CN101519441B - 一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

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CN101519441B CN2008101011050A CN200810101105A CN101519441B CN 101519441 B CN101519441 B CN 101519441B CN 2008101011050 A CN2008101011050 A CN 2008101011050A CN 200810101105 A CN200810101105 A CN 200810101105A CN 101519441 B CN101519441 B CN 101519441B
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Abstract

本发明公开了一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能使植物开花期发生变化的由1)衍生的蛋白质。本发明的培育开花期提前的转基因植物的方法具有重要的理论及实际意义，在植物的遗传改良中将发挥重要作用。

Description

一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
大豆是世界上最为重要的油料作物和高蛋白粮食作物。在我国，大豆是四大粮食作物之一，对保证国家粮食安全、改善城乡人民生活和增加农民收入有十分重要的作用。大豆是典型的短日照作物，单个品种的适应范围大都在1-1.5个纬度之间，不同纬度地区间引种会因日照长度的变化导致开花期、成熟期提前或延迟，造成产量下降甚至颗粒无收。因此，培育对光周期相对钝感的广适应大豆品种一直是大豆育种的重要目标。通过常规育种方法培育大豆品种虽有很大成效，但在光周期反应敏感性改良方面进展较为缓慢，目前，迫切需要采用分子育种手段，通过外源基因的引入或对内在基因的遗传操作，定向调节大豆品种的光周期反应敏感性，加快广适应大豆品种的选育进程。
近年来，对拟南芥和水稻等模式植物开花途径的研究揭示了光周期调控植物开花的机制。相关研究表明，长日植物(如拟南芥)和短日植物(如水稻)开花的分子途径在进化上是保守的。因此，可借助植物开花相关基因的保守性从双子叶短日植物大豆中克隆、筛选光周期反应关键基因，通过改变光周期条件来分析其表达方式，并通过遗传转化进一步验证该基因的功能，进而通过基因操作手段获得光周期反应敏感性不同的大豆品种。
在拟南芥中，光受体接收外界光信号后，与生物钟基因相互作用将接收的光信号经CO(CONSTANCE)传递到下游基因FT(FLOWERING LOCUS T)，激活FT的表达，进而诱导花分生组织特征基因AP1的表达。在水稻中，Hd3a为FT的同源基因，也具有促进开花的作用。对拟南芥和水稻的研究表明，FT和Hd3a是光信号的整合因子，是促进植物开花的关键基因。拟南芥的开花促进因子FT属于RKIP家族，此家族基因的特点为其编码的氨基酸序列具有保守的RKIP区域。通过转基因方法对FT及其同源基因进行遗传操作，使其过表达或抑制其表达，可改变植物的光周期反应敏感性，为通过分子手段培育广适应作物品种创造条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因。
本发明所提供的与植物开花期相关的蛋白，名称为GmFT，来源于豆科、大豆属、栽培大豆(Glycine max(L.)Merrill)，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花期相关的由1)衍生的蛋白质。
序列表中的序列2由176个氨基酸残基组成，自氨基末端第22-165位为RKIP结构域。
为了使1)中的GmFT便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
             表1.标签的序列
  标签   残基   序列
  Poly-Arg   5-6(通常为5个)   RRRRR
  Poly-His   2-10(通常为6个)   HHHHHH
  FLAG   8   DYKDDDDK
  Strep-tag II   8   WSHPQFEK
  c-myc   10   EQKLISEEDL
上述2)中的GmFT可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的GmFT的编码基因可通过将序列表中序列1的自5′末端第81-611位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述与植物开花期相关蛋白的cDNA基因也属于本发明的保护范围。
与植物开花期相关蛋白的cDNA基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：
1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第81-611位脱氧核糖核苷酸；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；
3)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码上述与植物开花期相关蛋白的DNA分子；
4)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述与植物开花期相关蛋白的DNA分子。
所述步骤4)中的基因，与1)的基因最好有95％以上的同源性。
序列表中的序列1由888个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第81-611位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2的GmFT。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％ SDS和1×SSC，0.1％ SDS各洗膜一次。
扩增上述GmFT基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
含有上述与植物开花期相关蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有GmFT基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明与植物开花期相关蛋白编码基因GmFT的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是水稻等单子叶植物，也可以是拟南芥、大豆等双子叶植物。
使用GmFT基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体具体可为在p3301m的多克隆位点间插入序列表中序列1的自5′末端第81-611位脱氧核苷酸得到的重组质粒p3301m-FT；所述p3301m是用HindIII和EcoRI分别双酶切pBI121和pCAMBIA3301，连接pBI121的3kb酶切产物和pCAMBIA3301的11256bp酶切产物，即得到p3301m。
本发明的另一个目的是提供一种培育开花期提前的转基因植物的方法。
本发明所提供的培育开花期提前的转基因植物的方法，是将上述与植物开花期相关蛋白的编码基因GmFT导入植物中，得到开花期提前的转基因植物。
所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，如水稻、拟南芥、大豆等。
所述植物具体可为拟南芥或大豆。
本发明构建了GmFT的过表达载体，并将其转入野生型拟南芥植株中，实验证明，转入GmFT的拟南芥植株开花期明显提前，说明GmFT是与植物开花期相关的蛋白，GmFT蛋白及其编码基因可用于改变植物开花期。
附图说明
图1为GmFT的EST序列的PCR扩增产物电泳图谱
图2为GmFT的全长cDNA的PCR扩增产物电泳图谱
图3为GmFT在光周期反应敏感大豆品种贡选一号生长点中的表达
图4为GmFT在光周期反应敏感大豆品种贡选一号叶片中的表达
图5为GmFT在光周期反应钝感大豆品种黑河27生长点中的表达
图6为GmFT在光周期反应钝感大豆品种黑河27叶片中的表达
图7为重组表达载体p3301m-FT的质粒图谱
图8为T3代转基因拟南芥植株中目基因的PCR产物电泳结果
图9为T3代转基因拟南芥植株的表型鉴定结果
图10为T3代转基因拟南芥植株中目的基因半定量RT-PCR产物电泳结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由北京三博公司完成。
实施例1、与植物开花期相关的蛋白GmFT及其编码基因的获得
本实施例利用抑制差减杂交方法，获得大豆的一个EST片段，其编码的氨基酸序列具有RKIP的部分保守域。以大豆总RNA的反转录cDNA为模板，利用RACE技术(Rapidamplification cDNA ends，cDNA末端快速扩增技术)得到大豆这一cDNA的3′端和5′端片段，并克隆得到GmFT的全长cDNA。
一、EST序列的获得及验证
以光周期敏感的大豆品种贡选一号为实验材料，分别设置长日照(16h，driver)和短日照(12h，tester)两种光照处理，分别在光照处理的1、7、13和19d时收集叶片，提取各时间点叶片的RNA，将上述长日照处理和短日照处理的各时间点的叶片RNA等量混合，用于下面的实验。应用抑制差减杂交法获得大量的EST序列并对其进行测序，将序列在GenBank中进行同源性比对，其中有一个EST序列所编码的氨基酸具有RKIP的部分保守域，与拟南芥中的FT基因所编码的氨基酸具有相同的RKIP保守域，由此推断这个EST片段可能是FT在大豆中同源基因的一部分。在此EST序列两端设计引物(M1和M2，其核苷酸序列如序列表中序列9和序列10)，提取短日照(12h，tester)处理的大豆叶片的总RNA，将其反转录为cDNA，利用RT-PCR方法扩增此EST序列。反应混合物如下：
        试剂                  用量
        10×PCR缓冲液         2.5μl
        反转录的cDNA          1.0μl
        M1(10.0μM)           0.5μl
        M2(10.0μM)           0.5μl
        dNTP mix(2.5mM)       2.0μl
        Taq酶(5U/μl)         0.2μl
        H2O                   18.3μl
        总计                  25.0μl。
PCR反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环；再72℃延伸10min，16℃保存。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，其中，M为GeneRulerTM DNAladder Mix(MBI-SM0331)的DNA分子量标准，1和2为GmFT的EST序列的PCR产物。结果表明得到310bp的目的片段。切下目的条带，纯化回收后按照Takara公司的pMD18-T载体试剂盒说明书将PCR产物连接到pMD18-T载体上，进行测序。测序结果表明获得的310bp片段与通过抑制差减杂交所得的EST序列相同。
二、5’RACE的扩增
在步骤一获得的EST序列的5’端设计嵌套引物M3和M4(其核苷酸序列如序列表中序列3和序列4)，分别与RACE试剂盒(FirstChoiceTM RLM-RACE Catalog # 1700)所提供的外部引物和内部引物组成引物对进行PCR扩增。RACE试剂盒提供的外部引物和内部引物分别为5’-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3’和5’-CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3’。第一轮PCR反应混合物如下：
        试剂                       用量
        10×PCR缓冲液              2.5μl
        反转录的cDNA               1.0μl
        5’外部引物(10.0μM)       0.5μl
        M3(10.0μM)                0.5μl
        dNTP mix(2.5mM)            2.0μl
        Taq酶(5U/μl)              0.2μl
        H2O                        18.3μl
        总计                       25.0μl。
PCR反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃ 45sec，62℃ 45sec，72℃ 1min，35个循环；再72℃延伸10min，16℃保存。
第一轮PCR产物稀释500倍后作为第二轮PCR反应的模板，将反应混合物中的引物改为5′内部引物和M4，其余成分不变。第二轮PCR反应将退火温度调整为65℃，其余反应程序与第一轮相同。
第一轮PCR反应产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果呈弥散状。取第二轮PCR反应产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得约500bp的条带。回收该片段，连接到pMD18-T载体上进行测序，测序结果表明，此片段含有约100bp的步骤一获得的EST的5’端序列，还扩增出约400bp的新片段。
三、3’RACE的扩增
为获得GmFT的3′端序列，在EST序列的3’端设计引物M5和M6(其核苷酸序列如序列表中序列5和序列6)，分别与RACE试剂盒(FirstChoiceTM RLM-RACE Catalog # 1700)所提供的外部引物和内部引物组成引物对进行PCR扩增。RACE试剂盒提供的外部引物和内部引物分别为5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3’和5’-CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG-3’。第一轮PCR反应混合物如下：
        试剂                      用量
        10×PCR缓冲液             2.5μl
        反转录的cDNA              1.0μl
        3’外部引物(10.0μM)      0.5μl
        M5(10.0μM)               0.5μl
        dNTP mix(2.5mM)           2.0μl
        Taq酶(5U/μl)             0.2μl
        H2O                       18.3μl
        总计                      25.0μl。
PCR反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃ 45sec，58℃ 45sec，72℃ 1min，35个循环；再72℃延伸10min，16℃保存。
第一轮PCR产物稀释500倍后作为第二轮PCR反应的模板，将反应混合物中的引物改为3′内部引物和M6，其余成分不变。第二轮PCR反应将退火温度调整为64℃，其余反应程序与第一轮相同。
第一轮PCR反应产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果呈弥散状。取第二轮PCR反应产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得约400bp的条带。回收该片段，连接到pMD18-T载体上进行测序，测序结果表明，此片段含有约250bp的步骤一获得的EST的3’端序列，还扩增出约200bp的新片段。
四、全长GmFT基因cDNA的扩增
为获得全长GmFT基因的cDNA序列，分别在步骤二和步骤三扩增出的5’RACE和3’RACE序列两端设计引物M7和M8(其核苷酸序列如序列表中序列7和序列8)，提取贡选一号叶片的总RNA，反转录为cDNA，利用RT-PCR方法扩增全长GmFT基因，PCR反应混合物如下：
        试剂                用量
        10×PCR缓冲液       2.5μl
        反转录的cDNA        1.0μl
        M7(10.0μM)         0.5μl
        M8(10.0μM)         0.5μl
        dNTP mix(2.5mM)     2.0μl
        Taq酶(5U/μl)       0.2μl
        H2O                 18.3μl
        总计                25.0μl。
PCR反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃ 1min，52℃，1min，72℃ 1min，35个循环；再72℃延伸10min，16℃保存。
将PCR反应产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，M为GeneRulerTM DNA ladder Mix(MBI-SM0331)的DNA分子量标准，1-4为全长GmFT基因cDNA的PCR扩增结果。结果表明获得约800-900bp的条带。回收该片段，连接到pMD18-T载体上，将获得重组表达载体命名为pMD18-GmFT。对pMD18-GmFT进行测序，测序结果表明，获得888bp的单一条带，该888bp的核苷酸片段即为GmFT，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示。核苷酸序列比对结果表明，GmFT与拟南芥的开花促进因子FT的同源性为69.8％。
实施例2、GmFT在大豆不同发育时期、不同组织中的表达情况
选择贡选一号(光周期敏感品种)和黑河27(黑龙江省农业科学院黑河分院选育)(光周期不敏感品种)为实验材料，将两个品种的大豆分别种植在16h光照和8h黑暗的条件下直到单叶展开，然后选取生长一致的两个品种的大豆幼苗分别进行短日照(12h光照和12h黑暗)和长日照(16h光照和8h黑暗)处理。
分别提取上述不同光照处理的贡选一号和黑河27不同发育时期各个组织中的总RNA，反转录为cDNA，应用Real-time RT-PCR方法，以GmACTIN为内标基因，检测GmFT在大豆不同发育时期及不同组织中的相对表达量(以表达量最低点的表达量的数值为1，其余时间点的表达量均和最低点的表达量相比较，得出不同时间点的相对表达量)。检测结果如图3-6所示。结果表明，在短日照条件下，随着生殖发育的进行，GmFT在两个大豆品种的叶片和生长点中的表达量均表现为逐渐升高的趋势，在生长点中的表达量峰值要晚于叶片，贡选一号和黑河27在叶片中表达量的峰值分别出现在第19d和第16d，而在生长点中表达量的峰值分别出现在第25d和第19d；且GmFT在黑河27中表达量峰值的出现早于贡选一号，表达量也高于贡选一号，这与在相同条件下黑河27的开花期早于贡选一号约7天时间相吻合，说明在大豆由营养生长向生殖生长的转换过程中，GmFT的表达量有逐渐增高的趋势。
由于GmFT与拟南芥中光周期控制开花的促进因子FT具有很高的同源性，上述实验结果提示大豆中GmFT的表达与运输可能与FT相似，即首先在叶片中诱导表达，然后再运输到生长点发挥开花促进因子的作用。
实施例3、培育开花期提前的转基因拟南芥
1、构建含有GmFT的表达载体
以实施例1构建的含有GmFT全长cDNA的重组表达载体pMD18-GmFT为模板，用含有XbalI和SacI酶切位点的引物M11和M12(其核苷酸序列如序列表中序列11和序列12所示)扩增出含有GmFT完整编码区的片段，回收该片段，连接到pMD18-T载体上，将这个重组表达载体命名为pMD18-T FT。对重组表达载体pMD18-T FT测序，测序结果表明，该重组表达载体上含有GmFT的完整编码区，其5′端和3′端分别含有XbalI和SacI酶切位点。
用HindIII和EcoRI分别双酶切pBI121和pCAMBIA3301(购自澳大利亚CAMBIA公司)，连接pBI121的3kb酶切产物和pCAMBIA3301的11256bp酶切产物，即得到p3301m。
将pMD18-T FT和p3301m同时用XbalI和SacI双酶切，分别回收pMD18-T FT的547bp的小片段和p3301m的12388bp的大片段，用T4DNA连接酶16℃过夜连接。将连接产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上筛选出阳性克隆。提取阳性克隆的质粒DNA，将其命名为p3301m-FT。以重组表达载体p3301m-FT为模板，以M11和M12为引物进行PCR鉴定，同时以质粒p3301m作为负对照。结果在以p3301m-FT为模板的PCR扩增反应中出现了负对照没有的目的基因片段(约550bp)。将p3301m-FT进行测序，测序结果表明，GmFT(自序列1的5′末端第81-611位)已正确连接到p3301m载体上，p3301m-FT的质粒图谱如图7所示。
上述PCR扩增反应的反应体系和反应条件如下：
        试剂                用量
        10×PCR缓冲液            2.5μl
        重组表达载体p3301m-FT    1.0μl
        M11(10.0μM)             0.5μl
        M12(10.0μM)             0.5μl
        dNTP mix(2.5mM)          2.0μl
        Taq酶(5U/μl)            0.2μl
        H2O                      18.3μl
        总计                     25.0μl。
PCR反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃ 45s，55℃，45s，72℃ 45s，35个循环；再72℃延伸10min，16℃保存。
其中，酶切及连接反应均参照《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克编，冷泉港实验室，2001年，第三版)和所用试剂的说明书进行。
2、转基因拟南芥的培育
取1μg上述步骤1制备的p3301m-FT转化根癌农杆菌Gv3101(购自天根生化科技有限公司)感受态细胞，28℃条件下于LB培养基(含利福平50mg/L，庆大霉素25mg/L，卡那霉素50mg/L)上培养两天。挑选阳性克隆，以M11和M12为引物做菌液PCR鉴定，结果均扩增出大小约为500bp的目标条带。
将含有重组表达载体p3301m-FT的农杆菌接种于LB培养基上(含利福平50mg/L，庆大霉素25mg/L，卡那霉素50mg/L)，28℃条件下250rpm振荡培养至OD600值为0.6-0.8，收集菌液置于离心管中，5000rpm离心55min并收集菌体，用MS液体培养基悬浮收集的菌体，使悬浮后菌液的OD600值约为0.6，最后加入Silwet L-77(购自北京五洲元业科贸公司，SL77080596)。
采用沾花浸染法转化哥伦比亚生态型野生型拟南芥(Col-0)，收获该当代转基因拟南芥植株所接的种子(T1代)。在含Bastar(购自日本明治公司)的MS培养基筛选上述种子，Bastar在MS培养基中的浓度为10mg/L。将在上述培养基上成活的T1代幼苗移到培养土中，收获种子(T2代)，然后经相同的筛选过程得到纯合的T3代转基因拟南芥种子。最后将T3代转基因拟南芥种子直接播种到培养土中，对长出的T3代转基因拟南芥植株进行GmFT基因的检测。同时，按照相同的方法得到转入质粒p3301m的T3代转基因拟南芥植株。
3、转基因拟南芥的分子检测
(1)PCR检测目的基因
以上述T3代转基因拟南芥植株的基因组DNA为模板，以M13和M14(其核苷酸序列如序列表中序列13和序列14所示)为引物，进行PCR反应，PCR反应体系同实施例1步骤一。
PCR反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃ 30s，62℃，30s，72℃ 30s，35个循环；再72℃延伸10min，16℃保存。
对上述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。以质粒p3301m-FT为正对照，以转入质粒p3301m的T3代转基因拟南芥植株为负对照，结果如图8所示。其中，M为DL 2000bp的DNA分子量标准，1为正对照，2为水，3为转入质粒p3301m的哥伦比亚生态型拟南芥，4-8为转入质粒p3301m-FT的T3代转基因拟南芥。结果表明在转GmFT基因的拟南芥中有与正对照相同的大小为500bp的目的基因条带，而在负对照中未出现条带。
(2)检测转GmFT基因的拟南芥的开花情况
分别将20粒转入质粒p3301m-FT的T3代转基因拟南芥种子和20粒转入质粒p3301m的T3代转基因拟南芥种子种植在温度为22℃、光周期为16h光照和8h黑暗的长日照人工气候室中，分别统计上述T3代转基因拟南芥的抽苔时间、基生叶和茎生叶的叶片总数，并用半定量RT-PCR方法检测GmFT的表达。
T3代转基因拟南芥的抽苔时间、基生叶和茎生叶的叶片总数统计结果如表2所示，转入质粒p3301m-FT的T3代转基因拟南芥的叶片总数为6.15个叶片，抽苔时间为21.2天；转入质粒p3301m的T3代转基因拟南芥的叶片总数为14.0个叶片，抽苔时间为29.8天。结果表明转入质粒p3301m-FT的T3代转基因拟南芥开花期明显提前，表型鉴定结果如图9所示。其中，Col0为转入质粒p3301m的哥伦比亚生态型拟南芥，1-3为转入质粒p3301m-FT的T3代转基因拟南芥。
提取上述转入质粒p3301m的T3代的哥伦比亚生态型拟南芥Col0、3株表达GmFT的转入质粒p3301m-FT的T3代转基因拟南芥的总RNA，经反转录后得到cDNA，以此cDNA为模板，以M13和M14为引物，以拟南芥的ACTIN基因为内标基因，检测GmFT在拟南芥中的表达。
具体的检测结果如图10所示。其中，Col0为转入质粒p3301m的哥伦比亚生态型拟南芥，1-3为转入质粒p3301m-FT的T3代转基因拟南芥的PCR检测结果。RT-PCR的结果显示，GmFT在转入质粒p3301m的T3代转基因拟南芥中不表达，而在提前开花的转入质粒p3301m-FT的T3代转基因拟南芥中强表达，这表明拟南芥的开花提前和GmFT的过表达有关，说明GmFT具有与FT相似的促进植物开花的功能。
表2转p3301m-FT质粒和转p3301m质粒拟南芥的抽苔时间、基生叶和茎生叶的统计
  拟南芥植株   株系   基生叶   茎生叶   总叶数   总叶平均值   抽苔时间(天数)
  各株系值   平均值
  转P3301m-FT质粒的拟南芥   1   5   1   6   6.15   21   21.2
  2   4   1   5   20
  3   3   1   4   20
  4   4   2   6   21
  5   5   1   6   20
  6   4   1   5   20
  7   4   1   5   20
  8   4   1   5   20
  9   4   1   5   20
  10   5   2   7   20
  11   5   1   6   20
  12   5   1   6   20
  13   5   2   7   20
  14   5   1   6   22
  15   4   1   5   20
  16   6   1   7   20
  17   6   2   8   22
  18   6   2   8   25
  19   7   2   9   26
  20   5   2   7   27
  转P3301m质粒的拟南芥   1   9   1   10   14.0   26   29.8
  2   11   2   13   28
  3   12   2   14   30
  4   13   3   16   27
  5   12   2   14   28
  6   11   3   14   28
  7   10   2   12   28
  8   13   2   15   29
  9   12   2   14   30
  10   11   2   13   30
  11   12   2   14   30
  12   13   2   15   31
  13   10   1   11   32
  14   15   3   18   32
  15   11   1   12   33
  16   12   2   14   32
  17   13   3   16   33
  18   14   1   15   34
  19   13   2   15   26
  20   12   3   15   29
                            序列表
Figure S2008101011050D00131
Figure S2008101011050D00161
Figure S2008101011050D00171

Claims (9)

1.一种蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的cDNA的编码序列如序列表中序列1的自5′末端第81-611位所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的出发载体为p3301m；
所述p3301m是用HindIII和EcoRI分别双酶切pBI121和pCAMBIA3301，连接pBI121的3kb酶切产物和pCAMBIA3301的11256bp酶切产物，即得到p3301m。
6.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。
7.一种培育开花期提前的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入植物中，得到开花期提前的转基因植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物为大豆或拟南芥。
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