CpWRI-L4基因在蜡梅各器官组织中的表达特性分析，得出在不同器官组织中均有CpWRI-L4基因的表达，且存在着组织特异性。在生殖器官花和幼果中的表达量最高，而在营养器官茎和叶中的表达量比较低。由此可以猜测蜡梅CpWRI-L4基因主要参与了蜡梅生殖器官的发育过程。

CpWRI-L4作为AP2基因家族中的一员，在蜡梅花器官原基形成阶段，CpWRI-L4在花芽中表达量处于最高水平。在蜡梅休眠阶段，CpWRI-L4的表达量一直比较低。休眠阶段过后，CpWRI-L4基因表达量又慢慢升高直至低温累积阶段结束。在露瓣、始花以及盛开阶段，CpWRI-L4基因表达量显著低于低温累积阶段。由此我们可以预测，CpWRI-L4参与了蜡梅花原基形成过程，与蜡梅花芽分化有关。同时，它也可能在低温积累打破休眠过程中发挥一定的作用。

对蜡梅CpWRI-L4在非生物胁迫下的表达特性分析发现，当蜡梅受到高温、低温和盐胁迫时，CpWRI-L4的表达量均发生显著变化，其中在低温和高温环境下显著下调，在盐胁迫环境条件下显著上调。

实施例3蜡梅CpWRI-L4基因拟南芥遗传转化及功能分析

结合CpWRI-L4基因ORF框序列自身含有的限制性酶切位点及分布特点和所用的植物超表达载体pCAMBIA1300所含多克隆位点的特征，选择出最合适的酶KpnI和SalI，在原来特异引物上下游加入酶切位点及其相应的保护碱基，用于扩增携带适宜酶切位点的CpWRI-L4基因编码区并将其克隆到植物表达载体的多克隆位点上。引物名称及序列如下：

p-CpWRI-L4-F：

p-CpWRI-L4-R：

以实施例1中测序正确的菌液为模板，用加酶切位点(分别为KpnI及SalI)的特异引物来进行PCR扩增，将胶回收后的目的条带与克隆载体pMD19-T进行连接，通过PCR鉴定后的结果表明，克隆得到的条带与预期的条带大小相同约1200bp大小且条带比较特异。把PCR鉴定与测序结果均正确的阳性克隆菌液进行质粒提取，将提取的重组质粒pMD19-T/CpWRI-L4以及表达载体pCAMBIA1300用KpnI和SalI内切酶分别进行双酶切，分别回收所需要的目的条带并连接，转化大肠杆菌，对菌液进行PCR鉴定并送公司测序，提取测序结果正确的菌液的质粒进行双酶切验证，酶切验证切下的条带单一且与目的条带的大小一致，结果表明蜡梅CpWRI-L4基因植物表达载体已成功构建，并将其命名为pCAMBIA1300/CpWRI-L4(图6)。

提取的pCAMBIA1300-CpWRI-L4的质粒转入农杆菌GV3101，对农杆菌进行菌液PCR的鉴定(如图7)以及重新转大肠杆菌提取质粒进行酶切验证，结果显示已将植物表达载体pCAMBIA1300-CpWRI-L4质粒成功的转入农杆菌。

(1)转基因拟南芥的Hyg抗性筛选

将通过农杆菌花序侵染获得的转基因哥伦比亚拟南芥T₀代种子播种在含50mg/LHYG的MS固体培养基上进行阳性植株筛选，成功转入目的基因的拟南芥能够在抗性培养基上正常生长，而未成功转入的则在子叶期黄化死亡，经筛选共获得8个CpWRI-L4转基因拟南芥株系。将筛选出的抗性植株进行移栽，分别收获种子后继续进行抗性筛选，将表现出分离比接近3:1的株系各单株分别移栽收种，并继续进行抗性筛选，最终在T₂代获得8个株系12个纯合体转基因单株。T₀代和T₂代筛选结果如图8所示。

(2)转基因拟南芥PCR阳性检测

分别提取T₀代HYG抗性筛选出的拟南芥和野生型拟南芥WT植株的叶片基因组DNA，以蜡梅CpWRI-L4基因特异引物CpWRI-L4-F和CpWRI-L4-R进行PCR检测(如图9)。1-10抗性株系均扩增出与目的片段大小一致的条带，说明目的基因CpWRI-L4已成功插入到拟南芥基因组中。

(3)35S::CpWRI-L4拟南芥株系qPCR检测

为了进一步检测分析CpWRI-L4基因在转基因拟南芥中的表达水平，根据上述(1)和(2)中筛选和检测结果，分别提取在含相应抗生素的MS固体培养基上播种后生长约14天左右的T₂代纯合体转基因拟南芥和野生型拟南芥WT幼苗整株总RNA。以反转录后的cDNA作为模板，拟南芥AtActin基因为内参，野生型拟南芥WT为对照，进行实时荧光定量PCR检测和分析。

结果显示，野生型拟南芥WT中没有检测到CpWRI-L4基因的表达，在所检测的8个株系12个T₂代纯合体转基因拟南芥单株中，CpWRI-L4基因的表达水平各不相同，其中以OE7-6单株中表达量最高，OE7-10单株和OE11-10单株中的表达量稍低于OE7-6单株。OE10-4单株和OE 9-5单株中的表达量处于中等水平，约为OE7-6单株表达量的1/2，OE3-10单株中的表达量又约为OE10-4单株的1/2。OE10-12单株和OE11-4单株的表达量偏低，OE1-3、OE3-11、OE4-5、OE6-3四个单株的表达量最低。利用SPSS软件对CpWRI-L4在OE7-6、OE9-5、OE10-12、WT四个单株中的表达量水平进行数据分析，发现CpWRI-L4在4个单株中的表达水平具有显著性差异，由此选取表达量最高的OE7-6、表达量中等的OE9-5和表达量最低的OE10-12单株用于后期对CpWRI-L4转基因拟南芥的研究分析及表型观察(图10)。

(4)35S::CpWRI-L4/拟南芥内源基因表达分析

为了研究分析蜡梅CpWRI-L4基因转入拟南芥后其对拟南芥内源基因的影响，根据(3)的检测及选取结果，分别提取在含HYG抗生素的MS固体培养基上播种后生长约14天左右的T₂代纯合体转基因拟南芥和野生型拟南芥WT幼苗整株的总RNA。以反转录后的cDNA为模板，拟南芥AtActin基因为内参，进行实时荧光定量PCR检测和分析拟南芥中花发育相关基因的表达情况，引物见下表。

表2拟南芥实时荧光定量PCR引物

结果如图11所示。在拟南芥中转入CpWRI-L4后，拟南芥中FT、SOC1、AP1和LFY基因都有不同程度的上调。相对于野生型拟南芥，各转基因株系中的AtSOC1基因都有些许上调，但只是在OE7-6中达到显著水平。AtAP1基因只是在OE7-6和OE9-5单株中有明显上调，在OE10-12单株中表达量与WT无显著差异。各转基因拟南芥中的AtFLY和AtFT基因发生了明显上调，且均达到显著水平。由此可推测蜡梅CpWRI-L4基因可能具有促进植物提前开花的功能。

(5)转基因拟南芥的表型观察

根据上述(3)的检测和选取结果，以野生型拟南芥WT为对照，对蜡梅CpWRI-L4转基因拟南芥T₂代纯合体株系进行表型观察。在光照16h/黑暗8h的光周期、2000Lux照明条件和22℃、70％湿度的生长环境下，以野生型拟南芥(WT)为对照，对选取的三个蜡梅CpWRI-L4转基因拟南芥(相对表达量高、中、低)T₂代纯合株系进行表型观察，设置三次生物重复，每次重复中不同转基因株系和WT各12株。每天定时观察比较各拟南芥株系从苗期到抽葶结实期再到衰败期的表型特点，并进行相关数据统计。主要观察统计指标包括抽葶1cm时间及此时莲座叶数、第一朵花开放时间、第一个果荚形成时间、植株高度等。结果如表3及图12A,B所示(表中的时间都是以将拟南芥种子4℃条件下打破休眠后开始记)。除列出的表型变化外其他指标均未发现明显差异现象。

结果表明：35S::CpWRI-L4/Col-0不同株系生长受到了抑制并有明显的早花现象，而且CpWRI-L4表达量越高的转基因拟南芥植株高度越矮，早花现象越明显。各转基因单株的抽葶时间、第一朵花开放时间和第一个果荚出现时间均比野生型拟南芥WT早，且均达到显著水平。野生型拟南芥WT当生长到27.42天时才开始抽葶，而CpWRI-L4表达量最高的OE7-6单株的抽葶时间为22.62天，比WT早了4.8天，表达量最低的OE10-13单株也比WT早了1.9天。野生型拟南芥WT开始开花的平均时间是30.58天，而各转基因单株的开花时间为25.58、27.83、28.42天，比WT早了2～5天，其开始结果的时间也相应的提早了3～5天。相对于野生型拟南芥WT，各转基因单株的莲座叶也发生显著减少，OE7-6单株的的莲座叶减少了2.9片，OE10-12单株也减少了2片。转基因拟南芥植株的生长受到了明显抑制，当WT和35S::CpWRI-L4拟南芥的营养生长结束时,35S::CpWRI-L4较WT拟南芥的株高平均矮了约6.2～8cm。结果表明，表明蜡梅WRI-L4基因可以抑制植物生长和促进早花，

表3 35S::CpWRI-L4/Col-0拟南芥T₂代株系表型统计

表中每组数据均为“平均值±标准差”；a、b、c、d表示P＜0.05水平上差异显著；各株系均为3次重复，每重复12棵植株

将35S::CpWRI-L4转基因拟南芥(相对表达量高、中、低)T₂代种子以及野生型WT种子放4℃冰箱3天打破种子休眠后转入温室黑暗竖直培养6天，观察各株系下胚轴生长状况，并对其进行拍照。黑暗条件下竖直培养6天发现各转基因拟南芥株系的下胚轴都比野生型WT要长得多，OE7-6的转基因株系的下胚轴长度差不多达到WT的3倍(图12C,D)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 蜡梅CpWRI-L4基因及其编码的蛋白与应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1203

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 1

tcttcttctt cttctattcc ttcttctgct gcaatttcaa caaatcggac ggttcaaacc 60

actttaaaag gaaaggattc aacagaccaa gttcagatca atggggaaac catcacagaa 120

gaacaacaag aacagcaaca gtgaaagcaa catcagcagc aacccatcaa agaaagcgaa 180

gagaacgaga aagagtgtcc caagagactc tcctccacaa cgtagctcca tttacagggg 240

agtcacaagg catcgatgga cgggtagata tgaagctcat ctgtgggata agaattgctg 300

gaatgaaaac cagaacaaga aaggaagaca agtctactta ggtgcttatg atgatgaaac 360

agcagctgca catgcatatg acttagcagc tctgaagtat tggggacaag ataccatcct 420

caactttcct gtatccactt atgaagaaga gatcaaagag atggaaggac aatcaaaaga 480

agaatatatt ggatatttga ggaggaaaag tagcgggttt tctcgaggtg tgtcaaagta 540

cagaggtgtg gcaaggcatc atcacaatgg aagatgggaa gctcgaatcg gcagagtatt 600

tggcaacaaa tacctttatt taggaacata tggtacacag gaagaagcgg caacagcgta 660

cgacatggcg gcaatcgagt atcggggtct taacgccgtt acgaatttcg acctcagccg 720

ttacataaaa tggcttcgcc ccaactccca aaaccctgac cctaactccg aaaaccctaa 780

ccctaatccc gaaaactcca ccttcctaaa tcccgacctt aacgtctcgt cagagcccgg 840

cacctccgat gccgtccctc cgctgccacg ttccggcgcc gccgccgctt catctgccct 900

tggcctcctg ctgcagtcgt ccaagttcaa agagatgctg gagcgaacgg cagccgccga 960

gtctccagaa tccgacgccc cgccagaatc cgacaaaact ccccgctgca gcttccccga 1020

tgacatccag acctacttcg agtgccatca cgactccggc gacgccgatg acatcatctt 1080

cggcgacctc agttcgttcg ccgctccttt ggtcgaagcc gactgggatg gacagtaaac 1140

gaagatcaac ggctgagatc ggtttttgat tttcttctct ttttttattt ttttttctaa 1200

aag 1203

<210> 2

<211> 345

<212> PRT

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 2

Met Gly Lys Pro Ser Gln Lys Asn Asn Lys Asn Ser Asn Ser Glu Ser

1 5 10 15

Asn Ile Ser Ser Asn Pro Ser Lys Lys Ala Lys Arg Thr Arg Lys Ser

20 25 30

Val Pro Arg Asp Ser Pro Pro Gln Arg Ser Ser Ile Tyr Arg Gly Val

35 40 45

Thr Arg His Arg Trp Thr Gly Arg Tyr Glu Ala His Leu Trp Asp Lys

50 55 60

Asn Cys Trp Asn Glu Asn Gln Asn Lys Lys Gly Arg Gln Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gly Ala Tyr Asp Asp Glu Thr Ala Ala Ala His Ala Tyr Asp Leu Ala

85 90 95

Ala Leu Lys Tyr Trp Gly Gln Asp Thr Ile Leu Asn Phe Pro Val Ser

100 105 110

Thr Tyr Glu Glu Glu Ile Lys Glu Met Glu Gly Gln Ser Lys Glu Glu

115 120 125

Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Arg Lys Ser Ser Gly Phe Ser Arg Gly Val

130 135 140

Ser Lys Tyr Arg Gly Val Ala Arg His His His Asn Gly Arg Trp Glu

145 150 155 160

Ala Arg Ile Gly Arg Val Phe Gly Asn Lys Tyr Leu Tyr Leu Gly Thr

165 170 175

Tyr Gly Thr Gln Glu Glu Ala Ala Thr Ala Tyr Asp Met Ala Ala Ile

180 185 190

Glu Tyr Arg Gly Leu Asn Ala Val Thr Asn Phe Asp Leu Ser Arg Tyr

195 200 205

Ile Lys Trp Leu Arg Pro Asn Ser Gln Asn Pro Asp Pro Asn Ser Glu

210 215 220

Asn Pro Asn Pro Asn Pro Glu Asn Ser Thr Phe Leu Asn Pro Asp Leu

225 230 235 240

Asn Val Ser Ser Glu Pro Gly Thr Ser Asp Ala Val Pro Pro Leu Pro

245 250 255

Arg Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ala Leu Gly Leu Leu Leu Gln

260 265 270

Ser Ser Lys Phe Lys Glu Met Leu Glu Arg Thr Ala Ala Ala Glu Ser

275 280 285

Pro Glu Ser Asp Ala Pro Pro Glu Ser Asp Lys Thr Pro Arg Cys Ser

290 295 300

Phe Pro Asp Asp Ile Gln Thr Tyr Phe Glu Cys His His Asp Ser Gly

305 310 315 320

Asp Ala Asp Asp Ile Ile Phe Gly Asp Leu Ser Ser Phe Ala Ala Pro

325 330 335

Leu Val Glu Ala Asp Trp Asp Gly Gln

340 345

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 3

aacaaatcgg acggttcaaa ccact 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 4

gaaaatcaaa aaccgatctc agccgg 26

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 5

aacaaatcgg acggttcaaa ccact 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 6

gaaaatcaaa aaccgatctc agccg 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 7

gttatggttg ggatgggaca gaaag 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 8

gggcttcagt aaggaaacag ga 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 9

tagtgacaag acagtaggtg gaggt 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 10

gtaggttcca gtcctcactt catc 24

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 11

cggggtacca acaaatcgga cggttcaaac cact 34

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 12

acgcgtcgac gaaaatcaaa aaccgatctc agccg 35

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 13

cttcgtcttc cacttcag 18

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 14

atcataccag tctcaacac 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 15

agacggctgc ttttgggatg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 16

tattccccgc cgcatcagtc 20

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 17

gattggtgga gaagacctca ggaac 25

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 18

gcagccactc tccctctgac aat 23

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 19

tagggctcaa caggagcagt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 20

cagccaaggt tgcagttgta 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 21

aattcgccag ctccaatatg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 22

cctcgattga gcatgttcct 20

Claims (7)

1.蜡梅CpWRI-L4蛋白，其为由SEQ ID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的蜡梅CpWRI-L4蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

6.权利要求2或3所述基因在调控植物花期中的用途，其特征在于，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物提前开花。

7.一种使植物提前开花的方法，其为将含有权利要求2或3所述基因的载体转入植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。

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