CN108103075A

CN108103075A - 一种延缓植物衰老的柳枝稷基因PvC3H29及其应用

Info

Publication number: CN108103075A
Application number: CN201810101487.0A
Authority: CN
Inventors: 徐彬; 谢哲倪; 余国辉; 张敬; 黄炳茹
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2038-02-01
Also published as: CN108103075B

Abstract

本发明提供了一个来源于柳枝稷的能够有效延缓叶片衰老的CCCH家族的基因PvC3H29，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有75％以上同源性，且同样能够编码参与植物衰老调控蛋白的DNA分子。本发明还提供了所述基因PvC3H29在基因工程和植物育种中的应用。本发明所述基因能够延缓植物的衰老，从而能够改善草类性状，提高其光合效率，进而改善其营养价值。

Description

一种延缓植物衰老的柳枝稷基因PvC3H29及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一个CCCH基因在延缓植物衰老中的功能及应用。

背景技术

在叶片衰老过程中，光合能力下降，叶片中的叶绿素和蛋白质等营养物质快速降解。因此，有效延缓叶片衰老，延长植物的绿期，对于作物育种具有重要意义。对于牧草而言，有效延缓叶片衰老，不仅可以改善牧草的外观，还可以有效提高其体内纤维和蛋白质含量等营养品质指标。

柳枝稷(Panicum virgatum L.)属于禾本科(Gramineae)黍属(Panicum)，多年生C₄植物，是北美草原的重要暖季型牧草，近年来作为生物能源作物和水土保持植物被广泛利用。延缓柳枝稷叶片衰老，在改善柳枝稷生物产量的同时，还可以为农作物产量的增长提供参考背景；柳枝稷作为多年生禾本草，为其他多年生禾草植物的衰老研究奠定基础，更有利于改善多年生禾草植物的遗传价值，实用价值，美观价值，从而达到三重效益。

CCCH类锌指蛋白，属于锌指蛋白家族的一类基因。此类蛋白通常含有串联的锌指结合结构域，及CCCH结构域。一个典型的CCCH蛋白，通常具有1-6个CCCH类型的结构域。目前，发现一类CCCH蛋白可以作为转录因子直接结合与DNA上，而另外一类可以直接通过与RNA结合发挥功能。CCCH类锌指蛋白家族已经报到有多种功能，如拟南芥中，AtSZF1和AtSZF2调控胁迫相关基因的表达、HUA1参与控制开花发育的调控、PEI1参与新胚形成、SOMNUS蛋白对光依赖种子发芽的下游蛋白的调控作用等，再如水稻中，基因OsDOS在水稻中的过量表达可以延缓叶片衰老，OsLIC控制水稻叶片和分蘖角度影响水稻结构进而影响稻谷产量等。

发明内容

本发明的目的在于提供一个基因，而此基因能够延缓植物的衰老，从而能够改善草类性状，提高其光合效率，进而改善其营养价值。

基于此目的，本发明提供了一个来源于柳枝稷的能够有效延缓叶片衰老的CCCH家族的基因，该基因含有CCCH类锌指蛋白典型结构域，并命名为PvC3H29.

本发明所述基因PvC3H29的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有75％以上同源性，且同样能够编码参与植物衰老调控蛋白的DNA分子。即凡是与本发明克隆得到CCCH类的如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有75％或者更高同一性且编码类似蛋白产物，均是衍生于本发明所示的核苷酸序列等同于本发明的核苷酸序列。

本发明所述基因PvC3H29的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性，且同样能够编码参与植物衰老调控蛋白的DNA分子。

本发明还提供基因PvC3H29编码的蛋白质。

本发明还提供一种基因PvC3H29编码的蛋白质，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物衰老调控，特别是抑制叶片衰老相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

利用本发明的基因编码的氨基酸序列，可设计和人工添加信号肽序列以有利于在植物中的表达。

利用本发明的基因编码的氨基酸序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于在植物中表达的核酸序列。

本发明还提供一种包括所述基因PvC3H29的重组表达载体。

一种转化体，由所述的重组表达载体导入宿主细胞所得，所述的宿主细胞优选大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

本发明还提供基因PvC3H29或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在基因工程中的应用。

本发明还提供基因PvC3H29或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在延缓植物衰老中的基因工程应用。

本发明还提供基因PvC3H29或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在延缓植物叶片及植株地上部衰老中的基因工程应用。

本发明所述的植物可以包括单子叶植物和双子叶植物，如拟南芥、柳枝稷等。

本发明还提供基因PvC3H29或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在植物育种中的应用。

本发明还提供基因PvC3H29或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在培育抗衰老植物品种中的应用。

本发明所述的基因PvC3H29，是一种植物CCCH基因，其来源于柳枝稷中，属于锌指蛋白家族中的一类蛋白，该蛋白能够参与到植物衰老调控的进程中，能够明显延缓植物的衰老，特别是单子叶植物和双子叶植物，如拟南芥及柳枝稷的衰老，能够叶片衰老及植株地上部的衰老，为植物提高光合效率，改善光能利用率的应用研究奠定了基础，为培养抗衰老基因工程育种提供了优秀的基因资源。

附图说明

图1为转基因拟南芥验证结果；

图2为在黑暗条件下，野生型以及过表达PvC3H29的转基因株系的表型；

图3为自然衰老过程中，野生型以及过表达PvC3H29的转基因拟南芥的表型；

图4为转基因柳枝稷GUS染色图片结果；

图5为转基因柳枝稷PCR鉴定结果；

图6为黑暗处理的条件下，野生型以及过表达PvC3H29柳枝稷的表型；

图7为自然衰老过程中，野生型以及过表达PvC3H29柳枝稷的表型。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，在本发明的保护范围但不限于下述的实施例。若未特殊说明，本实施例所用方法均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，均为市售购买产品。

实施例1

1植物材料

本实验采用的材料有两种，其一为拟南芥。另外一个为柳枝稷，柳枝稷取自南京农业大学草业科学苗圃。

2方法

2.1PvC3H29的克隆

采用PCR的方法，以Alamo柳枝稷为模板，设计上游以及下游两条引物，进行序列扩增。

表1 PvC3H29的克隆所用的引物

F primer	ttgt gaattc ATGATGATGATGGGCGAAGG
		R primer	tataagcttGTTGATGAGATCGGACACC

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应程序

循环数	反应条件
		1	98℃3min
30	98℃30s，64℃20s，72℃1min30s
		1	72℃5min

PCR反应结束之后，经过1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收PCR产物，连接至载体pENTR/D上，并送公司进行测序。

以柳枝稷基因组DNA为模板，通过PCR，最终获得约1.2KB的序列，并将该片段通过EcoR1和HidIII酶切链接到pENTR/D载体中，然后测序，序列如SEQ ID NO.1所示。在https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#中找到该序列，并进行序列比对，氨基酸序列分析结果表明该基因含有保守的CCCH结构域，并命名为PvC3H29(以下该名称简写为PvC3H29)。

2.2表达载体的构建

拟南芥的表达载体的构建：将pENTR-PvC3H29与pEG101载体进行LR重组构建PEG101-PvC3H29。

柳枝稷的表达载体的构建：将pENTR-PvC3H29与pVT1629载体进行LR重组，构建pVT1629-PvC3H29。

2.3拟南芥的遗传转化

将构建好的载体PEG101-PvC3H29采用电转法转入农杆菌AGL1中，以拟南芥作为植物材料，采用蘸花法，将表达载体通过农杆菌侵染法转入拟南芥中。

2.3转基因拟南芥鉴定

待拟南芥生长，收取种子，筛选抗性阳性苗，移栽到土里，通过PCR鉴定对转基因植株进行鉴定，确定转基因苗。PCR鉴定所用引物为表4中的引物。

表4鉴定拟南芥转基因株系所用的PCR引物

F primer	TCAAGGCCAAGAGAAGGTCT
		R primer	TGTGTGGGTGTGAATGTGAG

鉴定结果如图1所示(PC为阳性对照，WT为Wild type，即野生型)，Transgeniclines中有条带的，表明成功获得转基因拟南芥。

2.4转基因拟南芥黑暗处理。

将野生型与转基因拟南芥第四代种子进行播种，待生长约三周后，剪取同一时期的叶片进行离体黑暗处理，拍照时间为0天6天10天。

如图2(其中D代表黑暗处理的天数，WT为野生型，29-1和29-3为转基因型)结果表明，在黑暗处理的条件下，过量表达Pv C3H29能够明显的延缓叶片的衰老。

2.5自然生长状态下，转基因拟南芥的表型

将野生型与转基因拟南芥第四代种子进行播种，观察整个衰老周期，生长4个月时，对转基因拟南芥以及野生型拍照，记录表型。

如图3(OE为over-expression，表示过量表达；Wild type表示野生型)结果表明，过量表达PvC3H29能够显著延缓拟南芥的地上部的自然衰老。

2.6柳枝稷的遗传转化

用柳枝稷的种子进行愈伤诱导，待愈伤生长约两个月的时间，将构建好的载体pVT1629-PvC3H29转到农杆菌中，采用农杆菌介导的方法，浸染愈伤，筛选，分化成苗。

2.7转基因柳枝稷的鉴定

待分化出的阳性苗长大后，利用GUS染色的方法以及PCR鉴定的方法，确定阳性苗。

如图4GUS染色结果(OE line表示过量表达，wild type表示野生型)，GUS染色成功，说明成功获得柳枝稷转基因苗。如图5(WT为wild type，即野生型，Line1-9表示过量表达植株)所示的PCR鉴定结果也表明成功获得柳枝稷转基因苗。

2.8柳枝稷叶片进行离体黑暗处理及自然生长下的衰老状态。

将转基因柳枝稷以及野生型柳枝稷，第一片完全展开叶进行离体黑暗处理，并进行0天，10天，15天的表型记录。观察柳枝稷整个植株的自然生长状态下的衰老情况，并拍照记录表型。

如图6(OE，代表Over-expression，即过量表达；D代表Day，即天数；WT为wildtype，即野生型，)结果表明，在黑暗条件下，过量表达PvC3H29能够延缓柳枝稷离体叶片的衰老。如图7(OE，代表过量表达；wild type，即野生型)结果表明，过量表达PvC3H29也能够延缓柳枝稷的自然衰老。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种延缓植物衰老的柳枝稷基因PvC3H29及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1283

<212> DNA

<213> 柳枝稷(Panicum virgatum)

<400> 1

atgatgatga tgggcgaagg cgtgagcgtc ccgccgtggt cgcaccacct cccggtgagc 60

ggcgtcgacg tcggaggcgg caccaccggc ggcgacgaga tgacgccgta cctgctgtcg 120

gcgctgcatc agtacctgcc gtgcaacgac gccggcgcag gcgccgacga cgacgaggcg 180

gcggccgcgg cggcgatggc ggccggcgtc gacgggtacg gctccgacga gttccgcatg 240

tacgagttca aggtccggcg gtgcgcgcgc gcccgcagcc acgactggac cgagtgcccc 300

ttcgcgcacc cgggggagaa ggcgcgccgc cgggacccgc gcaagtacca ctactccggc 360

accgcctgcc cggacttccg caagggcggg tgcaagcgcg gggacgcctg cgagttcgcg 420

cacggcgtct tcgagtgctg gctccacccg gcgcgctacc gcacccagcc ctgcaaggac 480

ggcactgcct gccgccgccg cgtctgcttc ttcgcccaca ccccggacca gctgcgcgtg 540

ctcccggcgc agcagtccag ccccaggggc gccgccgccg cggcctcgcc gctcgccgag 600

tcctacgacg gctccccgct gcggcgccag gcgttcgaga gctacctcac caagagcatc 660

atgtcgtcct cgcccaccag caccctcatg tcgccgccca agtcgccccc gtcggagtcc 720

ccgccattgt cgccggacgg cgccgccgcc gccttccgcc gcggctcctg gccgggcgtc 780

gggtccccgg tgaacgaggt gctcgcctcg ctgcgccagc tccgcctcag caaggccaac 840

tcgtcccctg ccggcgggtg gtccggctac ccgtccgccg tcgcgtacgg atcgcccacg 900

gcgaccgggc tctacagcct gccctcgacc ccgacgacca tgggcggcta catggccaac 960

ctggagccgc ttgatgtctc cttcggcggc ggcgaggagg agcccgtgca gagggtggag 1020

tctgggcgag ctctccgcgc taaggtgttc gagaggctga gcagggaggg cgccgtctcc 1080

ggcgacgcca cggccgcaat cggaggcccc gacgtggggt gggtgtccga tctcatcaac 1140

aagcttacta gtgtcgacaa gggtgggcgc gccgacccag ctttcttgta caaagttggc 1200

attataagaa agcattgctt atcaatttgt tgcaacgaac aggtcactat cagtcaaaat 1260

aaaatcatta tttgccatcc agc 1283

<210> 2

<211> 370

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Met Met Met Gly Glu Gly Val Ser Val Pro Pro Trp Ser His His

1 5 10 15

Leu Pro Val Ser Gly Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Thr Gly Gly Asp

20 25 30

Glu Met Thr Pro Tyr Leu Leu Ser Ala Leu His Gln Tyr Leu Pro Cys

35 40 45

Asn Asp Ala Gly Ala Gly Ala Asp Asp Asp Glu Ala Ala Ala Ala Ala

50 55 60

Ala Met Ala Ala Gly Val Asp Gly Tyr Gly Ser Asp Glu Phe Arg Met

65 70 75 80

Tyr Glu Phe Lys Val Arg Arg Cys Ala Arg Ala Arg Ser His Asp Trp

85 90 95

Thr Glu Cys Pro Phe Ala His Pro Gly Glu Lys Ala Arg Arg Arg Asp

100 105 110

Pro Arg Lys Tyr His Tyr Ser Gly Thr Ala Cys Pro Asp Phe Arg Lys

115 120 125

Gly Gly Cys Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Phe Ala His Gly Val Phe

130 135 140

Glu Cys Trp Leu His Pro Ala Arg Tyr Arg Thr Gln Pro Cys Lys Asp

145 150 155 160

Gly Thr Ala Cys Arg Arg Arg Val Cys Phe Phe Ala His Thr Pro Asp

165 170 175

Gln Leu Arg Val Leu Pro Ala Gln Gln Ser Ser Pro Arg Gly Ala Ala

180 185 190

Ala Ala Ala Ser Pro Leu Ala Glu Ser Tyr Asp Gly Ser Pro Leu Arg

195 200 205

Arg Gln Ala Phe Glu Ser Tyr Leu Thr Lys Ser Ile Met Ser Ser Ser

210 215 220

Pro Thr Ser Thr Leu Met Ser Pro Pro Lys Ser Pro Pro Ser Glu Ser

225 230 235 240

Pro Pro Leu Ser Pro Asp Gly Ala Ala Ala Ala Phe Arg Arg Gly Ser

245 250 255

Trp Pro Gly Val Gly Ser Pro Val Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Arg

260 265 270

Gln Leu Arg Leu Ser Lys Ala Asn Ser Ser Pro Ala Gly Gly Trp Ser

275 280 285

Gly Tyr Pro Ser Ala Val Ala Tyr Gly Ser Pro Thr Ala Thr Gly Leu

290 295 300

Tyr Ser Leu Pro Ser Thr Pro Thr Thr Met Gly Gly Tyr Met Ala Asn

305 310 315 320

Leu Glu Pro Leu Asp Val Ser Phe Gly Gly Gly Glu Glu Glu Pro Val

325 330 335

Gln Arg Val Phe Glu Arg Leu Ser Arg Glu Gly Ala Val Ser Gly Asp

340 345 350

Ala Thr Ala Ala Ile Gly Gly Pro Asp Val Gly Trp Val Ser Asp Leu

355 360 365

Ile Asn

370

Claims

1.柳枝稷基因PvC3H29，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有75％以上同源性，且同样能够编码参与植物衰老调控蛋白的DNA分子。

2.权利要求1所述基因PvC3H29编码的蛋白质。

3.权利要求2所述的蛋白质，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或SEQ IDNO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物衰老调控，特别是抑制叶片衰老相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

4.一种包括权利要求1所述基因PvC3H29的重组表达载体。

5.一种转化体，其特征在于由权利要求4所述的重组表达载体导入宿主细胞所得，所述的宿主细胞优选大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

6.权利要求1所述基因PvC3H29、权利要求2或3所述的蛋白质、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的转化体在基因工程中的应用。

7.权利要求1所述基因PvC3H29、权利要求2或3所述的蛋白质、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的转化体在延缓植物衰老中的基因工程应用。

8.权利要求1所述基因PvC3H29、权利要求2或3所述的蛋白质、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的转化体在延缓植物叶片及植株地上部衰老中的基因工程应用。

9.权利要求1所述基因PvC3H29、权利要求2或3所述的蛋白质、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的转化体在植物育种中的应用。

10.权利要求1所述基因PvC3H29、权利要求2或3所述的蛋白质、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的转化体在培育抗衰老植物品种中的应用。