CN102120763B - 水稻OsNAC编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，为一种在水稻中表达的NAC家族转录因子的编码序列及其在花粉发育中的应用。本发明包括NAC家族转录因子的克隆、基因表达模式分析、转基因载体的构建、植物转化、转基因植株的获得，以及相应的表型和细胞水平鉴定。本发明所说基因在拟南芥中表达，获得的转基因植物的花粉发育出现异常，结实率下降。

Description

水稻OsNAC编码序列及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，具体涉及一种在水稻中表达的NAC家族转录因子的克隆、基因表达模式分析、转基因载体的构建、植物转化、转基因植株的获得，以及相应的表型和细胞水平鉴定。

背景技术

植物生殖发育的多个环节影响到果实和种子的大小和多少。因此，控制生殖发育的基因可以决定农作物的产量。植物生殖发育的环节包括花器官的发育，雄蕊细胞分裂和分化，减数分裂，及花粉发育，调节这些环节的基因可能会对产量有很大的影响。对植物生殖发育的功能基因的克隆及其功能的分析研究，将为提高作物产量提供候选基因。

根据拟南芥花药发育5~8期的芯片数据结果，发现ANAC092在两个花粉发育异常的突变体spl，ems中的表达量较野生型大量下调，推测其在花粉发育过程中起重要调控作用。该基因参与拟南芥的衰老和侧根形成过程，尚未有其在花粉发育过程中作用的报道。NCBI中通过BLASTn获得了该基因在水稻品种“日本晴”中的同源基因OsNAC（Os04g0460600，LOC_Os04g38720）。

NAC家族转录因子是植物特有的一大类转录因子，其在植物的生长发育中主要参与形态建成，包括顶端分生组织的形成，侧根的形成，次生壁的形成等，另外NAC家族还参与植物的生物逆境和非生物逆境反应。尚未有其参与花粉发育的报道。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的水稻OsNAC在花粉发育中功能的研究。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的水稻功能基因OsNAC，该基因是NAC家族转录因子。

本发明的第二目的是提供这种水稻蛋白OsNAC编码序列在参与花粉发育中的应用。

本发明一方面提供一种水稻功能基因OsNAC，该基因是NAC家族转录因子，能参与花粉发育，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

本发明还提供一种DNA分子，该序列编码具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽。

本发明一方面提供一种克隆出编码OsNAC的开放阅读框的方法，序列为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的105 ~ 1136bp，ORF长度为1032bp（红色字符标识出起始密码子和终止密码子）。

本发明还提供了一种检测OsNAC mRNA时空表达模式的方法，其步骤如下：

1、取萌发5d的水稻幼苗的根，花粉发育早期减数分裂时期的花序和花粉粒形成时期的花序，固定，石蜡切片。

2、利用OsNAC开放读框的3’端和3’UTR的特异序列（SEQ ID NO.1所示序列的1020bp ~ 1244bp）设计特异引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，合成探针，杂交显色。

本发明还提供一种通过Realtime PCR检测OsNAC表达量的方法，它包括用SEQ ID NO.1所示序列的1020bp ~1244bp为模板设计引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6， Realtime PCR定量分析水稻不同器官中和不同激素，胁迫处理下水稻体内OsNAC的表达量的变化。

本发明还提供所述的编码NAC家族转录因子在参与花粉发育过程中的应用。包括：

将所述的编码NAC家族转录因子序列转入拟南芥，分析其对花粉发育的功能，具体步骤如下：

（1）将编码序列可操作的连接于植物表达载体，形成含有SEQ ID NO.1序列ORF框的表达载体；

（2）将步骤（1）中的表达载体转化拟南芥；

（3）通过抗生素筛选，RT-PCR鉴定，获得转基因阳性单株，转基因植物的花粉发育异常，花粉粒含量减少。

本发明还提供一种用于鉴定是否存在OsNAC核苷酸序列的方法，它包括用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示ORF框的特异引物对转基因拟南芥基因组DNA进行PCR反应，PCR反应体系中添加5%的DMSO，可以提高PCR反应的特异性，然后通过检测是否扩增出目的片段来判断是否含有OsNAC核苷酸序列。

附图说明

图1 NAC家族功能基因的聚类分析。除来源于油菜的BnNAC14，来源于马铃薯的StNAC，来源于小麦的NAM-B1，来源于水稻的OsNAC6，ONAC063，ONAC045和ONAC300其余基因都来源于拟南芥。

图2 水稻植株各个器官中OsNAC表达量的分析。flower是长度为5cm的花序的总RNA；stem是水稻分蘖茎的总RNA；young leaf是刚抽出的幼叶的总RNA；leaf是展开的尚未变黄的叶片的RNA；old leaf是开始变黄，但尚未皱缩的叶片的RNA。

图3 不同激素和逆境处理下OsNAC的表达。将两叶一心期水稻苗分别激素处理24h：KT，6-BA，IAA 10μmol/L，ABA 50μmol /L，GA 5μmol /L，以ddH₂O为对照。用10%PEG处理4天，200μmol/LNaCl处理4天，以ddH₂O为对照。

图4 水稻中OsNAC表达的原位分析。A图和B图为颖花切片的原位图片，C图为种子萌发5天水稻切片的原位图片。A和B图中的星号示出绒毡层的阳性信号，C图的星号示出侧根原基的阳性信号。

图5 OsNAC转基因拟南芥单株的潮霉素PCR鉴定。O1，O2，O3，O5分别为独立的转基因株系，-为野生型拟南芥阴性对照，+为质粒阳性对照。

图6 转基因拟南芥株系中OsNAC的RT-PCR分析。O1，O2，O3，O5，O6分别为独立的转基因株系。WT为非转基因的野生型拟南芥对照。

图7 OsNAC转基因拟南芥株系的表型分析。A图为野生型对照，B图为转基因株系，红色箭头所示为不育的果荚。

图8野生型和转基因株系花粉的Alexander染色。A图为野生型对照的花粉染色，B图为转基因株系的花粉染色。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册（New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1  水稻OsNAC基因的克隆。

取田间生长的水稻（日本晴）叶片立即置于液氮中冷冻保存，提RNA。根据OsNAC的ORF序列设计引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。采用RT-PCR方法从水稻cDNA中扩增出一条1kb左右的条带。将PCR产物回收，连接到载体pCR-Blunt上，进行测序。

实施例2  水稻OsNAC基因的序列信息与同源性分析。

本发明中水稻OsNAC基因的ORF长度为1032bp，详细序列见SEQ ID NO.1（红色粗体字符标识出起始密码子和终止密码子）。该基因编码的多肽由343个氨基酸残基组成，分子量36837.81道尔顿，等电点为7.47，详细序列见SEQ ID NO.2。

该水稻中的OsNAC基因是根据ANAC092的氨基酸序列通过Blast在Non-redundant GeneBank CDS translations＋PDB+SwissPort＋Superdate＋PIR数据库中获得，二者的同源性达到73%。

ANAC092参与拟南芥的衰老和侧根形成过程，尚未有参与花粉发育的报道，通过ClustalX 和MEGA2对已报道的NAC家族功能基因的氨基酸序列和ANAC092和OsNAC进行序列的同源性比较和进化树的构建，结果表明ANAC092和OsNAC与CUC1/2聚为一类。

实施例3  水稻OsNAC不同器官、不同激素和不同胁迫处理下的表达分析。

分别提取扬花期“日本晴”不同器官（根，茎，叶，花序）的RNA，其中根据叶的不同生长阶段和颜色分别提取尚未展开的幼叶，已展开的成熟叶，和发黄尚未皱缩的老叶。进行Realtime PCR分析，结果如图2，表明OsNAC在水稻中组成型表达，在幼叶和衰老的黄色叶片中的表达量高，暗示其参与分化和衰老的过程，其参与植物衰老过程的性状与其拟南芥中的同源基因ANAC092相似。另外，OsNAC的表达受ABA诱导显著，表明其可能参与植物的逆境反应，进一步的胁迫处理发现，OsNAC受干旱和盐的诱导。

实施例4  水稻OsNAC组织水平表达模式的分析。

用原位杂交的方法检测水稻OsNAC在颖花和根中的表达模式。分别取水稻花粉发育减数分裂后期至花粉粒形成期的花序材料和刚萌发的5天水稻的材料，经石蜡切片，杂交，显色。结果如图4所示，OsNAC在绒毡层和花粉粒中有明显表达，在侧根原基也有明显的表达。

实施例5  转OsNAC基因的拟南芥表型鉴定和细胞水平分析。

1 含目的基因（OsNAC基因）表达载体的构建

以实施例1中获得的克隆载体为模板，在引物两端加上酶切位点NcoⅠ和SpeⅠ并在保证阅读框架的前提下，将克隆的目的片段酶切连接到植物表达载体pCAMBIA1304中，将其转入农杆菌中。利用花序浸染法技术转化拟南芥。

 2利用花序浸染法转化拟南芥

1）挑取农杆菌单菌落在3ml LB+利福平(40mg/L)+链霉素 (50mg/L) +卡那霉素 (50mg/L)培养基中，28℃、250rpm振菌培养过夜。

2）取50ml菌液接种到50ml同样抗性的LB培养基中，相同条件下扩大培养过夜，至0D₆₀₀为1.2。

3）室温下4500rmp离心5min，去上清，转化缓冲液重悬菌体至0D₆₀₀在0.8-1.0之间。

拟南芥转化缓冲液配制：

1/2MS+6-BA(0.01mg/L)+5%蔗糖+0.03% silwet  

农杆菌喷雾法转化拟南芥：侵染前过夜保湿培养野生型拟南芥材料，并将已开放的花和果荚剪去。将用转化缓冲液重悬的菌液倒入50ml的小喷壶中，对野生型拟南芥（Col.）尚未开放的花蕾进行充分雾喷，保湿暗培养过夜后转为正常培养，5d后重复转化1次。

分批采摘成熟果夹，50℃烘箱脱水干燥数天，取出种子，清理干净后放回干燥器中室温保存备用。

 3对转基因植株的筛选和分子鉴定

将转基因种子消毒，在拟南芥筛选培养基上（MS+25mg/L hyg）无菌培养，4℃暗培养2d后转至人工气候室正常培养。10d后将有4片真叶并生根的抗性小苗转移到盆土，盖上薄膜保湿，在温室中培养，3d取下薄膜转为正常培养，生长良好的植株即为转基因株系。将转基因株系T₀代苗结出的种子再经拟南芥筛选培养基筛选，获得T₁代苗，种植与抗性筛选直至获得T₃代纯合转基因种子。

以SDS法小量抽提潮霉素抗性生根拟南芥单株的的基因组DNA，以野生型拟南芥材料作为负对照，根据潮霉素抗性基因特异序列设计引物，进行PCR检测（部分结果），见图5。

提取抗性单株的RNA，RT-PCR检测外源基因OsNAC的表达，见图6。在PCR反应体系中添加5%的DMSO可以特异性扩增出OsNAC，五个转基因株系的外源基因都较野生型拟南芥有明显的表达。

 4转基因植株的表型鉴定

得到多个转基因植株，转基因株系的花出现不育，果荚变短，见图7。将尚未开花刚露白的花苞剥开，取尚未散粉的花药进行Alexander花粉染色，结果表明花粉数量明显较野生型的减少，见图8。表明外源OsNAC基因在拟南芥中超量表达，影响了花粉的育性。试验结果表明，实施例 1中得到的水稻OsNAC基因参与了花粉发育过程，可以进一步用于研究花粉发育机制和水稻的转基因育种。

<110>  复旦大学

<120>  水稻OsNAC编码序列及其应用

<130>  001

<160>  6    

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1401

<212>  DNA

<213>  

<400>  1

atacaacgat ttcctcttgt caccctgaat ctacttctgc tgcaaaagca ataagcaagg     60

agcagttagc caggtaaagc tctagctagc tagcttaggc agcaatggag cagcatcagg    120

gccaggcagg catggacttg ccccctggct tccgcttcca cccgaccgac gaggagctga    180

tcacgcacta cctcgccaag aaggtcgccg acgcccgctt cgccgccctc gccgtcgccg    240

aggccgacct caacaagtgc gagccctggg acctgccatc tctggcgaag atgggggaga    300

aggagtggta cttcttctgc ctcaaggaca ggaagtaccc gacggggctg aggacgaaca    360

gggcgacgga gtccgggtac tggaaggcca cggggaagga caaggacatc ttcagacgga    420

aggccctcgt cggcatgaag aagacgctcg ttttctacac ggggcgcgct cccaaggggg    480

agaagtctgg ctgggtcatg cacgagtacc gcctccacgg caagctccac gccgccgccc    540

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tggagatggc gaggggaggg tcgacgtcgt cgtccgtggc ggacgagatc gccatgtcgt    720

ccgtcgtcct ccctccgctg atggacatgt ccggagccgg cgccggcgcc gtcgacccgg    780

cgacgacggc gcacgtgacc tgcttctcca acgcgctgga gggccagttc tttaacccga    840

cggcagtaca cgggcacggc ggcggcgact cctcgccgtt catggcgagc ttcacgcagt    900

acgggcagct gcaccacggc gtgagcctgg tgcaactcct ggagagctgc aacggctacg    960

gcggcctcgt cgacatggca gcgtccggca gccagctgca gccggcggcg tgcggcggcg   1020

agcgggagag gcttagcgcg tcgcaggaca ccggcctcac ctccgacgtg aacccggaga   1080

tctcgtcatc ctccggccaa aaattcgacc acgaggccgc gctatggggc tactaaggtt   1140

tgatatgatc agcgccgtgt acgttaatcg cgggcgatta gcgaagtagc gattactgta   1200

aataaaacca tgagatcgcg atcgaggcat ctaccaaggt tcgcttaatt tgcttgtacc   1260

tataggtgta gattatttgg tgatttggga gatgtaatta gcattgtttg tttgtaattc   1320

gtatcagaat gatcgatgca gtattgtttg gagggttagt taagcaattg gccactcctc   1380

agttgccagt taattagtta g                                             1401

 

<210>  2

<211>  343

<212>  PRT

<213>  

 <400>  2

 Met Glu Gln His Gln Gly Gln Ala Gly Met Asp Leu Pro Pro Gly Phe

1               5                   10                  15     

 

Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Ile Thr His Tyr Leu Ala Lys

            20                  25                  30         

 

Lys Val Ala Asp Ala Arg Phe Ala Ala Leu Ala Val Ala Glu Ala Asp

        35                  40                  45             

 

Leu Asn Lys Cys Glu Pro Trp Asp Leu Pro Ser Leu Ala Lys Met Gly

    50                  55                  60                 

 

Glu Lys Glu Trp Tyr Phe Phe Cys Leu Lys Asp Arg Lys Tyr Pro Thr

65                  70                  75                  80 

 

Gly Leu Arg Thr Asn Arg Ala Thr Glu Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr

                85                  90                  95     

 

Gly Lys Asp Lys Asp Ile Phe Arg Arg Lys Ala Leu Val Gly Met Lys

            100                 105                 110        

 

Lys Thr Leu Val Phe Tyr Thr Gly Arg Ala Pro Lys Gly Glu Lys Ser

        115                 120                 125            

 

Gly Trp Val Met His Glu Tyr Arg Leu His Gly Lys Leu His Ala Ala

    130                 135                 140                

 

Ala Leu Gly Phe Leu His Gly Lys Pro Ala Ser Ser Lys Asn Glu Trp

145                 150                 155                 160

 

Val Leu Cys Arg Val Phe Lys Lys Ser Leu Val Glu Val Gly Ala Ala

                165                 170                 175    

 

Gly Gly Lys Lys Ala Ala Val Val Thr Met Glu Met Ala Arg Gly Gly

            180                 185                 190        

 

Ser Thr Ser Ser Ser Val Ala Asp Glu Ile Ala Met Ser Ser Val Val

        195                 200                 205            

 

Leu Pro Pro Leu Met Asp Met Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ala Val Asp

    210                 215                 220                

 

Pro Ala Thr Thr Ala His Val Thr Cys Phe Ser Asn Ala Leu Glu Gly

225                 230                 235                 240

 

Gln Phe Phe Asn Pro Thr Ala Val His Gly His Gly Gly Gly Asp Ser

                245                 250                 255    

 

Ser Pro Phe Met Ala Ser Phe Thr Gln Tyr Gly Gln Leu His His Gly

            260                 265                 270        

 

Val Ser Leu Val Gln Leu Leu Glu Ser Cys Asn Gly Tyr Gly Gly Leu

        275                 280                 285            

 

Val Asp Met Ala Ala Ser Gly Ser Gln Leu Gln Pro Ala Ala Cys Gly

    290                 295                 300                

 

Gly Glu Arg Glu Arg Leu Ser Ala Ser Gln Asp Thr Gly Leu Thr Ser

305                 310                 315                 320

 

Asp Val Asn Pro Glu Ile Ser Ser Ser Ser Gly Gln Lys Phe Asp His

                325                 330                 335    

 

Glu Ala Ala Leu Trp Gly Tyr

            340            

 

<210>  3

<211>  18

<212>  DNA

<213>  

<400>  3

atggagcagc atcagggc                                                   18

 

<210>  4

<211>  19

<212>  DNA

<213>  

<400>  4

ttagtagccc catagcgcg                                                  19

 

<210>  5

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<212>  DNA

<213>  

<400>  5

gagcgggaga ggcttagc                                                   18

 

<210>  6

<211>  19

<212>  DNA

<213>  

<400>  6

agcgaacctt ggtagatgc                                                  19

 

Claims (2)

1.一种NAC家族转录因子在导致花粉不育中的应用，所述NAC家族转录因子的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于将NAC家族转录因子序列转入拟南芥，分析其对花粉发育的功能，具体步骤如下：

（1）将编码序列可操作的连接于植物表达载体，形成含有SEQ ID NO.1序列ORF框的表达载体；

（2）将步骤（1）中的表达载体转化拟南芥；

（3）通过抗生素筛选，RT-PCR鉴定，获得转基因阳性单株，转基因植物的花粉发育异常，花粉粒含量减少。

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