CN108103076A

CN108103076A - 一种抑制叶片衰老的黑麦草转录因子基因LpNACL及其应用

Info

Publication number: CN108103076A
Application number: CN201810104532.8A
Authority: CN
Inventors: 徐彬; 余国辉; 谢哲倪; 张敬; 黄炳茹
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2038-02-02
Also published as: CN108103076B

Abstract

本发明提供一种抑制叶片衰老的黑麦草转录因子基因LpNACL及其应用，本发明所述基因LpNACL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或具有与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有75％以上同源性，且同样能够编码参与植物衰老调控，特别是抑制叶片衰老蛋白的DNA分子。基因LpNACL可参与到衰老调控过程，抑制叶片衰老，从而提高植物品质，可以用于培育抗衰老，特别是抗叶片衰老的转基因植物。

Description

一种抑制叶片衰老的黑麦草转录因子基因LpNACL及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种抑制叶片衰老的黑麦草转录因子基因LpNACL及其应用。

背景技术

转录因子(transcription factor)又称反式作用因子，是一种能与真核基因5′端上游特定序列进行专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。

黑麦草是一种冷季型的草坪草和牧草。作为草坪草，黑麦草在城市绿化中广泛应用；作为牧草，黑麦草是世界上种植面积最大的禾本科牧草，也是我国长江流域种植最大的冷季型禾本科牧草之一。但是由于黑麦草化感作用强，抗逆性差，导致其叶片黄化程度很容易受环境因素影响，从而使得其景观效果与牧草营养品质显著降低，而叶片黄化主要是由叶片叶绿素降解导致。由此，如何抑制叶绿素的降解对于保持其或与其类似的植物的景观效果与营养品质具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一个抑制叶片衰老相关基因，该基因在黑麦草衰老叶片中特异表达，超表达该基因可显著抑制叶片衰老，从而为植物的转基因育种提供有效的手段和工具。

为达到以上目的，本发明提供了一个抑制叶片衰老相关基因及其应用，该基因属于NAC转录因子，该基因含有典型的NAM结构域和TAR区，故命名为LpNACL。

本发明所述基因LpNACL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或具有与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有75％以上同源性，且同样能够编码参与植物衰老调控，特别是抑制叶片衰老蛋白的DNA分子。

本发明所述基因LpNACL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或具有与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性，且同样能够编码参与植物衰老调控，特别是抑制叶片衰老蛋白的DNA分子。

该基因可以从黑麦草Bena vista草坪草中克隆获得的，也可通过人工合成方法获得。凡是经过人工修饰的，与本发明分离得到SEQ ID NO.1的核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码类似蛋白产物，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的核苷酸序列。

本发明还提供基因LpNACL编码的蛋白质，其序列如SEQ ID NO.2所示，或SEQ IDNO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物衰老调控，特别是抑制叶片衰老相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

利用本发明的基因编码的氨基酸序列，可设计和人工添加信号肽序列以有利于在植物中的表达。

利用本发明的基因编码的氨基酸序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于在植物中表达的核酸序列。

本发明还提供一种包括所述基因LpNACL的重组表达载体。

所述植物表达载体可以利用含有玉米组成型启动子(Ubiquitin promoter)的双元表达载体pVT1629及含有烟草组成型启动子CaM35S组成型双元表达载体pEarelyGate103组成型表达LpNACL基因。例如本发明实施例中根据对模式植物拟南芥(pEarelyGate103-CaM35S::LpNACL)与水稻(pVT1629::LpNACL)，以及黑麦草(pVT1629::LpNACL)转基因，将LpNACL片段分别插入模式植物与本体植物基因组中，共获得三种转基因植物。

本发明还提供一种包括所述基因LpNACL或所述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞可以用于遗传工程转化；所述的宿主细胞优选大肠杆菌细胞或农杆菌细胞，更优选根癌农杆菌细胞。

本发明还提供基因LpNACL或其编码的蛋白质或重组表达载体或宿主细胞在基因工程中的应用。

本发明还提供基因LpNACL或其编码的蛋白质或重组表达载体或宿主细胞在延缓植物衰老中的基因工程应用。

本发明还提供了所述基因在不同植物中基因功能通用性的应用。

所述应用包括用构建好的植物表达载体转化拟南芥，水稻以及黑麦草，并通过不同转基因植物表型来鉴定该基因的功能与保守性，为该基因的应用奠定了基础。

本发明还提供基因LpNACL或其编码的蛋白质或重组表达载体或宿主细胞在抑制叶片衰老中的基因工程应用。

本发明所述的植物可以包括单子叶植物和双子叶植物，如拟南芥、水稻以及黑麦草等。

本发明还提供基因LpNACL或其编码的蛋白质或重组表达载体或宿主细胞在植物育种中的应用。

本发明还提供基因LpNACL或其编码的蛋白质或重组表达载体或宿主细胞在培育抗衰老植物品种中的应用。

本发明还提供基因LpNACL或其编码的蛋白质或重组表达载体或宿主细胞在培育抗叶片衰老植物品种中的应用。

有益效果：

本发明首次发现、定位并克隆得到一个新的延缓植物衰老，特别是抑制叶片衰老的基因LpNACL。本发明的基因编码的蛋白可参与到衰老调控过程，抑制叶片衰老，从而提高植物品质，可以用于培育抗衰老，特别是抗叶片衰老的转基因植物。将所述蛋白的编码基因导入野生植物中，可以培育抗叶片衰老的植物品种，可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1为第一次基因克隆的第1轮RT-PCR和第2轮RT-PCR扩增。

图2pEntry载体构建与酶切验证。

图3基因序列功能域分析注释。

图4植物表达载体构建与酶切验证。

图5为拟南芥LpNACL超表达阳性株系鉴定与黑暗诱导叶片衰老表型。

图6为水稻LpNACL超表达阳性株系黑暗诱导叶片衰老表型。

图7为黑麦草LpNACL超表达阳性株系黑暗诱导叶片衰老表型。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，在本发明的保护范围但不限于下述的实施例。若未特殊说明，本实施例所用方法均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，均为市售购买产品。

实施例1

1材料

1.1植物材料

黑麦草取自南京农业大学草坪资源圃。

2方法

2.1LpNACL基因序列克隆

根据前期实验分析结果获得LpNACL基因转录本序列信息，以黑麦草cDNA为模板，采用Nested-RT-PCR的方法，扩增目标基因。首先，分别在5’-UTR设计正向引物F1，和在3’-UTR设计反向引物R1，以F1和R1为引物对扩增条带，并测序；然后，分别在CDS区设计特异性引物F2和R2，并以F2和R2为引物对，进行第2轮PCR扩增，获得LpNACL的CDS序列。

表1Nested-RT-PCR中的引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		F1	GCTAGCTAGGCGATGATCATGTC
R1	GTATCTATCTACCATCAGTTCATCC
		F2	AATTGAATTCATGATCATGTCCGATCCGGCCAT
R2	ATAAAGCTTGAAAGGGAGCAGCGTGTGA

表2RT-PCR程序

表3PCR反应体系

PCR反应结束之后，经过1％琼脂糖凝胶电泳检测每一轮PCR产物，回收PCR产物，连接至载体pENTR/D上，并送公司进行测序。

2.2基因序列分析

利用DNAman对测序结果进行整理，采用在线分析软件NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析同源基因序列，经同源性比较后，在Arabidopsis genome TAIR 9.0(http://www.Arabidopsis.org/)中进行结构域分析。

2.3表达载体构建

通过设计含有EcoR I和Hind III两个酶切位点的LpNACL基因CDS区LR重组构建入表达载体(pEarelyGate103-CaM35S::LpNACL)与(pVT1629::LpNACL)。

2.4拟南芥，水稻以及黑麦草的遗传转化

将构建好的载体(pEarelyGate103-CaM35S::LpNACL)采用冻融法转入农杆菌株系‘AGL1’中，以Col-0拟南芥作为植物材料，采用蘸花法，将表达载体通过农杆菌侵染法转入拟南芥中。

将构建好的载体(pVT1629::LpNACL)采用冻融法转入农杆菌株系‘AGL1’中，以日本晴水稻和和黑麦草品种‘Bena Vista’种子愈伤作为材料，通过农杆菌侵染法转入愈伤中，后期通过潮霉素筛选获得阳性胚性愈伤，分化成苗后，移栽入基质中，进行鉴定与扩繁。

2.5转基因拟南芥，水稻与黑麦草鉴定

收取拟南芥T0代种子，37℃烘干后，通过草甘膦筛选出阳性植株，移栽入基质中，气候室中培养成苗，采用拟南芥快速微量基因组提取方法进行PCR鉴定和GFP荧光检测的方法对转基因植株进行鉴定。PCR鉴定所用引物为表4中的引物103F和103R。

水稻和和黑麦草转基因苗，分别通过PCR与GUS组织化学染色法进行鉴定。PCR鉴定所用引物为表4中的引物Hpt II F和Hpt II R。

2.6转基因拟南芥，水稻与黑麦草叶片衰老表型

为探究拟南芥、水稻与黑麦草中LpNACL基因功能以及其保守性，对拟南芥阳性株系3-4周龄植株进行离体叶片黑暗诱导衰老试验。同样地，对水稻与黑麦草阳性株系第一片完全展开叶进行离体叶片黑暗诱导衰老试验。

3结果与分析

3.1LpNACL基因序列克隆

以黑麦草cDNA为模版，采用Nested-RT-PCR的方法，对含有3’-UTR和5’-UTR的基因序列进行克隆，用5’-UTR上游引物F1、1条3’-UTR引物R1。根据第1次RT-PCR的得到的序列，再次设计CDS区特异性下游引物F2和R2以相同方法进行第2轮PCR扩增，其结果见图1(注:1st：引物F1与R1的第1轮RT-PCR扩增条带；2nd：引物F2与R2的第2轮PCR扩增条带。)，结果显示LpNACL基因大小在1.1kb左右。

3.2LpNACL基因序列载体构建

通过设计含有EcoR I和Hind III两个酶切位点将克隆到的LpNAL基因CDS区连接至pENTR/D载体，从而得到pENTR-LpNACL，并送公司进行测序。最终获得LpNAL基因CDS区序列长度为1078bp(SEQ ID NO.1),预测了其氨基酸序列长度为349个氨基酸(SEQ ID NO.2)，并对其功能域进行了分析(如图2和图3，A,B,C,D,E区属于NAM结构域)。然后通过LR重组构建入表达载体(pEarelyGate103-CaMV35S::LpNACL)与(pVT1629::LpNACL)，并通过载体大小与酶切验证(图4，泳道1～3最下部一条带对应于LpNACL条带)。结果表明所构载体均为LpNACL重组表达载体。

3.3拟南芥的遗传转化与功能鉴定

通过冻融法将构建好的表达载体转化农杆菌感受态细胞，并活化阳性菌落作为种质液，扩繁后侵染拟南芥花序。经过筛选T1代转基因苗，并通过自交结实，获得拟南芥T2种子。将T2代苗筛选出阳性苗移栽入基质中，取3-4周龄莲座叶第6-8片叶进行离体叶片黑暗处理。鉴定结果显示，过来表达该基因，导致拟南芥叶片衰老推迟，且叶绿素降解速率较野生型显著降低，如图5(注：WT：野生型；OX-1,7,23分别代表转化自LpNACL超标达转基因株系)。说明过量表达LpNACL能够有效延迟拟南芥叶片绿期，即推迟拟南芥的叶片衰老，且本发明所述基因不会影响拟南芥生长。

3.4水稻的遗传转化与功能鉴定

通过冻融法将构建好的表达载体pVT1629::LpNACL转化农杆菌感受态AGL1，并活化阳性菌落作为种质液，扩繁后侵染水稻种子愈伤。待鉴定出水稻转基因苗后，移栽入基质中，分别取每个转基因株系的第一片完全展开叶片进行GUS染色鉴定与PCR鉴定阳性苗。选取阳性株系的第一片完全展开叶进行离体叶片黑暗处理，结果表明转基因株系叶绿素降解速率较野生型显著降低，如图6(注：WT：野生型；OX-1，OX-2，OX-3分别代表转化自LpNACL超标达转基因株系)。说明过量表达LpNACL能够有效延迟水稻的叶片绿期，即推迟水稻的叶片衰老，且本发明所述基因不会影响水稻生长。

3.5黑麦草遗传转化与功能鉴定

通过冻融法将构建好的表达载体pVT1629::LpNACL转化农杆菌感受态AGL1，并活化阳性菌落作为种质液，扩繁后侵染黑麦草的种子愈伤，待鉴定出黑麦草转基因苗后，移栽入基质中，分别取每个转基因株系的第一片完全展开叶片进行GUS染色鉴定与PCR鉴定。选取阳性株系的第一片完全展开叶进行离体叶片黑暗处理，结果表明转基因株系叶绿素降解速率较野生型显著降低，如图7(注：WT：野生型；OX-1,2,3分别代表转化自LpNAL超标达转基因株系)。说明过量表达LpNACL能够有效延迟黑麦草的叶片绿期，即推迟拟南芥的叶片衰老，且本发明所述基因不会影响黑麦草生长。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种抑制叶片衰老的黑麦草转录因子基因LpNACL及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1081

<212> DNA

<213> 黑麦草(Lolium perenne L.)

<400> 1

atgatcatgt ccgatccggc catgctcccg ccgggcttcc ggttccaccc gacggacgag 60

gagctcatcc tccactacct ccgcaaccgc gccgccgact cgccgtgccc cgtctccatc 120

atcgccgacg tcgatatcta caagttcgac ccatgggccc tgccatccaa agctacctat 180

ggcgacaggg agtggtactt cttcacgcca agggaccgca agtacccgaa cggtgtccgg 240

ccgaaccgcg cggcggggtc cggctactgg aaggccaccg gcaccgacaa gcccatccgc 300

agcagcgcca ccaacgagag cgtcggcgtc aagaaggcgc tcgtcttcta caagggccgc 360

ccgcccaagg gcatcaagac caactggatc atgcacgagt accgtctcgc caccgccgac 420

gcgcacgccg ccaacaccta ccgccccatg aggttccgca acgcctccat gaggctggac 480

gactgggtgc tgtgccggat ctacaagaag accagccagg tgtcgccgat gccagtgccg 540

ccgctgtccg accacgagct cgacgagccg agcggcgcct acccgatgtc gagcgccggc 600

atgctcgtgc aggccggcac cagcagctac ccgctgcagg ggacggctgc gggcacgcag 660

aggatgccga agatcccgtc catttcagag ctgctcaacg actactcgct ggcacagctc 720

ttcaacgacg gcggccatgg ggagatgcca cggcacgacc agcacggcgc cgccctcctc 780

ggccacccca tcatgaacca attccatttg aacagcagca tgtcccagtt tgcgcagatg 840

gagtcgtcgg cgcccacgtc gacggcaggc gagggcgctg ccgggaagcg caagagatcg 900

tcggaggact gtggtcataa tgggtccacg agccagccgg acaagaagcc gaacggatct 960

tgtttcggtg gcgcaacgtt ccaaataggc agtggcaacg ccttgcaagg gtcagtaggc 1020

acgggccatc acacgctgct ccctttctaa catggggatc ggatgaactg atggtagata 1080

g 1081

<210> 2

<211> 349

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ile Met Ser Asp Pro Ala Met Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His

1 5 10 15

Pro Thr Asp Glu Glu Leu Ile Leu His Tyr Leu Arg Asn Arg Ala Ala

20 25 30

Asp Ser Pro Cys Pro Val Ser Ile Ile Ala Asp Val Asp Ile Tyr Lys

35 40 45

Phe Asp Pro Trp Ala Leu Pro Ser Lys Ala Thr Tyr Gly Asp Arg Glu

50 55 60

Trp Tyr Phe Phe Thr Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Val Arg

65 70 75 80

Pro Asn Arg Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Thr Asp

85 90 95

Lys Pro Ile Arg Ser Ser Ala Thr Asn Glu Ser Val Gly Val Lys Lys

100 105 110

Ala Leu Val Phe Tyr Lys Gly Arg Pro Pro Lys Gly Ile Lys Thr Asn

115 120 125

Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Ala Asp Ala His Ala Ala

130 135 140

Asn Thr Tyr Arg Pro Met Arg Phe Arg Asn Ala Ser Met Arg Leu Asp

145 150 155 160

Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Lys Lys Thr Ser Gln Val Ser Pro

165 170 175

Met Pro Val Pro Pro Leu Ser Asp His Glu Leu Asp Glu Pro Ser Gly

180 185 190

Ala Tyr Pro Met Ser Ser Ala Gly Met Leu Val Gln Ala Gly Thr Ser

195 200 205

Ser Tyr Pro Leu Gln Gly Thr Ala Ala Gly Thr Gln Arg Met Pro Lys

210 215 220

Ile Pro Ser Ile Ser Glu Leu Leu Asn Asp Tyr Ser Leu Ala Gln Leu

225 230 235 240

Phe Asn Asp Gly Gly His Gly Glu Met Pro Arg His Asp Gln His Gly

245 250 255

Ala Ala Leu Leu Gly His Pro Ile Met Asn Gln Phe His Leu Asn Ser

260 265 270

Ser Met Ser Gln Phe Ala Gln Met Asp Ser Ser Ala Pro Thr Ser Thr

275 280 285

Ala Gly Glu Gly Ala Ala Gly Lys Arg Lys Arg Ser Ser Glu Asp Cys

290 295 300

Gly His Asn Gly Ser Thr Ser Gln Pro Asp Lys Lys Pro Asn Gly Ser

305 310 315 320

Cys Phe Gly Gly Ala Thr Phe Gln Ile Gly Ser Gly Asn Ala Leu Gln

325 330 335

Gly Ser Val Gly Thr Gly His His Thr Leu Leu Pro Phe

340 345

Claims

1.基因LpNACL，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或具有与SEQ ID NO.1所示序列互补的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有75％以上同源性，且同样能够编码参与植物衰老调控蛋白的DNA分子。

2.权利要求1所述基因LpNACL编码的蛋白质。

3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于序列如SEQ ID NO.2所示，或SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物衰老调控，特别是抑制叶片衰老相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

4.一种包括权利要求1所述基因LpNACL的重组表达载体。

5.一种包括所述权利要求1所述基因LpNACL或权利要求4所述重组表达载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述基因LpNACL、权利要求2或3所述蛋白质、权利要求4所述重组表达载体或权利要求5所述宿主细胞在基因工程中的应用。

7.权利要求1所述基因LpNACL、权利要求2或3所述蛋白质、权利要求4所述重组表达载体或权利要求5所述宿主细胞在延缓植物衰老的基因工程应用。

8.权利要求1所述基因LpNACL、权利要求2或3所述蛋白质、权利要求4所述重组表达载体或权利要求5所述宿主细胞在抑制叶片衰老的基因工程应用。

9.权利要求1所述基因LpNACL、权利要求2或3所述蛋白质、权利要求4所述重组表达载体或权利要求5所述宿主细胞在植物育种中的应用。

10.权利要求1所述基因LpNACL、权利要求2或3所述蛋白质、权利要求4所述重组表达载体或权利要求5所述宿主细胞在在培育抗衰老植物品种中，特别是在培育抗叶片衰老植物品种中的应用。