CN114395023B

CN114395023B - 小桐子早花基因JcRR1B及其应用

Info

Publication number: CN114395023B
Application number: CN202210119002.7A
Authority: CN
Inventors: 吴平治
Original assignee: Pomology Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Pomology Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-01-27
Filing date: 2022-02-08
Publication date: 2022-12-13
Anticipated expiration: 2042-02-08
Also published as: CN114395023A

Abstract

本发明公开了小桐子早花基因JcRR1B及其应用。本发明提供了一种小桐子MYB‑related转录因子基因JcRR1B。构建JcRR1B基因的过表达载体，经过农杆菌介导的遗传转化，将过表达载体转入野生型拟南芥，能够明显促进转基因拟南芥提前开花及增大叶片。JcRR1B基因可应用于作物的基因工程遗传育种，培育早花的作物品种，缩短育种周期；JcRR1B基因对于其它作物的叶片光合能力的研究也具有重要的参考意义。

Description

小桐子早花基因JcRR1B及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及小桐子早花基因JcRR1B及其应用。

背景技术

小桐子(Jatropha curcas L.)属于大戟科麻疯树属大灌木或小乔木，树高2～5m，原产于美洲热带，现广泛分布于全球热带地区。它具有种子含油率高，耐干旱贫瘠，易繁殖，生长周期短等特点。被广泛应用于医药、化工等行业，特别是生物能源产业，具有重要的经济价值。

花器官的出现是植物从营养生长进入到生殖生长的标志，该过程是一个由遗传因子和环境因子协同调节的复杂过程。开花时间是关键的农艺性状，对植物产量和品质有着重要影响，因此，研究植物开花时间的调控对农业生产发展意义重大。器官大小是重要的生物学及农业性状，而叶片大小主要由细胞增殖与细胞扩张这两个紧密联系的生物学过程所决定。叶片作为最主要的光合器官及人类有机物的最初来源，有关叶片大小的调控机制一直都是生物学研究中的热门领域。小桐子作为一种重要的油料植物，生长周期短，具有重要的经济价值，可以作为一种挖掘植物优质基因资源的研究对象进行深入研究。

MYB转录因子是目前植物中发现的最大的转录因子类群之一。根据MYB转录因子的保守区域和重复序列，可以将其分为四类：R2R3-MYB、R1R2R3-MYB、MYB-related和AtypicalMYB。MYB转录因子调节叶片发育，地上部分形态建成；调节下胚轴伸长生长，花粉管分化，调节果聚糖合成，调节黄酮类合成，参与苯丙氨酸、苯丙素代谢，调节木质素含量和木材形成等。涉及到植物生长发育、次生物质代谢、植物激素信号转导及非生物胁迫抗性等各个方面。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小桐子MYB-related转录因子基因(即JcRR1B基因)及其应用。

本发明采用对小桐子MYB家族基因分析的方法，筛选得到MYB-related转录因子基因JcRR1B。JcRR1B基因的开放阅读框序列如SEQ ID NO.1所示，其阅读框全长为903bp，编码300个氨基酸，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，其用于构建转基因过表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。通过遗传转化过表达JcRR1B基因的质粒，使JcRR1B基因在拟南芥转基因株系中的表达量上升，观察过表达JcRR1B植株开花情况，发现过表达JcRR1B使拟南芥开花时间提前约4天，营养生长时间缩短1/5；过表达JcRR1B拟南芥莲座叶叶片面积增大，扫描电镜观察结果显示是由于细胞增大引起的；JcRR1B基因在调控植物开花时间、叶片细胞大小方面起到了非常重要的作用。

因此，本发明的第一个目的是提供一种小桐子MYB-related转录因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

应当理解，在不影响上述的小桐子MYB-related转录因子(JcRR1B蛋白)结构和活性的前提下，本领域技术人员可对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和(或)缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的蛋白。

本发明的第二个目的是提供所述的小桐子MYB-related转录因子的编码基因。

优选，所述的小桐子MYB-related转录因子的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供一种含有所述的小桐子MYB-related转录因子的编码基因的重组表达载体。

优选，所述的表达载体为pCAMBIA1301+p35S/rbcs-T载体。

本发明还提供所述的小桐子MYB-related转录因子或其编码基因在调控植物花期和/或营养生长期叶片大小中的应用。

优选，所述的应用，为过表达所述的小桐子MYB-related转录因子在提早植物开花中的应用。

优选，所述的应用，为过表达所述的小桐子MYB-related转录因子在增大营养生长期植物叶片中的应用。

优选，所述的应用，所述的增大营养生长期植物叶片是通过增大细胞大小实现的。

本发明的优点和效果：

1.成功克隆了小桐子JcRR1B基因并进一步证明了JcRR1B参与调控植物开花时间及叶片大小，对于全面理解植物中JcRR1B转录因子的生物学功能具有重要的意义。

2.通过转基因的方法对JcRR1B基因进行过表达，伴随着JcRR1B基因的表达量提高，拟南芥开花时间提前。因此本发明可应用于农作物的基因工程遗传育种，培育早花的作物品种，缩短育种周期。

3.叶片作为主要的光合作用器官，其大小与受光面积和总光合能力正相关，JcRR1B基因在调控叶片及细胞大小方面的生物学功能的验证，对于其它作物的叶片光合能力的研究具有重要的参考意义。

附图说明

图1是过表达JcRR1B基因所用的pCAMBIA1301+p35S/rbcs-T载体图谱。

图2是过表达JcRR1B基因的载体酶切检测；其中：泳道1为Kpn I+Sal I酶切结果；泳道2为EcoR I+Sal I酶切结果；泳道3为Kpn I+HindIII酶切结果。

图3是野生型和过表达JcRR1B拟南芥的半定量检测及开花表型。

图4是野生型和过表达JcRR1B拟南芥开花时间统计。

图5是野生型和过表达JcRR1B拟南芥莲座叶片及表皮细胞表型。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：JcRR1B基因的过表达载体的构建和遗传转化

1.JcRR1B的克隆

本发明所用的过表达载体是本实验室构建的pCAMBIA1301+p35S/rbcs-T，插入JcRR1B片段(图1)，得到JcRR1B的过表达载体。JcRR1B的过表达载体的构建步骤如下：以小桐子各组织(根、茎和叶)混合的cDNA为模板，根据JcRR1B的序列设计上游引物：5’-AAGGTACCATGATTGCGGATGAAGCAGACT-3’和下游引物5’-GCGTCGACCATTTTGCAGCTAAACCATGTATAT-3’，经PCR扩增后获得一个含JcRR1B编码序列的片段(927bp，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示)。用双酶切(Kpn I和Sal I)的方法将该PCR扩增片段连接于pCAMBIA1301+p35S/rbcs-T载体上。反应体系：双酶切后载体和PCR扩增片段分别取2μL和6μL、T4连接酶1μL、10×T4连接酶缓冲液1μL，总体积10μL，16℃连接4h。取5μL连接产物42℃热击转化大肠杆菌DH5α，加1mL LB液体培养基，37℃复苏45min，涂于含Kan的LB平板，37℃过夜。挑取单克隆，于含有Kan的液体LB培养基中37℃培养，菌液PCR及测序鉴定正确的单克隆，并提取正确克隆的质粒，酶切检测正确(图2)即为过表达载体pCAMBIA1301+35S-JcRR1B。经测序分析，该接入片段含有903bp的阅读框，我们将该阅读框对应的基因命名为JcRR1B，该基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为903bp；其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，300个氨基酸。

2.过表达JcRR1B基因的遗传转化

采用农杆菌GV3101介导的遗传转化方法，浸染野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana，Col-0)的花序，将过表达载体pCAMBIA1301+35S-JcRR1B转化至野生型拟南芥中，利用潮霉素抗性筛选阳性转基因植株，经过PCR鉴定后获得阳性植株。单株收种，T3获得过表达JcRR1B拟南芥纯合株系。未转基因的野生型拟南芥作为对照。

实施例2：过表达JcRR1B拟南芥和野生型拟南芥开花时间比较

将野生型拟南芥种子(WT)和过表达JcRR1B拟南芥纯合体种子(OE1、OE2、OE3共三个株系)进行表面消毒，播种到1/2MS培养基上，4℃放置两天，然后把培养基放到22±2℃、16h光照(60μmol·m²·s)/8h黑暗循环的温室中，7天后选取长势一致的幼苗移至营养土：蛭石＝3:1的混合基质中，在上述培养条件下观察植株表型。观察过表达JcRR1B植株开花情况并统计开花植株数比例(n＝30)，结果发现，过表达JcRR1B使植株开花时间显著提前(图3)。表达量较高的两个株系(OE2、OE3)21天开始抽苔，在22天的时候已有超过20％的植株抽苔，25天时已基本全部开花；而野生型从25天开始抽苔，29天时才基本全部开花(图4)。这些结果表明，过表达JcRR1B使拟南芥开花时间提前约4天，营养生长时间缩短1/5，同时植株开花时间提前天数与JcRR1B在拟南芥中的表达量呈正比。

实施例3：过表达JcRR1B拟南芥和野生型拟南芥叶片及细胞大小比较

在观察植株表型时发现，过表达JcRR1B的拟南芥植株莲座叶叶片面积增大。为确认此变化是由于细胞大小的变化还是细胞数目的变化引起的，利用扫描电镜观察了生长22天的野生型拟南芥和过表达JcRR1B拟南芥植株(OE3)相同叶位的叶片表皮细胞大小。扫描电镜结果显示(图5)过表达JcRR1B植株叶片上表皮和下表皮细胞均大于野生型，表明过表达JcRR1B植株叶片变大是由于细胞增大引起的。

序列表

<110> 广东省农业科学院果树研究所

<120> 小桐子早花基因JcRR1B及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 903

<212> DNA

<213> 小桐子(Jatropha curcas L.)

<400> 1

atgattgcgg atgaagcaga ctgcagctct gtgtggacta gggagcagga taaggcattt 60

gaggatgccc ttgcaacata tcctgaggat gctgtagatc ggtgggagaa aattgctgct 120

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gcaccaatga tgaacatggg tcctatggca tatccaatgc caccgacaac tgctcatagg 900

tga 903

<210> 2

<211> 300

<212> PRT

<213> 小桐子(Jatropha curcas L.)

<400> 2

Met Ile Ala Asp Glu Ala Asp Cys Ser Ser Val Trp Thr Arg Glu Gln

1 5 10 15

Asp Lys Ala Phe Glu Asp Ala Leu Ala Thr Tyr Pro Glu Asp Ala Val

20 25 30

Asp Arg Trp Glu Lys Ile Ala Ala Asp Val Pro Gly Lys Thr Leu Glu

35 40 45

Glu Leu Lys Leu His Tyr Glu Leu Leu Val Glu Asp Leu Asn Gln Ile

50 55 60

Glu Ala Gly Cys Val Pro Leu Pro Asn Tyr Ser Ser Met Glu Gly Ser

65 70 75 80

Ile Ser Gln Ala Gly Asp Glu Gly Thr Thr Lys Lys Gly Gly Gln Met

85 90 95

Gly His His Asn Ser Glu Ser Thr His Gly Asn Lys Ala Ser Arg Ser

100 105 110

Asp Gln Glu Arg Arg Lys Gly Ile Ala Trp Thr Glu Asp Glu His Arg

115 120 125

Leu Phe Leu Leu Gly Leu Asp Lys Tyr Gly Lys Gly Asp Trp Arg Ser

130 135 140

Ile Ser Arg Asn Phe Val Val Thr Arg Thr Pro Thr Gln Val Ala Ser

145 150 155 160

His Ala Gln Lys Tyr Phe Ile Arg Leu Asn Ser Met Asn Lys Asp Arg

165 170 175

Arg Arg Ser Ser Ile His Asp Ile Thr Ser Val Gly Asn Gly Asp Ile

180 185 190

Ser Ala Pro Gln Gly Pro Ile Thr Gly Gln Thr Asn Gly Ser Ala Ala

195 200 205

Gly Gly Ser Ser Gly Lys Ala Ala Lys Gln Pro Pro Gln His Pro Thr

210 215 220

Gly Pro Pro Gly Val Gly Val Tyr Gly Pro Pro Thr Ile Gly Gln Pro

225 230 235 240

Ile Gly Gly Pro Leu Val Ser Ala Val Gly Thr Pro Val Asn Leu Pro

245 250 255

Ala Pro Ala His Met Ala Tyr Gly Val Arg Ala Pro Val Pro Gly Thr

260 265 270

Val Pro Gly Ala Val Val Pro Gly Ala Pro Met Met Asn Met Gly Pro

275 280 285

Met Ala Tyr Pro Met Pro Pro Thr Thr Ala His Arg

290 295 300

<210> 3

<211> 927

<212> DNA

<213> 小桐子(Jatropha curcas L.)

<400> 3

atgattgcgg atgaagcaga ctgcagctct gtgtggacta gggagcagga taaggcattt 60

gaggatgccc ttgcaacata tcctgaggat gctgtagatc ggtgggagaa aattgctgct 120

gatgttcctg ggaaaacctt agaagagctt aaacttcact atgaacttct ggttgaagat 180

ttgaatcaga ttgaagctgg ctgtgtgcct ctgcctaact actcttctat ggagggttca 240

ataagccaag ctggcgatga aggaactact aagaagggtg gtcaaatggg gcaccataac 300

agtgagtcta ctcatggaaa taaggcttca aggtcagatc aagaacgccg taaaggaatc 360

gcttggacag aggatgagca caggttattt cttcttggtt tggacaaata tgggaaaggt 420

gactggcgaa gtatttccag aaactttgtt gtgacaagga cacctacgca agtggcaagc 480

catgcacaaa aatatttcat tcgtttgaac tcgatgaaca aagataggag gcgttccagc 540

attcatgata tcaccagtgt tggcaatgga gatatttcag cgccacaagg accaataact 600

ggtcaaacaa atggttctgc tgcaggaggt tcctctggta aagctgctaa acaaccccct 660

caacacccta ctggacctcc aggagttggt gtttatggtc ctccgactat agggcaacct 720

ataggaggtc cccttgtctc agcagttggc acccctgtga atcttcctgc ccctgcacac 780

atggcttatg gcgttagagc tcctgtacca ggaacagtac cgggagctgt ggttcctggt 840

gcaccaatga tgaacatggg tcctatggca tatccaatgc caccgacaac tgctcatagg 900

tgatatacat ggtttagctg caaaatg 927

Claims

1.过表达小桐子MYB-related转录因子在提早植物开花中的应用，所述的小桐子MYB-related转录因子的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.过表达小桐子MYB-related转录因子在增大营养生长期植物叶片中的应用，所述的小桐子MYB-related转录因子的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的增大营养生长期植物叶片是通过增大细胞大小实现的。