CN109627305B - 编码OsbHLH116蛋白的基因、重组载体、重组菌在调控水稻株型方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及编码OsbHLH116蛋白的基因、重组载体、重组菌在调控水稻株型方面的应用，属于基因工程技术领域。本发明对于水稻OsbHLH116基因序列进行优化，获得了无SacI酶切位点的OsbHLH116优化基因，将其与pTCK303载体连接获得OsbHLH116‑OX表达载体，利用农杆菌介导法将该载体转化水稻品种日本晴，筛选获得转基因阳性植株。试验中发现，与野生型日本晴相比转基因株系成熟期株高和叶夹角显著减小，株型紧凑，表明OsbHLH116基因参与调控水稻株高和叶夹角的水稻株型。因此，该基因在水稻株型建成中具有重要作用，在塑造和培育理想株型水稻新品种上具有潜在应用价值。

Description

编码OsbHLH116蛋白的基因、重组载体、重组菌在调控水稻株 型方面的应用

技术领域

本发明涉及编码OsbHLH116蛋白的基因、重组载体、重组菌在调控水稻株型方面的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界重要的粮食作物之一，全世界有一半以上人口以稻米为主食。随着世界人口持续增长，耕地面积不断减少，粮食安全问题日益凸显。因此，培育高产、稳产、优质和抗病水稻新品种，提高水稻产量对维护和保障我国粮食安全具有重要战略意义。

水稻株型指水稻的形态特征及空间排列方式，水稻株型是决定水稻产量的主要因素之一，塑造水稻理想株型是提高水稻产量的重要途径。20世纪50年代开始“矮化育种”绿色革命，其主要思路是把水稻的高秆变矮秆；1968年，Donald比较系统地提出作物理想株型(plant ideotype)概念，作物株型育种受到育种工作者的广泛重视；20世纪70年代，日本学者松岛省三则提出培育理想型稻；我国水稻学者杨守仁认为水稻理想株型应符合耐肥抗倒、生长量大、谷草比高三大特点。水稻理想株型性状主要包括株高、分蘖数、穗型、叶型、叶夹角和分蘖角等。发掘和鉴定控制株高和叶夹角的新基因，有助于丰富水稻高产育种的理论基础。

水稻株高是产量性状中最重要的农艺性状之一，是水稻理想株型必选的关键因素。株高是呈连续分布的数量性状，受多个主效基因和若干微效基因所调控(Ishimaru K,Ono K,Kashiwagi T.Identification of a new gene controlling plant height inrice using the candidate-gene strategy[J].Planta,2004,218(3):388-395)。研究表明，水稻株高与油菜素内酯(BR)、赤霉素(GA)和独脚金内酯(SL)有关，多数株高调控基因参与上述三种激素信号转导。OsBZR1参与BR信号转导，干扰OsBZR1表达使水稻植株BR敏感性降低，株高变矮，叶片变窄及直立(Bai M Y,Zhang L Y,Gampala S S,et al.Functions ofOsBZR1 and 14-3-3 proteins in brassinosteroid signaling in rice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica,2007,104(34):13839-13844)；GID1可介导GA信号转导，GID1基因突变体植株出现矮化表型(Ueguchitanaka M,Ashikari M,Nakajima M,et al.GIBBERELLIN INSENSITIVEDWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin.[J].Nature,2005,437(7059):693-698)。

叶夹角是叶片与直立茎之间的倾斜角度，是单子叶植物的一个重要农艺性状，是影响植株株型和产量的重要因素之一(Sinclair T R,Sheehy J E.Erect leaves andphotosynthesis in rice[J].Science,1999,283(5407):1455)。袁隆平提出超高产水稻剑叶、倒二叶和倒三叶叶片开张角度分别为5°、10°和20°左右(袁隆平.杂交水稻超高产育种[J].杂交水稻,1997,12(6):1-6)。超级稻协优9308剑叶、倒二叶和倒三叶叶夹角分别不超过10°、20°和30°(王熹,陶龙兴,俞美玉,等.超级杂交稻协优9308生理模型的研究[J].中国水稻科学,2002,16(1):38-44)。水稻叶夹角是由多种激素和多种类型基因协同调控的。BR合成相关基因功能缺失突变体brd1、brd2、d2、d11和dwarf4均表现出叶片直立表型，表明BR缺失可使水稻叶夹角减小；生长素(IAA)可通过与BR协同作用调控水稻叶夹角；GA在调控水稻叶夹角方面也发挥重要作用，并表现出与BR信号的相互作用(Luo X,Zheng J,Huang R,et al.Phytohormones signaling and crosstalk regulating leaf angle in rice[J].Plant Cell Reports,2016,35(12):1-11)。LAX编码一个bHLH转录因子，在水稻中异位表达LAX可使叶夹角增大(Komatsu K,Maekawa M,Ujiie S,et al.LAX and SPA:Majorregulators of shoot branching in rice[J].Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America,2003,100(20):11765-11770)；WRKY家族转录因子基因OsWRKY11突变体在苗期和成株期均表现出所有叶片叶夹角增大的表型(Wang D,Zhang H,Hu G,et al.Genetic analysis and identification of a largeleaf angles(lla)mutant in rice[J].Chinese Science Bulletin,2005,50(05):110-112)；OsLG1编码一个含有SBP结构域的转录因子，其功能缺失突变体由于不能形成叶耳、叶舌和叶节而出现直立叶的表型(Takashige I,Koji N,Kotaro M,et al.OsLG1 regulatesa closed panicle trait in domesticated rice[J].Nature Genetics,2013,45(4):462-465)；ILA1基因突变体叶夹角普遍增大(Ning J,Zhang B,Wang N,et al.Increasedleaf angle 1,a Raf-like MAPKKK that interacts with a nuclear protein family,regulates mechanical tissue formation in the lamina joint of rice[J].PlantCell,2011,23(12):4334-4347)；LPA1可通过控制叶枕处近轴面细胞生长来影响叶夹角大小(Wu X,Tang D,Li M,et al.Loose plant architecture1,an indeterminate domainprotein involved in shoot gravitropism,regulates plant architecture in rice[J].Plant Physiology,2013,161(1):317-329)。综上，水稻叶夹角是受多种类型基因协调控制的，其调节机制具有复杂性，因此，进一步完善水稻叶夹角的调控机理，有助于培育和改善水稻株型，为提高水稻产量提供理论依据。

碱性-螺旋-环-螺旋(basic-helix-loop-helix,bHLH)转录因子家族广泛存在于动物和植物中。bHLH蛋白结构域高度保守，由大约60个氨基酸组成，包括N端的碱性区域和C端的螺旋-环-螺旋区域，其中碱性区域主要负责与DNA上的顺式作用元件E-box(5′-CANNTG-3′)结合(Massari M E,Murre C.Helix-loop-helix proteins:regulators oftranscription in eucaryotic organisms.[J].Molecular&Cellular Biology,2000,20(2):429-440)。作为植物中第二大转录因子家族，拟南芥中有162个bHLH转录因子，而水稻中包含167个bHLH转录因子(Li X,Duan X,Jiang H,et al.Genome-wide analysis ofbasic/helix-loop-helix transcription factor family in rice and Arabidopsis.[J].Plant Physiology,2006,141(4):1167-1184)。水稻中，bHLH家族转录因子在冷胁迫响应(Wang Y J,Zhang Z G,He X J,et al.A rice transcription factor OsbHLH1 isinvolved in cold stress response[J].Theoretical&Applied Genetics,2003,107(8):1402-1409)，低磷胁迫响应(Yi K,Wu Z,Zhou J,et al.OsPTF1,a novel transcriptionfactor involved in tolerance to phosphate starvation in rice.[J].PlantPhysiology,2005,138(4):2087-2096)，干旱胁迫响应(Li J,Han Y,Liu L,et al.qRT9,aquantitative trait locus controlling root thickness and root length in uplandrice.[J].Journal of Experimental Botany,2015,66(9):2723)，光形态建成与光信号转导(Zhou J J,Liu QQ,Zhang F,et al.Overexpression of OsPIL15,aphytochromeinteracting factor-like protein gene,represses etiolated seedlinggrowth in rice[J].Journal of integrative plant biology,2014,56(4):373-387)和激素信号转导(Ju-Seok S,Joungsu J,Min-Jeong K,et al.OsbHLH148,a basic helix-loop-helix protein,interacts with OsJAZ proteins in a jasmonate signalingpathway leading to drought tolerance in rice[J].Plant Journal,2011,65(6):907-921)等方面发挥着重要作用。

公布号为CN107400670A的中国发明专利申请中公开了一种控制水稻种子萌发的OsbHLH116基因及蛋白，根据OsbHLH116基因编码序列设计RNAi干扰片段，小干扰片段和载体pTCK303经一次酶切和连接获得OsbHLH116-RNAi表达载体。经菌落PCR验证后利用农杆菌介导法转化水稻品种新丰2号，利用GUS染色筛选获得转基因阳性植株。通过qRT-PCR对RNAi转基因株系中OsbHLH116基因表达量验证，结果显示OsbHLH116基因表达极显著降低，表明所设计的RNA干扰片段对OsbHLH116基因成功发挥干扰作用。与野生型新丰2号相比，OsbHLH116-RNAi株系种子萌发率显著降低，表明低表达OsbHLH116基因可调控水稻种子萌发。但是其未进一步研究高表达OsbHLH116基因在水稻中的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种编码OsbHLH116蛋白的基因在调控水稻株型方面的应用，提供了塑造和培育株高和叶夹角相关的水稻理想株型的新思路。

本发明还提供了含上述编码OsbHLH116蛋白的基因的重组载体在调控水稻株型方面的应用，提供了塑造和培育株高和叶夹角相关的水稻理想株型的新思路。

本发明还提供了含上述编码OsbHLH116蛋白的基因的重组菌在调控水稻株型方面的应用，提供了塑造和培育株高和叶夹角相关的水稻理想株型的新思路。

本发明还提供了一种改良水稻株型的方法，提供了一种新的塑造和培育株高和叶夹角相关的水稻理想株型的新方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

编码OsbHLH116蛋白的基因在调控水稻株型方面的应用，所述OsbHLH116蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，或者具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或添加而形成的氨基酸序列。

本发明中发现OsbHLH116蛋白可以调控水稻的株高和/或叶夹角，高表达OsbHLH116基因的转基因水稻与野生型水稻相比株高显著降低，其降幅最大可达27.62％，而剑叶叶夹角则极显著减小，减小幅度在75.80％-79.26％之间。株高的降低和叶夹角的减小使OsbHLH116转基因株系相对于野生型株型更为紧凑，株型紧凑可使水稻更适宜密植，从而提高水稻产量。因此，编码OsbHLH116蛋白的基因可以用于调控水稻株型。

进一步的，所述编码OsbHLH116蛋白的基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或者所述编码OsbHLH116蛋白的基因由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经密码子优化得到。如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列及其密码子优化得到的序列可以编码OsbHLH116蛋白，进而起到调控水稻株型的作用。

进一步的，所述具编码OsbHLH116蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。原始OsbHLH116基因编码序列中含有SacI酶切位点，当与pTCK303载体通过KpnI/SacI酶切连接时，该酶切位点会影响后续的操作，故根据水稻密码子偏好性，在保证编码氨基酸序列不变的前提下，优化消除了OsbHLH116基因中的SacI酶切位点，优化后编码序列如SEQ IDNO.3所示。

进一步的，所述调控水稻株型为调控水稻的株高和/或叶夹角性状。超表达OsbHLH116基因转基因水稻株高降低，叶夹角减小，株型变得紧凑，因此编码OsbHLH116蛋白的基因可以调控水稻的株高和/或叶夹角性状。

含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组载体在调控水稻株型方面的应用，所述OsbHLH116蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，或者具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或添加而形成的氨基酸序列。重组载体中含有能够编码OsbHLH116蛋白的基因，因此可以用于调控水稻株型。

含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组菌在调控水稻株型方面的应用，所述OsbHLH116蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，或者具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或添加而形成的氨基酸序列。重组菌中含有能够编码OsbHLH116蛋白的基因，而OsbHLH116基因可以调控水稻的株高和叶夹角性状，因此可以用于调控水稻株型。

一种改良水稻株型的方法，包括：将编码OsbHLH116蛋白的基因导入水稻中，得到转基因水稻；所述OsbHLH116蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，或者具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或添加而形成的氨基酸序列。

本发明改良水稻株型的方法可以将调控水稻株型的基因导入水稻中，获得株高低、叶夹角小、株型紧凑的水稻植株。

进一步的，上述的方法包括以下步骤：

1)将编码OsbHLH116蛋白的基因克隆到表达载体中，构建重组载体；所述OsbHLH116蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，或者具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或添加而形成的氨基酸序列；

2)将重组载体转化农杆菌，构建重组菌；

3)将重组菌侵染水稻愈伤组织，培养后筛选得到转基因水稻。

该方法能够简便、快捷的得到株高低、叶夹角小、株型紧凑的水稻植株。

进一步的，步骤1)所述编码OsbHLH116蛋白的基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或者所述编码OsbHLH116蛋白的基因由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经密码子优化得到。

如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列及其密码子优化得到的序列可以编码OsbHLH116蛋白，进而起到调控水稻株型的作用。

进一步的，所述编码OsbHLH116蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为优化后的内部不含SacI酶切位点的OsbHLH116基因，更便于后续的操作。

附图说明

图1为本发明中所构建的OsbHLH116-OX表达载体结构示意图；

图2为本发明改良水稻株型的方法的实施例1中载体构建中菌落PCR琼脂糖凝胶电泳检测图；

图3为本发明试验例1中转基因植株中OsbHLH116基因表达量琼脂糖凝胶电泳检测图；

图4为本发明试验例1中野生型日本晴和OsbHLH116-OX株系成熟期株型比较图；

图5为本发明试验例1中野生型日本晴和OsbHLH116-OX株系株高统计结果图；

图6为本发明试验例1中野生型日本晴和OsbHLH116-OX株系叶夹角比较图；

图7为本发明试验例1中野生型日本晴和OsbHLH116-OX株系叶夹角统计结果图；

图8为本发明试验例2中野生型日本晴和OsbHLH116-FLAG株系成熟期株型比较图；

图9为本发明试验例2中野生型日本晴和OsbHLH116-FLAG株系株高统计结果图；

图10为本发明试验例2中野生型日本晴和OsbHLH116-FLAG株系叶夹角统计结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

编码OsbHLH116蛋白的基因在调控水稻株型方面的应用的实施例1

本实施例编码OsbHLH116蛋白的基因在调控水稻株型方面的应用中所述OsbHLH116蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述编码OsbHLH116蛋白的基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

编码OsbHLH116蛋白的基因在调控水稻株型方面的应用的实施例2

本实施例编码OsbHLH116蛋白的基因在调控水稻株型方面的应用中所述OsbHLH116蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述编码OsbHLH116蛋白的基因具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，为OsbHLH116优化基因。其获得过程如下：通过水稻基因组注释数据库Rice Genome Annotation Project http://rice.plantbiology.msu.edu/)查找OsbHLH116基因(LOC_Os12g40730)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。根据载体pTCK303的酶切位点，构建OsbHLH116-OX表达载体需用酶切位点KpnI和SacI，经序列查找OsbHLH116基因编码序列中含有SacI酶切位点，故需根据水稻密码子偏好性，在保证编码氨基酸序列不变的前提下，优化消除了SacI酶切位点，优化后编码序列为SEQ ID NO.3。

编码OsbHLH116蛋白的基因在调控水稻株型方面的应用的实施例3

本实施例编码OsbHLH116蛋白的基因在调控水稻株型方面的应用中所述OsbHLH116蛋白是在如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列后添加“KLDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK”序列，其中“KL”为HindIII酶切位点编码的连接序列，“DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK”为3×FLAG标签序列。本实施例中的OsbHLH116蛋白为OsbHLH116-FLAG融合蛋白。所述编码OsbHLH116蛋白的基因具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

在其他实施方式中，如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列后还可以添加其他种类的标签蛋白，也可以达到相同的技术效果。

含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组载体在调控水稻株型方面的应用的实施例1

本实施例含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组载体在调控水稻株型方面的应用中所述编码OsbHLH116蛋白的基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组载体在调控水稻株型方面的应用的实施例2

本实施例含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组载体在调控水稻株型方面的应用中所述编码OsbHLH116蛋白的基因具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组载体在调控水稻株型方面的应用的实施例3

本实施例含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组载体在调控水稻株型方面的应用中所述编码OsbHLH116蛋白的基因具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组菌在调控水稻株型方面的应用的实施例1

本实施例含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组菌在调控水稻株型方面的应用中所述编码OsbHLH116蛋白的基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组菌在调控水稻株型方面的应用的实施例2

本实施例含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组菌在调控水稻株型方面的应用中所述编码OsbHLH116蛋白的基因具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组菌在调控水稻株型方面的应用的实施例3

本实施例含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组菌在调控水稻株型方面的应用中所述编码OsbHLH116蛋白的基因具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

改良水稻株型的方法的实施例1

本实施例中改良水稻株型的方法，包括如下步骤：

1)OsbHLH116优化基因的合成

在上述的OsbHLH116优化基因序列的5′添加酶切位点KpnI，3′添加酶切位点SacI，形成如SEQ ID NO.5所示的序列。将该序列交由苏州金唯智生物科技有限公司合成，合成后将其连接在pUC57质粒中，获得pUC57::OsbHLH116载体。

2)OsbHLH116-OX表达载体构建

使用宝生物工程(大连)有限公司的限制性内切酶KpnI和SacI分别对含有OsbHLH116优化基因的pUC57::OsbHLH116载体和pTCK303载体进行双酶切，50μL酶切体系如表1所示，于37℃酶切过夜。

表1酶切体系

使用天根生化科技(北京)有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒分别纯化回收上述酶切产物，使用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系如表2所示，于4℃连接过夜，得连接产物。

表2连接体系

利用热激法将上述连接产物(含pTCK303::OsbHLH116载体)转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，将含有重组载体pTCK303::OsbHLH116的大肠杆菌涂布于50mg/L的卡那霉素LB培养基平板，37℃过夜培养。

挑取上述LB平板上生长的单菌落，使用引物pTCK303-VF和pTCK303-VR进行菌落PCR，引物序列如下：

pTCK303-VF：5′-GCCCTGCCTTCATACGCTAT-3′(如SEQ ID NO.6所示)；

pTCK303-VR：5′-GCAACAGGATTCAATCTTAA-3′(如SEQ ID NO.7所示)。

菌落PCR的结果如图2所示，使用引物pTCK303-VF和pTCK303-VR扩增pTCK303空载体(对照)，扩增产物大小为697bp(如SEQ ID NO.8所示)，连接OsbHLH116基因后，扩增产物大小应为1172bp((如SEQ ID NO.9所示)。其中7号和9号菌落与空载体片段大小一致，表明载体未连接成功，其余菌落显示片段大小在1000bp左右，表明重组载体成功连接。选取3号菌落测序扩繁，提取质粒，即为OsbHLH116-OX表达载体。

构建的OsbHLH116-OX表达载体结构如图1所示，OsbHLH116基因由玉米泛素启动子Ubi驱动，潮霉素抗性基因Hyg由花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子驱动。

3)OsbHLH116-OX转基因植株的获得

将上述构建成功的pTCK303::OsbHLH116载体转化农杆菌EHA105，随后使用含重组质粒的农杆菌侵染水稻日本晴成熟胚愈伤组织，潮霉素(Hyg)抗性筛选获得再生苗，利用GUS染色筛选获得OsbHLH116-OX转基因阳性植株。

4)OsbHLH116-OX转基因植株中OsbHLH116基因表达量检测

选取三组不同株系的OsbHLH116-OX转基因植株OX-1、OX-4和OX-8，以野生型日本晴(WT)作为对照，使用TRIzol试剂提取WT和OsbHLH116-OX转基因株系叶片RNA，反转录获得相应cDNA。以cDNA为模板，使用引物OsbHLH116-F和OsbHLH116-R进行半定量检测OsbHLH116基因表达量，引物序列如下所示：

OsbHLH116-F：5′-GACAACCACAACCACACTCC-3′(如SEQ ID NO.10所示)；

OsbHLH116-R：5′-TCGTCCTTGTTCATGGTGGT-3′(如SEQ ID NO.11所示)。

以OsActin基因为内参基因进行半定量检测，OsActin基因检测引物序列如下所示：

OsActin-F：5′-GGAAGTACAGTGTCTGGATTGGAG-3′(如SEQ ID NO.12所示)；

OsActin-R：5′-TCTTGGCTTAGCATTCTTGGGT-3′(如SEQ ID NO.13所示)。

半定量检测的PCR反应体系及程序如表3、表4中所示，其中变性、退火和延伸为30个循环。

表3半定量PCR反应体系

表4 PCR反应条件

检测结果如图3所示，结果表明OsbHLH116优化基因在WT中无表达，而在OsbHLH116超表达株系OX-1、OX-4和OX-8中有显著表达，表明OsbHLH116-OX转基因株系构建成功，获得了OsbHLH116基因表达显著升高的转基因水稻株系。

改良水稻株型的方法的实施例2

本实施例中改良水稻株型的方法，包括如下步骤：

1)以上文中的pUC57::OsbHLH116质粒为模板，OsbHLH116-FLAG-F和OsbHLH116-FLAG-R为引物扩增得到不含终止密码子的OsbHLH116基因序列，所用引物序列如下所示：

OsbHLH116-FLAG-F：5′-CGGGGTACCATGTGGCAGGGCGGCGGGGG-3′(如SEQ ID NO.14所示)，下划线示KpnI酶切位点；

OsbHLH116-FLAG-R：5′-CCCAAGCTTGAGCTTCTTGCACAGGGAGG-3′(如SEQ ID NO.15所示)，下划线示HindIII酶切位点。

2)使用限制性内切酶KpnI和HindIII分别酶切上述扩增产物和表达载体p1305-3×FLAG，使用T4 DNA连接酶连接前述酶切产物，获得p1305::OsbHLH116-3×FLAG表达载体(该表达载体中含有编码OsbHLH116-FLAG融合蛋白的基因，如SEQ ID NO.4所示；表达出的蛋白在原OsbHLH116蛋白的基础上添加了如SEQ ID NO.16所示的序列)。将该表达载体转入水稻品种日本晴，筛选获得转基因阳性植株，分别为OsbHLH116-FLAG转基因株系OsbHLH116-84、OsbHLH116-86和OsbHLH116-87。其中酶切、连接和转基因方法参照改良水稻株型的方法的实施例1。

试验例1 OsbHLH116-OX转基因株系株型检测

在水稻成熟期，对野生型日本晴(WT)和OsbHLH116-OX转基因株系株型进行观察和检测。

各株系的株高检测结果如图4和图5所示。图4为野生型日本晴和OsbHLH116-OX转基因株系成熟期株型比较图，图中右下角的标尺为10cm；由图中可见OsbHLH116-OX转基因株系的株高较低，株型更为紧凑。对其株高进行详细统计，结果如图5所示，可见成熟期OsbHLH116-OX转基因株系OX-1、OX-4和OX-8株高均比WT极显著降低，其中OX-8株系降幅最大，达27.62％。

各株系的叶夹角检测结果如图6和图7所示。图6为野生型日本晴和OsbHLH116-OX株系叶夹角比较图，图中右下角的标尺为5cm；由图中可见与WT相比，超表达株系OX-1、OX-4和OX-8剑叶叶夹角均显著减小。对其叶夹角进行详细统计，结果如图7所示，可见成熟期OsbHLH116-OX转基因株系OX-1、OX-4和OX-8叶夹角均比WT极显著减小，减小幅度在75.80％-79.26％之间。

株高的降低和叶夹角的减小使OsbHLH116-OX株系相对于WT株型更为紧凑，株型紧凑可使水稻更适宜密植，从而提高水稻产量。

本发明提供了一种可用于调控水稻株高、叶夹角和株型的蛋白及基因OsbHLH116。优化并合成OsbHLH116基因编码序列，构建OsbHLH116-OX表达载体，利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴，以潮霉素(Hyg)抗性标记和GUS染色筛选获得转基因阳性植株。分析鉴定转基因株系中OsbHLH116基因表达量，与野生型相比OsbHLH116基因表达量显著升高。获得了水稻株高和叶夹角减小的OsbHLH116-OX株系。

本发明针对当前人口不断增长和粮食需求不断增加的现状，探讨了OsbHLH116基因在水稻株型改良中的应用。本发明试验结果表明，超表达OsbHLH116基因转基因水稻株高降低，叶夹角减小，株型变得紧凑。本发明基于OsbHLH116的过表达载体为培育水稻株型改良的新品种提供了一种简单有效的技术手段，基因OsbHLH116在降低水稻株高，减小水稻叶夹角等水稻株型改良上具有潜在的应用价值，可利用分子改良技术在生产中加以利用，对水稻高产和稳产育种具有重要的实践意义。

试验例2 OsbHLH116-FLAG转基因株系株型检测

在水稻成熟期，对野生型日本晴(WT)和OsbHLH116-FLAG转基因株系株型进行观察和检测。

观察结果如图8所示，图中右下角的标尺为10cm，从图中可以明显看出转基因株系OsbHLH116-84、OsbHLH116-86和OsbHLH116-87的株型较WT更为紧凑。

株高和叶夹角的检测结果如图9和图10所示，从图中可以看出转基因株系OsbHLH116-84、OsbHLH116-86和OsbHLH116-87的株高和叶夹角均比WT极显著降低，这一结果与OsbHLH116-OX转基因株系表型观察是一致的。结果表明，如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在添加了标签蛋白后，同样可在调控水稻株高和叶夹角，在改良水稻株型中发挥重要作用。

<110> 河南农业大学

<120> 编码OsbHLH116蛋白的基因、重组载体、重组菌在调控水稻株型方面的应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 996

<212> DNA

<213> 水稻

<221> OsbHLH116基因

<400> 1

atgtggcaag gaggaggagg aggaggagcc agcagcttcg accagccgcc gccgccggtt 60

tcctaccacc gcctgtcgcc gccgccgccg gcgatgggga cgacgacgac gacgttactg 120

ccggagcagc cactagttga tgatcatcat ctcccagctg ctgctgctgc tcctccatcg 180

gaggaagaga tggcagcgtg gctctatccg atcgtcagtg gccacgaagt cgccggcggc 240

gggtggcggt cgccggaggc tcaggatgac cggcgagccg caccggcgcc ggagaagaaa 300

cagatggaga aaatgccggc ggcggcatcg ccaacgacga cgatgaataa ggatgaaaca 360

agcgacgact ccggcgagag gaagaagaag aaggcgtcat cagcggcagg aaaaagcaag 420

caagcatcac cacgcggctg caggagctca caaccttaca gaaaaagtgg ggattcgatc 480

gatgaactct tcactaaatt tcataggcgg aggttcaaga taactgagag gttcaggacg 540

ctgcagcgtc tcgtccccgg atgcgataag tccaaccagg cgtcgacgct ggaccagaca 600

atccagtaca tgaagtcgct gcagcaccag ctcaaggcca tgtccgtcgt cggctcgccg 660

ccggcgctgc tgtaccccgc cgccgtgcac ccgcagtcgt acatgcatcc accgccaccg 720

ccgccgccgg tcacgatgcc gatgcatcca gggatggttc ttgctgctcc tcctccaggg 780

gcggcgccgc cgcccggccc tccggcgatg gtgccattcg gagctatgct cccttaccct 840

ccctacccgg cggtgctgct gccgccgccg gcggcggcga cactgtacgg acggccgccg 900

gcccccgctc ccggcgttgc agctcgtcga catggatcca gcggcggcgg cagaattagc 960

aagagcagta gcagcagcct gtgcaagaaa ttgtaa 996

<211> 331

<212> PRT

<213> 水稻

<221> OsbHLH116蛋白

<400> 2

Met Trp Gln Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ser Ser Phe Asp Gln

1 5 10 15

Pro Pro Pro Pro Val Ser Tyr His Arg Leu Ser Pro Pro Pro Pro

16 20 25 30

Ala Met Gly Thr Thr Thr Thr Thr Leu Leu Pro Glu Gln Pro Leu

31 35 40 45

Val Asp Asp His His Leu Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Pro Ser

46 50 55 60

Glu Glu Glu Met Ala Ala Trp Leu Tyr Pro Ile Val Ser Gly His

61 65 70 75

Glu Val Ala Gly Gly Gly Trp Arg Ser Pro Glu Ala Gln Asp Asp

76 80 85 90

Arg Arg Ala Ala Pro Ala Pro Glu Lys Lys Gln Met Glu Lys Met

91 95 100 105

Pro Ala Ala Ala Ser Pro Thr Thr Thr Met Asn Lys Asp Glu Thr

106 110 115 120

Ser Asp Asp Ser Gly Glu Arg Lys Lys Lys Lys Ala Ser Ser Ala

121 125 130 135

Ala Gly Lys Ser Lys Gln Ala Ser Pro Arg Gly Cys Arg Ser Ser

136 140 145 150

Gln Pro Tyr Arg Lys Ser Gly Asp Ser Ile Asp Glu Leu Phe Thr

151 155 160 165

Lys Phe His Arg Arg Arg Phe Lys Ile Thr Glu Arg Phe Arg Thr

166 170 175 180

Leu Gln Arg Leu Val Pro Gly Cys Asp Lys Ser Asn Gln Ala Ser

181 185 190 195

Thr Leu Asp Gln Thr Ile Gln Tyr Met Lys Ser Leu Gln His Gln

196 200 205 210

Leu Lys Ala Met Ser Val Val Gly Ser Pro Pro Ala Leu Leu Tyr

211 215 220 225

Pro Ala Ala Val His Pro Gln Ser Tyr Met His Pro Pro Pro Pro

226 230 235 240

Pro Pro Pro Val Thr Met Pro Met His Pro Gly Met Val Leu Ala

241 245 250 255

Ala Pro Pro Pro Gly Ala Ala Pro Pro Pro Gly Pro Pro Ala Met

256 260 265 270

Val Pro Phe Gly Ala Met Leu Pro Tyr Pro Pro Tyr Pro Ala Val

271 275 280 285

Leu Leu Pro Pro Pro Ala Ala Ala Thr Leu Tyr Gly Arg Pro Pro

286 290 295 300

Ala Pro Ala Pro Gly Val Ala Ala Arg Arg His Gly Ser Ser Gly

301 305 310 315

Gly Gly Arg Ile Ser Lys Ser Ser Ser Ser Ser Leu Cys Lys Lys

316 320 325 330

Leu

331

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> OsbHLH116优化基因

<400> 3

atgtggcagg gcggcggggg cggcggggca agcagctttg atcaaccgcc gccaccggtg 60

tcctatcata ggctcagccc accaccacca gccatgggga caaccacaac cacactcctc 120

ccggagcagc cactcgtgga tgatcatcat ctcccagccg cggccgccgc cccgccatcc 180

gaagaagaaa tggccgcgtg gctgtacccg attgtgagcg gccacgaagt ggcgggcggg 240

ggctggaggt ccccagaagc gcaagatgat aggagggccg ccccagcgcc ggagaagaag 300

caaatggaga agatgccagc cgcggcgtcc ccaacaacca ccatgaacaa ggacgagacc 360

tccgatgact ccggcgagcg caaaaaaaag aaggcaagca gcgcggcggg caagtccaaa 420

caagccagcc caaggggctg tagaagcagc cagccgtata ggaagagcgg ggacagcatc 480

gacgaactgt tcaccaagtt ccacaggagg aggttcaaga tcaccgaacg cttccgcaca 540

ctccaacgcc tcgtcccagg ctgcgacaag agcaatcaag cgtccaccct cgaccagacc 600

atccagtaca tgaagagcct ccagcaccag ctgaaagcga tgtccgtggt ggggtcccca 660

ccagccctgc tgtatccagc ggccgtgcac ccacagtcct acatgcatcc accaccacca 720

ccgccaccgg tgaccatgcc aatgcatcca ggcatggtgc tcgccgcgcc accaccgggc 780

gcggccccac caccaggccc accagcgatg gtgccatttg gcgccatgct cccgtacccg 840

ccatatccag cggtcctgct cccaccgcca gccgcggcga cactctatgg caggccacca 900

gccccagccc caggggtggc cgcgaggcgc catgggtcct ccgggggcgg caggatttcc 960

aaatccagct cctcctccct gtgcaagaag ctctga 996

<211> 1065

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 编码OsbHLH116-FLAG融合蛋白的基因序列

<400> 4

atgtggcagg gcggcggggg cggcggggca agcagctttg atcaaccgcc gccaccggtg 60

tcctatcata ggctcagccc accaccacca gccatgggga caaccacaac cacactcctc 120

ccggagcagc cactcgtgga tgatcatcat ctcccagccg cggccgccgc cccgccatcc 180

gaagaagaaa tggccgcgtg gctgtacccg attgtgagcg gccacgaagt ggcgggcggg 240

ggctggaggt ccccagaagc gcaagatgat aggagggccg ccccagcgcc ggagaagaag 300

caaatggaga agatgccagc cgcggcgtcc ccaacaacca ccatgaacaa ggacgagacc 360

tccgatgact ccggcgagcg caaaaaaaag aaggcaagca gcgcggcggg caagtccaaa 420

caagccagcc caaggggctg tagaagcagc cagccgtata ggaagagcgg ggacagcatc 480

gacgaactgt tcaccaagtt ccacaggagg aggttcaaga tcaccgaacg cttccgcaca 540

ctccaacgcc tcgtcccagg ctgcgacaag agcaatcaag cgtccaccct cgaccagacc 600

atccagtaca tgaagagcct ccagcaccag ctgaaagcga tgtccgtggt ggggtcccca 660

ccagccctgc tgtatccagc ggccgtgcac ccacagtcct acatgcatcc accaccacca 720

ccgccaccgg tgaccatgcc aatgcatcca ggcatggtgc tcgccgcgcc accaccgggc 780

gcggccccac caccaggccc accagcgatg gtgccatttg gcgccatgct cccgtacccg 840

ccatatccag cggtcctgct cccaccgcca gccgcggcga cactctatgg caggccacca 900

gccccagccc caggggtggc cgcgaggcgc catgggtcct ccgggggcgg caggatttcc 960

aaatccagct cctcctccct gtgcaagaag ctcaagcttg actacaaaga ccatgatgga 1020

gactataagg atcacgacat cgattacaag gacgatgacg ataag 1065

<211> 1008

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 添加酶切位点的OsbHLH116优化基因

<400> 5

ggtaccatgt ggcagggcgg cgggggcggc ggggcaagca gctttgatca accgccgcca 60

ccggtgtcct atcataggct cagcccacca ccaccagcca tggggacaac cacaaccaca 120

ctcctcccgg agcagccact cgtggatgat catcatctcc cagccgcggc cgccgccccg 180

ccatccgaag aagaaatggc cgcgtggctg tacccgattg tgagcggcca cgaagtggcg 240

ggcgggggct ggaggtcccc agaagcgcaa gatgatagga gggccgcccc agcgccggag 300

aagaagcaaa tggagaagat gccagccgcg gcgtccccaa caaccaccat gaacaaggac 360

gagacctccg atgactccgg cgagcgcaaa aaaaagaagg caagcagcgc ggcgggcaag 420

tccaaacaag ccagcccaag gggctgtaga agcagccagc cgtataggaa gagcggggac 480

agcatcgacg aactgttcac caagttccac aggaggaggt tcaagatcac cgaacgcttc 540

cgcacactcc aacgcctcgt cccaggctgc gacaagagca atcaagcgtc caccctcgac 600

cagaccatcc agtacatgaa gagcctccag caccagctga aagcgatgtc cgtggtgggg 660

tccccaccag ccctgctgta tccagcggcc gtgcacccac agtcctacat gcatccacca 720

ccaccaccgc caccggtgac catgccaatg catccaggca tggtgctcgc cgcgccacca 780

ccgggcgcgg ccccaccacc aggcccacca gcgatggtgc catttggcgc catgctcccg 840

tacccgccat atccagcggt cctgctccca ccgccagccg cggcgacact ctatggcagg 900

ccaccagccc cagccccagg ggtggccgcg aggcgccatg ggtcctccgg gggcggcagg 960

atttccaaat ccagctcctc ctccctgtgc aagaagctct gagagctc 1008

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> pTCK303-VF

<400> 6

gccctgcctt catacgctat 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> pTCK303-VR

<400> 7

gcaacaggat tcaatcttaa 20

<211> 697

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> pTCK303空载体扩增序列

<400> 8

gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct 60

gttgtttggt gttacttctg caggtcgact ctagaggatc cccgggtacc ctcgaggtcg 120

acagatctgc tagcggtaag ttactacaaa cctttttgta cttatgttcc agtgacaatt 180

atttgtgttc tcatgttcca cgtatcactt taatgttcat ggttgatcat tgtaccgcct 240

catctctttt agaggatcaa gagtatatgc ctgtcttaac tttttctttc tctggtccag 300

tctttccgct gatattaaga tgaattttac aacaaaaaat gtgctgcctg tgtatgaagg 360

ttcagaggca tagttcataa ttttaccctg ttctcaatta ggaaatgtat tttgcaaggt 420

cataaagtct tgacattgat gatcaaatat tttctagagc taaaatttca taatcaaata 480

tgacagttcc acggcagtag ataaagagta cccactgtat atattagtat gaagattaac 540

acttgaaaaa acctttgatt gttcctataa cacctaatga ttgactatga cacggctgtt 600

tcgagatttt cagatcgata ctagttctag agagctcgaa tttccccgat cgttcaaaca 660

tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgc 697

<211> 1172

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> OsbHLH116-OX表达载体扩增序列

<400> 9

gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct 60

gttgtttggt gttacttctg caggtcgact ctagaggatc cccgggtacc atgtggcagg 120

gcggcggggg cggcggggca agcagctttg atcaaccgcc gccaccggtg tcctatcata 180

ggctcagccc accaccacca gccatgggga caaccacaac cacactcctc ccggagcagc 240

cactcgtgga tgatcatcat ctcccagccg cggccgccgc cccgccatcc gaagaagaaa 300

tggccgcgtg gctgtacccg attgtgagcg gccacgaagt ggcgggcggg ggctggaggt 360

ccccagaagc gcaagatgat aggagggccg ccccagcgcc ggagaagaag caaatggaga 420

agatgccagc cgcggcgtcc ccaacaacca ccatgaacaa ggacgagacc tccgatgact 480

ccggcgagcg caaaaaaaag aaggcaagca gcgcggcggg caagtccaaa caagccagcc 540

caaggggctg tagaagcagc cagccgtata ggaagagcgg ggacagcatc gacgaactgt 600

tcaccaagtt ccacaggagg aggttcaaga tcaccgaacg cttccgcaca ctccaacgcc 660

tcgtcccagg ctgcgacaag agcaatcaag cgtccaccct cgaccagacc atccagtaca 720

tgaagagcct ccagcaccag ctgaaagcga tgtccgtggt ggggtcccca ccagccctgc 780

tgtatccagc ggccgtgcac ccacagtcct acatgcatcc accaccacca ccgccaccgg 840

tgaccatgcc aatgcatcca ggcatggtgc tcgccgcgcc accaccgggc gcggccccac 900

caccaggccc accagcgatg gtgccatttg gcgccatgct cccgtacccg ccatatccag 960

cggtcctgct cccaccgcca gccgcggcga cactctatgg caggccacca gccccagccc 1020

caggggtggc cgcgaggcgc catgggtcct ccgggggcgg caggatttcc aaatccagct 1080

cctcctccct gtgcaagaag ctctgagagc tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg 1140

caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gc 1172

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> OsbHLH116-F

<400> 10

gacaaccaca accacactcc 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> OsbHLH116-R

<400> 11

tcgtccttgt tcatggtggt 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> OsActin-F

<400> 12

ggaagtacag tgtctggatt ggag 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> OsActin-R

<400> 13

tcttggctta gcattcttgg gt 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> OsbHLH116-FLAG-F

<400> 14

cggggtacca tgtggcaggg cggcggggg 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> OsbHLH116-FLAG-R

<400> 15

cccaagcttg agcttcttgc acagggagg 29

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> OsbHLH116-FLAG融合蛋白中另添加的序列

<400> 16

Lys Leu Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp

1 5 10 15

Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

20 24

Claims (9)

1.编码OsbHLH116蛋白的基因在调控水稻株型方面的应用，其特征在于：所述OsbHLH116蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述调控水稻株型为调控水稻超表达OsbHLH116基因来降低水稻株高、减小叶夹角。

2.根据权利要求1所述的编码OsbHLH116蛋白的基因在调控水稻株型方面的应用，其特征在于：所述编码OsbHLH116蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者所述编码OsbHLH116蛋白的基因的核苷酸序列由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经密码子优化得到。

3.根据权利要求2所述的编码OsbHLH116蛋白的基因在调控水稻株型方面的应用，其特征在于：所述编码OsbHLH116蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组载体在调控水稻株型方面的应用，其特征在于：所述OsbHLH116蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述调控水稻株型为调控水稻超表达OsbHLH116基因来降低水稻株高、减小叶夹角。

5.含编码OsbHLH116蛋白的基因的重组菌在调控水稻株型方面的应用，其特征在于：所述OsbHLH116蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述调控水稻株型为调控水稻超表达OsbHLH116基因来降低水稻株高、减小叶夹角。

6.一种改良水稻株型的方法，其特征在于：包括：将编码OsbHLH116蛋白的基因导入水稻中，得到转基因水稻；所述OsbHLH116蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述改良水稻株型为调控水稻超表达OsbHLH116基因来降低水稻株高、减小叶夹角。

7.根据权利要求6所述的改良水稻株型的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）将编码OsbHLH116蛋白的基因克隆到表达载体中，构建重组载体；所述OsbHLH116蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

2）将重组载体转化农杆菌，构建重组菌；

3）将重组菌侵染水稻愈伤组织，培养后筛选得到转基因水稻。

8.根据权利要求7所述的改良水稻株型的方法，其特征在于：步骤1）所述编码OsbHLH116蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者所述编码OsbHLH116蛋白的基因的核苷酸序列由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经密码子优化得到。

9.根据权利要求8所述的改良水稻株型的方法，其特征在于：所述编码OsbHLH116蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

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