CN101538322B

CN101538322B - 具有抑制转录因子的转录激活活性的多肽及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101538322B
Application number: CN2009100786278A
Authority: CN
Inventors: 陈受宜; 张劲松; 郝宇钧; 张万科; 林晴
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2009-02-27
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2029-02-27
Also published as: CN101538322A

Abstract

本发明公开了具有抑制转录因子的转录激活活性的多肽及其编码基因与应用。该多肽，是如下1)或2)的多肽：1)由序列表中SEQ ID №：2所示的氨基酸残基组成的多肽；2)序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或十几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制转录因子的转录激活活性的由SEQ ID №：2衍生的多肽。该多肽对研究具有转录激活功能的转录因子的生物学功能及通过抑制此类转录因子的激活活性达到改变转基因植物(含有具有转录激活活性的转录因子)表型具有重要意义。

Description

具有抑制转录因子的转录激活活性的多肽及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及具有抑制转录因子的转录激活活性的多肽及其编码基因与应用，特别是涉及一种来源于大豆NAC类转录因子家族的抑制转录因子的转录激活活性的相关多肽及其编码基因与应用。

背景技术

转录因子又称反式作用因子，它可以通过结合特异的DNA元件来调控下游基因的转录。一些转录因子起转录激活作用，一些起转录抑制作用，而另外一些既有转录激活活性，也有转录抑制活性。研究转录因子的转录调控域，对于了解转录因子的作用方式和生物功能非常重要，既有理论意义，也非常有应用价值。例如当已知某一序列与抑制转录因子的转录激活活性相关时，就可将其加在某个转录因子的前/后面，使其失去转录激活活性，分析表型的改变即可了解其功能；同时通过调控该基因的转录水平，可达到所需植物表型的目的。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种来自大豆NAC转录因子的具有抑制转录因子的转录激活活性的多肽及其编码基因与应用。

本发明所提供的抑制转录激活活性多肽，名称为NARD(NAC-Active-Repression-Domain)，来源于大豆属大豆(Glycine max(L.))，是如下1)或2)的多肽：

1)名称为NARD，由序列表中SEQ ID №：2所示的氨基酸残基组成的多肽；

2)序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或十几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制转录因子的转录激活活性的由SEQ ID №：2衍生的多肽。

上述2)的多肽可以是下述A)、B)或C)之一：

A)名称为NARD(1/16)，由SEQ ID №：2的自氨基末端第1-16位氨基酸残基组成的多肽；

B)名称为NARD(1/22)，由SEQ ID №：2的自氨基末端第1-22位氨基酸残基组成的多肽；

C)由序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个到十九个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制转录因子的转录激活活性的由SEQ ID №：2衍生的多肽。

上述C)具体可以是如下a)、b)、c)、d)、e)、f)或g)的多肽之一：

a)名称为GmNAC11(110-140)，由SEQ ID №：3的自氨基末端第1-31位氨基酸残基组成的多肽；

b)名称为NST1(113-146)，由SEQ ID №：4的自氨基末端第1-34位氨基酸残基组成的多肽；

c)名称为AtNAC2(114-147)，由SEQ ID №：5的自氨基末端第1-34位氨基酸残基组成的多肽；

d)名称为ATAF1(100-133)，由SEQ ID №：6的自氨基末端第1-34位氨基酸残基组成的多肽；

e)名称为RD26(108-141)，由SEQ ID №：7的自氨基末端第1-34位氨基酸残基组成的多肽；

f)名称为SNAC(109-142)，由SEQ ID №：8的自氨基末端第1-34位氨基酸残基组成的多肽；

g)由SEQ ID №：2的下列位置之外进行1个到5个的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制转录因子的转录激活活性的由SEQ ID №：2衍生的多肽：自氨基末端第7位、第10位、第12-15位、第17位、第20位、第22位、第24位、第27位和第29-34位。

实验证明：序列表中的SEQ ID №：2的多肽在酵母系统中抑制转录因子转录激活活性达到90％以上，在原生质体系统中抑制转录因子转录激活活性达到约80％；

序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列自羧基末端缺失19个氨基酸残基(SEQ ID№：2的自氨基末端第17-35位氨基酸残基)的多肽NARD(1/16)具有抑制转录因子转录激活活性(在酵母系统中抑制75％)；

序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列自羧基末端缺失13个氨基酸残基(SEQ ID№：2的自氨基末端第23-35位氨基酸残基)的多肽NARD(1/22)仍具有抑制转录因子转录激活活性(在酵母系统中抑制60％)；

序列表中SEQ ID №：3所示的氨基酸残基组成的多肽GmNAC11(110-140)在原生质体系统中抑制转录因子转录激活活性达到75％以上；

序列表中SEQ ID №：4所示的氨基酸残基组成的多肽NST1(113-146)在原生质体系统中抑制转录因子转录激活活性达到85％以上；

序列表中SEQ ID №：5所示的氨基酸残基组成的多肽AtNAC2(114-147)在原生质体系统中抑制转录因子转录激活活性达到80％以上；

序列表中SEQ ID №：6所示的氨基酸残基组成的多肽ATAF1(100-133)在原生质体系统中抑制转录因子转录激活活性达到90％以上；

序列表中SEQ ID №：7所示的氨基酸残基组成的多肽RD26(108-141)在原生质体系统中抑制转录因子转录激活活性达到80％以上；

序列表中SEQ ID №：8所示的氨基酸残基组成的多肽SNAC(109-142)在原生质体系统中抑制转录因子转录激活活性达到80％以上。

为了使所述的NARD便于纯化，可在上述多肽的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR

Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述NARD可以人工合成，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达得到。其中，NARD编码基因可以通过将序列表中SEQ ID №：1自5′末端第1至105位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述的具有抑制转录因子转录激活活性的各个多肽的编码基因属于本发明的保护范围。

上述具有抑制转录激活活性作用多肽的编码基因，具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子之一：

1)其编码序列是序列表中SEQ ID №：1的DNA分子；

2)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能多肽的DNA分子；

3)在高严谨条件下与与1)或2)限定的DNA序列进行杂交且编码相同功能多肽的DNA分子。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有本发明多肽的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增NARD全长或其任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明中，携带有NARD编码基因的植物表达载体可通过使用包含但不限于Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主包含水稻、小麦、玉米等单子叶植物，或者黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等双子叶植物。

本发明的NARD可作为构建植物表达载体的元件，将其连接在目的转录因子基因的前或后，均可抑制该转录因子的激活活性。因此本发明的NARD对研究具有转录激活功能的转录因子的生物学功能及通过抑制此类转录因子的激活活性达到改变转基因植物(含有具有转录激活活性的转录因子)表型的目的具有重要意义。

下面结合实验及附图对本发明的要旨做进一步阐述，但本发明并不局限于以下实验或实施例。

附图说明

图1为GmNAC在酵母中的转录活性分析。

图2为GmNAC20各结构域转录激活活性分析。左侧为GmNAC20基因不同区段载体构建示意图，数字表示氨基酸位置，右侧为酵母生长状态和半乳糖苷酶活性分析。

图3为GmNAC20中转录抑制结构域(NARD)的鉴定，图左侧为GmNAC20不同区段载体构建示意图，数字表示氨基酸位置，图右侧为酵母生长状态和半乳糖苷酶活性分析。

图4为β半乳糖苷酶定量分析NARD不同区段的抑制作用。

图5为β半乳糖苷酶定量分析NARD对不同类型转录因子的抑制作用。

图6A为原生质体瞬时表达系统的验证报告基因表达质粒和内参基因表达质粒共转化活性测定。

图6B为原生质体系统中的效应基因表达载体pGAL4DBD的部分结构示意图。

图6C为原生质体系统中的效应基因表达载体pGAL4DBD-目的片段的部分结构示意图。

图6D为双荧光素酶定量分析NARD在原生质体系统中对VP16的抑制作用。

图7为不同NAC多肽中NARD同源氨基酸序列比对。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例所涉及的所有实验材料，如无特别说明，均从商业途径得到。

实施例1、NARD的发现及NARD基因的克隆与制备

1.1.酵母系统中GmNAC基因的转录活性分析

该实验中，选择了3个GmNAC基因GmNAC11、GmNAC20和GmNAC35作为分析对象。将上述基因全长开放阅读框(ORF)分别克隆到pBDGAL4(pBD-GAL4 Cam，Stratagene)载体并转化酵母菌株YRG2(Stratagene)，经过色氨酸缺陷培养基筛选阳性克隆，再将阳性克隆涂在组氨酸缺陷并加入3-AT的SD培养基平板上生长。同时利用X-Gal和ONPG对β-半乳糖苷酶酶活性进行定性及定量分析。结果如图1所示，表明3个基因中，GmNAC11具有转录激活活性，转化子能在SD/-His+3-AT培养基平板上生长，且X-Gal分析β-Galactosidase酶活也呈阳性。GmNAC20没有转录激活活性。

1.2.GmNAC20基因不同区域的转录活性分析及NARD的发现、命名与克隆

根据已有的报道，NAC类基因的保守NAC结构域一般为DNA结合域，而呈多态性的C末端一般为转录激活域，在本发明的实施例中，将GmNAC20(其氨基酸序列是序列9，其编码基因是序列10)分成N端和C端两部分，分别包含1-175(序列表中序列9的第1到175位)、162-268(序列表中序列9的第162到268位)；和141-268(序列表中序列9的第141到268位)氨基酸区段。转录活性分析表明，C端都具有很强的转录激活活性，是作为转录激活域起作用的，将氨基酸序列是序列表中序列9的第162到268位的多肽命名为20AD，而N端均没有检测到转录激活活性。又将C末端向N端延伸20个氨基酸测定其转录活性，它们仍然具有很强的激活活性(图2)。图2中，左侧为GmNAC基因不同区段载体构建示意图，数字表示氨基酸位置，右侧为酵母生长状态和半乳糖苷酶活性分析。

该实验中，为了进一步阐述GmNAC20编码蛋白N端中存在的转录抑制域，如图3所示，将GmNAC20划分为更细的若干个区段进行转录活性的分析。图3左侧为GmNAC20不同区段载体构建示意图，数字表示氨基酸位置，右侧为酵母生长状态和半乳糖苷酶活性分析。“GAL4”表示：转入pBDGAL4质粒的重组酵母菌株YRG2/pBDGAL4作为空质粒对照。“None”表示：酵母菌株YRG2作为空菌对照。

结果表明C端延伸至141位，141/268(序列表中序列9的第141到268位)仍然具有转录激活活性，而延伸至100位或49位，100/268(序列表中序列9的第100到268位)和49/268(序列表中序列9的第49到268位)均没有转录激活活性，看来100/140(序列表中序列9的第100到140位)具有类似转录抑制域的功能。为了验证其它区段是否有转录抑制功能，分别将1/61(序列表中序列9的第1到61位)和55/106(序列表中序列9的第55到106位)连接到转录激活域162/268(序列表中序列9的第162到268位)的N端，结果表明这两段序列不能抑制162/268的转录激活活性。

为了证明100/134区段-GmNAC20(100/134)(其氨基酸序列是序列表中的SEQ ID №：2，即NARD)(该氨基酸序列区段也是序列表中序列9的第100到134位，故以100/134表示)可使转录活性域丧失激活活性，进行如下实验。

1.2.1.GAL4DBD-GmNACs融合基因表达载体的构建

1)pBDGAL4-162/268及pBDGAL4-100/134·162/268等重组载体的构建

pBDGAL4-162/268的构建方法如下：提取大豆南农1138-2(南京农业大学国家大豆改良中心)幼苗经100mM NaCl处理12小时后提取的总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。以反转录得到的cDNA为模板，用表1中的相应引物对PCR扩增GmNAC20(162/268)，将扩增产物连接到pBD-GAL4 Cam的限制性内切酶EcoRI和PstI的位点间得到重组载体pBDGAL4-162/268。pBDGAL4-162/268中含有序列9的第162到268位氨基酸残基的编码DNA(序列表10中486-804位核苷酸)。

pBDGAL4-100/134·162/268的构建方法如下：提取经100mM NaCl处理12小时的南农1138-2幼苗的总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。以反转录得到的cDNA为模板，用表1中的相应引物对(正向引物中带有EcoRI识别序列，反向引物中带有SalI识别序列)经PCR扩增GmNAC20(100/134)。用表1中的相应引物对(正向引物中带有SalI识别序列，反向引物中带有PstI识别序列)经PCR扩增GmNAC20(162/268)。GmNAC20(100/134)和GmNAC20(162/268)两个片段以SalI位点相连，再以EcoRI和PstI位点插入pBD-GAL4Cam的相应位点，得到重组载体pBDGAL4-100/134·162/268。重组载体pBDGAL4-100/134·162/268中含有序列9的第100到134位氨基酸残基的编码DNA(序列表10的298至402位核苷酸)与序列9的第162到268位氨基酸残基的编码核苷酸(序列10的484-804位核苷酸)相连接。

2)其它GAL4DBD-GmNACs融合基因表达载体的构建

分别含有GmNAC20(141/268)、GmNAC20(100/268)、GmNAC20(1/175)、GmNAC20(49/268)、GmNAC20(1/61)、GmNAC20(55/106)、GmNAC20(162/268)、GmNAC20(100/134)和GmNAC20(55/106·162/268)等蛋白编码基因的重组载体参照pBDGAL4-162/268和pBDGAL4-100/134·162/268的构建方法，将这些蛋白编码基因扩增产物分别连接到pBD-GAL4Cam的相应限制性内切酶位点，得到重组载体。

表1.pBDGAL4载体克隆所需引物列表

1.2.2.转化酵母及功能分析

将1.2.1.构建的GAL4DBD-GmNACs融合基因表达载体导入酵母菌株YRG-2(MATaura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801 trp1-901 leu2-3 112 gal4-542 gal80-538LYS2::UAS_GAL1-TATA_GAL1-HIS3 URA3::UAS_{GAL417mers(x3)}-TATA_CYC1-lacZ)(Stratagene))。同时将来自GAL4 Two-Hybrid Phagemid Vector Kit(Stratagene)的正对照质粒pGAL4 controlplasmid、负对照质粒pBD-WT control plasmid分别转化酵母细胞YRG2。

分别将在SD/Trp^-培养基上(Stratagene，美国)(生长出的转化子涂于SD/His^-(Stratagene，美国)平板上培养，30℃培养3天，然后对能够生长的酵母细胞进行β-Galactosidase活性分析。

其中，酵母菌株YRG2的基因组中含有两个报告基因HIS3和lacZ，每个报告基因启动子中包含重复拷贝的GAL4结合位点(UAS_GALA)(Stratagene，美国)。

RT-PCR验证酵母转化子中基因的表达情况。酵母转化子用YPAD培养基培养8小时，取1ml菌液收集酵母菌，然后按照酵母总RNA小量提取试剂盒(华舜，中国上海)提取酵母总RNA。然后用M-MLV反转录酶反转录得到cDNA，稀释2~5倍取1μl作为模板，用pBDGAL4通用引物(5’-GCCTCTAACATTGAGACAGC-3’，5’-AAGAGTTACTCAAGAACAA-GAA-3’)扩增目的片段；酵母Actin作为对照，引物序列为：5’-CAGCCAACT-TTCTCAAATCAG-3’，5’-GCCAAGGGTCACTACAC-3’。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

将转入pBDGAL4-162/268的重组酵母菌株命名为YRG2/pBDGAL4-162/268，转入pBDGAL4-100/134·162/268的重组酵母菌株命名为YRG2/pBDGAL4-100/134·162/268，转入pGAL4的重组酵母菌株命名为YRG2/pGAL4。

实验结果表明：酵母Actin基因参照基因得到约1128bp的PCR产物；酵母转化子YRG2/pBDGAL4-162/268中得到约300-400bp的PCR产物；酵母转化子YRG2/pGAL4作为阳性对照，由于无多克隆位点，因此没有检测到PCR产物；酵母转化子YRG2/pBDGAL4-100/134·162/268得到约450bp的PCR产物；不转质粒的酵母菌株YRG2空菌对照“None”因为没有外源质粒导入，故没有PCR产物的条带出现。

再将阳性克隆涂在组氨酸缺陷并加入3-AT的SD培养基平板上(Stratagene，美国)检测其生长情况。并利用X-Gal和ONPG对β-半乳糖苷酶酶活性进行定性及定量分析。根据酵母实验手册(Yeast handbook，Clonetech)ONPG显色法对β-Galactosidase活性进行定量分析。具体步骤如下：取酵母转化子阳性克隆至3mlYPAD培养基(Stratagene，美国)中摇8-12小时，OD值在1.2左右；取1ml测定OD₆₀₀；取1.5ml菌液收集酵母菌，12000rpm离心1分钟；去上清，用Z-Buffer 0.3ml重悬；取重悬液0.1ml至新离心管，在液氮中速冻1分钟，迅速取出在37℃温育1分钟，重复此操作4-5次；菌体裂解后加入0.7ml含巯基乙醇的Z-Buffer；混匀后加入4mg/ml的ONPG溶液0.2ml；30℃反应，记录开始时间，待溶液变为黄色加入0.4ml 1M Na₂CO₃溶液终止反应，记录终止反应时间，计算得显色反应时间T(反应终止时间-反应开始时间)；12000rpm离心5分钟去除沉淀；取上清液测定OD₄₂₀(没有菌体的空白组为对照)；利用公式(1000×OD₄₂₀)/(0.5×T×OD600)计算β-Galactosidase活性。其活性单位为：OD₄₂₀/(培养物OD600的光密度×测定体积×时间)。

实验设三次重复。同时分别以pGAL4 control plasmid的重组酵母菌株YRG2/pGAL4(图3中以“GAL4”表示)作为空质粒对照以检验质粒系统的可靠性，以未转质粒载体和基因的酵母菌株YRG2(图3中以“None”表示)作为空菌对照以检验酵母菌株的可靠性。在图3中，“162/268”表示重组酵母菌株YRG2/pBDGAL4-162/268的实验结果；“100/134·162/268”表示重组酵母菌株YRG2/pBDGAL4-100/134·162/268的实验结果。

实验结果如下：

A)在YPAD培养基上：以上各重组菌及其对照均能生长，平均每皿约50个菌落。

B)在组氨酸缺陷并加入3-AT的SD培养基平板(图3中以“-His”表示)上

“GAL4”重组酵母菌株YRG2/pGAL4作为阳性对照，每皿＞50个菌落；

“None”未转基因的酵母菌株YRG2无菌落；

“162/268”重组酵母菌株YRG2/pBDGAL4-162/268每皿＞50个菌落；

“100/134·162/268”重组酵母菌株YRG2/pBDGAL4-100/134·162/268无菌落；

C)在X-Gal培养基平板(Stratagene，美国)(图3中以“X-Gal”表示)：

“GAL4”重组酵母菌株YRG2/pGAL4每皿＞50个菌落；

“None”未转基因的酵母菌株YRG2无菌落；

“162/268”重组酵母菌株YRG2/pBDGAL4-162/268每皿＞50个菌落；

D)β-半乳糖苷酶酶活性：其活性单位为：OD₄₂₀/(培养物OD600的光密度×测定体积×时间)。

重组酵母菌株YRG2/pGAL4的β-半乳糖苷酶酶活性为19±4；未转基因的酵母菌株YRG2的对照β-半乳糖苷酶酶活性为0；重组酵母菌株YRG2/pBDGAL4-162/268β-半乳糖苷酶酶活性为22±5；重组酵母菌株YRG2/pBDGAL4-100/134·162/268的β-半乳糖苷酶酶活性为1.5±0.2。

上述实验证明100/134(即NARD)具有显著抑制转录因子激活活性的作用，抑制率达到90％以上。NARD编码基因的编码序列长度为105bp，编码35个氨基酸残基的多肽(即SEQ ID №：2)。

1.3.NARD分段功能分析

在本发明中，为了进一步对NARD中具体起作用的氨基酸进行描述，将NARD进一步分段，其中一段是NARD(1/16)(氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2的自氨基末端第1-16位氨基酸残基的NARD)、一段是NARD(1/22)(氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2的自氨基末端第1-22位氨基酸残基的NARD)、一段是NARD(23/35)(氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2的自氨基末端第23-35位氨基酸残基的NARD)、一段是NARD(1/9)(氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2的自氨基末端第1-9位氨基酸残基的NARD)、一段是NARD(1/12)(氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2的自氨基末端第1-12位氨基酸残基的NARD)。分别将其连接GmNAC20的激活域20AD(其氨基酸序列是序列9的自氨基末端第162-268位氨基酸残基)。

将NARD(1/16)的编码序列(序列表1的1至48位核苷酸)、NARD(1/22)的编码序列(序列表1的1至66位核苷酸)、NARD(23/35)的编码序列(序列表1的67至105位核苷酸)、NARD(1/9)的编码序列(序列表1的1至27位核苷酸)、NARD(1/12)的编码序列(序列表1的1至36位核苷酸)分别与20AD的编码序列(序列10的484-804位核苷酸)的5′端连接后插入pBD-GAL4 Cam的多克隆位点，得到重组载体pBDGAL4-NARD(1/16).162/268，pBDGAL4-NARD(1/22).162/268，pBDGAL4-NARD(23/35).162/268，pBDGAL4-NARD(1/9).162/268，pBDGAL4-NARD(1/12).162/268。

将重组载体pBDGAL4-NARD(1/16).162/268，pBDGAL4-NARD(1/22).162/268，pBDGAL4-NARD(23/35).162/268，pBDGAL4-NARD(1/9).162/268，pBDGAL4-NARD(1/12).162/268分别导入酵母菌株YRG-2，得到重组酵母YRG2/pBDGAL4-NARD(1/16).162/268，YRG2/pBDGAL4-NARD(1/22).162/268，YRG2/pBDGAL4-NARD(23/35).162/268，YRG2/pBDGAL4-NARD(1/9).162/268，YRG2/pBDGAL4-NARD(1/12).162/268。

按照1.2.2.所提供的方法进行β-Galactosidase定量检测，实验设三次重复。同时分别以重组酵母YRG2/pBDGAL4-162/268和未转基因的酵母菌株YRG2作为对照。

转录活性检测表明它们都无法如完整的NARD一样抑制20AD的激活活性，因此NARD只是在序列完整时才能起到最强的转录抑制作用。表达氨基酸序列为序列9的自氨基末端第1-22位氨基酸残基组成的NARD(1/22)抑制了55％以上20AD的活性，其β-Galactosidase值下降了一半以上。NARD(1/16)可以将20AD的活性抑制75％，而NARD(1/9)却没有太大影响(图4)。

图4中，阳性对照：“20AD”表示：表达氨基酸序列是序列9自氨基末端第162-268位氨基酸残基的20AD的重组酵母YRG2/pBDGAL4-162/268的活性检测结果；

阴性对照：“None”表示：未转基因的酵母菌株YRG2；

“NARD(1/35).20AD”表示：表达氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2的自氨基末端第1-35位氨基酸残基的NARD和序列9自氨基末端第162-268位氨基酸残基的20AD相连接的重组酵母YRG2/pBDGAL4-100/134·162/268的活性检测结果；

“NARD(1/22).20AD”表示：表达氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2的自氨基末端第1-22位氨基酸残基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位氨基酸残基的20AD相连接的重组酵母YRG2/pBDGAL4-NARD(1/22).162/268的活性检测结果；

“NARD(23/35).20AD”表示：表达氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2的自氨基末端第23-35位氨基酸残基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位氨基酸残基的20AD相连接的重组酵母YRG2/pBDGAL4-NARD(23/35).162/268的活性检测结果；

“NARD(1/9).20AD”表示：表达氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2的自氨基末端第1-9位氨基酸残基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位氨基酸残基组成的20AD相连接的重组酵母YRG2/pBDGAL4-NARD(1/9).162/268；的活性检测结果；

“NARD(1/12).20AD”表示：表达氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2的自氨基末端第1-12位氨基酸残基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位氨基酸残基的20AD相连接的重组酵母YRG2/pBDGAL4-NARD(1/12).162/268的活性检测结果；

“NARD(1/16).20AD”表示：表达氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2的自氨基末端第1-16位氨基酸残基的多肽和序列9自氨基末端第162-268位氨基酸残基的20AD相连接的重组酵母YRG2/pBDGAL4-NARD(1/16).162/268的活性检测结果。

实施例2.NARD的功能验证

2.1.NARD抑制作用的普遍性

本发明的上述实验已证明来自GmNAC20的NARD对GmNAC20中的转录激活域有很强的抑制作用。为了证明NARD抑制作用的普遍性，检测了NARD对其它类型转录因子是否也具有抑制作用，以pBD-GAL4 Cam(Stratagene，美国)为出发载体，构建了NARD与其它转录因子融合的重组载体，在酵母系统中验证了它们的转录激活活性。结果表明GmDof4、DREB1A、GmWRKY53和GmNAC11的转录激活活性均能被NARD强烈抑制。

本实验中选用以下的转录因子：

GmDof4属于Dof类转录因子，可以提高种子油脂含量，其氨基酸序列如GenBankAccession No DQ857254所示；

DREB1A和GmWRKY53分别属于AP2/EREBP和WRKY家族，均与植物的非生物胁迫耐性相关，它们在GenBank中的Accession No分别为FJ169302和DQ322693。

根据表1所列出的相应引物，以大豆南农1138-2 cDNA为模板进行PCR扩增，分别得到GmWRKY53，GmNAC11和GmDof4的cDNA；以拟南芥cDNA为模板，经PCR扩增，得到DREB1A cDNA。将这些PCR扩增产物插入pBD-GAL4 Cam的SalI和PstI酶切位点，得到重组载体pBD-GmWRKY53、pBD-GmNAC11、pBD-GmDof4、pBD-DREB1A。

pBD-NARD·GmWRKY53、pBD-NARD·GmNAC11、pBD-NARD·GmDof4和pBD-NARD·DREB1A的构建方法如下：提取经100mM NaCl处理12小时的南农1138-2幼苗的总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。以大豆南农1138-2 cDNA为模板进行PCR扩增，用表1中的相应引物对(正向引物中带有EcoRI识别序列，反向引物中带有SalI识别序列)PCR扩增GmNAC20(100/134)，得到的100/134片段，再分别与上述各扩增片段以SalI位点相连，之后再以EcoRI和PstI位点与载体pBD-GAL4 Cam连接获得重组载体pBD-NARD·GmWRKY53、pBD-NARD·GmNAC11、pBD-NARD·GmDof4或pBD-NARD·DREB1A。

将重组载体pBD-GmWRKY53、pBD-GmNAC11、pBD-GmDof4、pBD-DREB1A、pBD-NARD·GmWRKY53、pBD-NARD·GmNAC11、pBD-NARD·GmDof4和pBD-NARD·DREB1A分别导入酵母菌株YRG-2，得到重组酵母YRG2/pBD-GmWRKY53、YRG2/pBD-GmNAC11、YRG2/pBD-GmDof4、YRG2/pBD-DREB1A、YRG2/pBD-NARD·GmWRKY53、YRG2/pBD-NARD·GmNAC11、YRG2/pBD-NARD·GmDof4和YRG2/pBD-NARD·DREB1A。

按照1.2.2.所提供的方法进行β-Galactosidase定量检测，实验设三次重复。同时以未转基因的酵母菌株YRG2作为对照。实验结果表明未转基因的酵母菌株YRG2的β-Galactosidase活性为0.8±0.1，YRG2/pBDGAL4-GmDof4的β-Galactosidase活性为12.5±0.1，YRG2/pBDGAL4-NARD·GmDof4β-的Galactosidase活性为2.5±0.8，YRG2/pBDGAL4-DREBIA的β-Galactosidase活性为16.5±4，YRG2/pBDGAL4-NARD·DREBIA的β-Galactosidase活性为2.3±1，YRG2/pBDGAL4-GmWRKY53的β-Galactosidase活性为4.5±1，YRG2/pBDGAL4-NARD·GmWRKY53的β-Galactosidase活性为1±0.1，YRG2/pBDGAL4-GmNAC11的β-Galactosidase活性为9.2±0.3，YRG2/pBDGAL4-NARD·GmNAC11的β-Galactosidase活性为0.5±0.1。说明NARD可以将所检测的不同类型转录因子的转录激活活性抑制90％以上。该实验证明：NARD对转录激活域的抑制作用是普遍的。

在图5中，阴性对照：“None”表示：未转基因的酵母菌株YRG2的活性检测结果；

“GmDof4”表示：表达GmDof4转录因子的重组酵母YRG2/pBD-GmDof4的活性检测结果；

“NARD·GmDof4”表示：表达氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2的NARD和GmDof4转录因子连接的重组酵母YRG2/pBD-NARD·GmDof4的活性检测结果；

“DREB1A”表示：表达DREB1A转录因子的重组酵母YRG2/pBD-DREB1A的活性检测结果；

“NARD·DREB1A”表示：表达氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2的NARD和DREB1A转录因子相连接的重组酵母YRG2/pBD-NARD·DREB1A的活性检测结果；

“GmWRKY53”表示：表达GmWRKY53转录因子的重组酵母YRG2/pBD-GmWRKY53的活性检测结果；

“NARD·GmWRKY53”表示：表达氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2的NARD和GmDof4转录因子相连接的重组酵母YRG2/pBD-NARD·GmWRKY53的活性检测结果；

2.2.NARD在原生质体转录活性系统中的抑制作用

近年来，原生质体转录活性分析系统因为其灵敏度高、更接近于植物本体分析等优点逐渐成为植物转录因子活性分析强有力的工具之一。在前面的实验中，分析证明了NARD在酵母系统中具有很强的转录抑制作用，为了提供更深入的实验证据，利用原生质体分析系统作进一步研究。

首先做了一系列实验来验证原生质体系统的可行性。根据Jan Sheen实验室提供的操作流程(http://genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb/protocols/)，分离了哥伦比亚生态型拟南芥叶肉细胞原生质体，单质粒GFP转化结果表明PEG转化效率可以达到90％；报告基因表达质粒(萤火虫荧光素酶基因表达质粒(Promega，E6651))和内参基因表达质粒(海肾荧光素酶基因表达质粒(Promega，E6881))转化哥伦比亚生态型拟南芥叶肉细胞原生质体，按照双荧光素酶报告试剂盒(Dual-Luciferase Reporter Assay System，Promega，E1910)的操作规程检测报告基因和内参基因的荧光素酶活性。报告基因和内参基因的荧光素酶活性比值即为荧光素酶相对活性。检测仪器为GlomaxT20/20(Promega，美国)。实验结果表明随着质粒比例的变化双荧光素报告系统的比值呈线性，表明质粒的量与报告基因的表达呈正相关(图6A)。图6A中，质粒比为报告基因表达质粒和内参基因表达质粒的摩尔比。

其中，上述转化方法采用PEG-CaCl₂方法转染质粒。10μl质粒(总计10-20μg)加入100μl原生质体MMg悬液(0.4M mannitol，15mM MgCl₂，4mM MES，约含原生质体150-200μg)，再加入110μl PEG-CaCl₂(4g PEG4000，3ml H₂O，2.5ml 0.8M Mannitol，1ml 1M CaCl₂)溶液，吹吸混匀，转化20分钟。转化完后，加入440μl W5溶液(154mMNaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，2mM MES pH5.7)混匀后100g缓慢离心3分钟，去上清后加入1ml W5溶液过夜培养16h。

然后用上述原生质体系统来验证NARD的作用。

构建原生质体系统的载体：报告基因表达载体、效应基因表达载体和内参基因表达载体。

报告基因表达载体为报告基因表达质粒(萤火虫荧光素酶基因表达质粒(Promega，E6651))。

效应基因表达载体中的效应基因(effecter)为35S启动子驱动的包含GAL4结合域的融合蛋白，GAL4DBD可以结合GAL4结合位点，依靠转录因子的作用来调控萤火虫荧光素酶的表达。在本发明实施例中构建了一系列效应基因的载体(effectors)来分析它们的转录活性。效应基因载体包含35S启动子和NOS终止子。将GAL4 DNA Binding Domain(GAL4DBD，其编码基因如序列12)和所分析的全基因或部分基因序列构建的融合基因克隆到35S启动子后面。以单独GAL4DBD为负对照，以VP16为正对照，然后分别将NARD按照读码框拼接在VP16的前端或后端，来阐述NARD的作用。

1)作为负对照的效应基因表达载体pGAL4DBD(图6B)的具体构建方法如下：

pUC19-35S-NOS的构建方法如下：用分别含有KpnI和SalI位点的引物，以植物双元表达载体pBin438(李太元，田颖川，秦晓峰，等.高效抗虫转基因烟草的研究[J].中国科学(B辑)，1994，24(3)：276-282.)为模板PCR扩增CaMV 35S、Ω和NOS片段，再以上述酶位点插入pUC19的相应位点中，得到重组载体pUC19-35S-NOS。

用分别含有EcoRI和PstI位点的引物将GAL4 DNA Binding Domain的编码基因(序列12)构建到pUC19-35S-NOS中Ω和NOS点间，得到重组载体pGAL4DBD(图6B)。

2)效应基因表达载体pGAL4DBD-目的片段(图6C)的具体构建方法如下：

A)pGAL4DBD-VP16的构建：用表1中的引物从HSV病毒中PCR扩增VP16激活域的cDNA(序列表中序列11)，将该扩增产物连入pGAL4DBD的EcoRI和Sal I位点，得到重组载体pGAL4DBD-VP16。

B)pGAL4DBD-VP16·VP16的构建：用表1中的两对引物分别从HSV病毒中PCR扩增VP16激活域的cDNA(序列表中序列11)，将2个VP16以SalI相连再以EcoRI和PstI位点与pGAL4DBD连接得到重组载体pGAL4DBD-VP16·VP16。

C)pGAL4DBD-NARD·VP16的构建：

利用表1中的引物对(正向引物具有EcoRI位点，反向引物具有SalI位点)PCR扩增NARD(GmNAC20(100/134))，利用表1中的引物对(正向引物具有SalI位点，反向引物具有PstI位点)PCR扩增VP16激活域的cDNA(序列表中序列11)，再将NARD和VP16的扩增产物以SalI位点相连再以EcoRI和PstI位点与pGAL4DBD连接得到重组载体pGAL4DBD-NARD·VP16。

D)pGAL4DBD-VP16·NARD的构建：

利用表1中的引物对(正向引物具有SalI位点，反向引物具有PstI位点)PCR扩增NARD(GmNAC20(100/134))，利用表1中的引物对(正向引物具有EcoRI位点，反向引物具有SalI位点)PCR扩增VP16激活域的cDNA(序列表中序列11)，再将VP16和NARD的扩增产物以SalI位点相连再以EcoRI和PstI位点与pGAL4DBD连接得到重组载体pGAL4DBD-VP16·NARD。

内参基因表达载体pPTRL(中国科学院遗传与发育生物学研究所)按照如下文献中描述的方法构建：Ohta MOhme-Takagi M，Shinshi H(2000)Three ethylene-responsivetranscription factors in tobacco with distinct transactivation functions.PlantJ 22：29-38。

将报告基因表达载体、上述一种效应基因表达载体和内参基因表达载体pPTRL以6∶10∶1的摩尔比采用上述PEG-CaCl₂方法转化哥伦比亚生态型拟南芥叶肉细胞原生质体。按照双荧光素酶报告试剂盒(Promega，E1910)的操作规程检测报告基因和内参基因的荧光素酶活性。报告基因和内参基因的荧光素酶活性比值即为荧光素酶相对活性。检测仪器为GlomaxT20/20(Promega，美国)。实验结果如图6D所示，图中的数据为3次重复实验的均值±标准差。表明VP16具有很强的转录激活活性，VP16·VP16的转录激活活性高于VP16，表明两个转录激活域融合在一起时具有一定的叠加效应；而NARD·VP16和VP16·NARD的转录激活活性下降了约80％。说明在原生质体瞬时转化系统中NARD可以强烈抑制VP16的转录活性，而且这种抑制作用没有位置的选择性，也即NARD无论在VP16的前端或后端均具有转录抑制的作用。

图6D中，“GAL4DBD”代表报告基因表达载体，pGAL4DBD作为阴性对照和pPTRL共转染原生质体的检测结果；“VP16”代表报告基因表达载体，pGAL4DBD-VP16作为阳性对照和pPTRL共转染原生质体的检测结果；“VP16·VP16”代表报告基因表达载体，pGAL4DBD-VP16.VP16和pPTRL共转染原生质体的检测结果；“NARD·VP16”代表报告基因表达载体，pGAL4DBD-NARD.VP16和pPTRL共转染原生质体的检测结果；“VP16·NARD”代表报告基因表达载体，pGAL4DBD-VP16.NARD和pPTRL共转染原生质体的检测结果。

实施例3、NARD同源序列的转录抑制作用

Blast分析表明NARD序列仅存在于NAC类蛋白中。NARD位于NAC类蛋白的N端，在NAC类蛋白中具有一定保守性，本发明选择了GmNAC11、NST1、AtNAC2、ATAF1、RD26、SNAC等6个NAC蛋白，克隆其中NARD的同源序列NACsRD(NAC Active Repression Domain，)，它们都具有同NARD一致的保守序列，如。其序列分别为：

GmNAC20(100-134)：见SEQ ID №2，

GmNAC11(110-140)：见SEQ ID №3，

NST1(113-146)：见SEQ ID №4，

AtNAC2(114-147)：见SEQ ID №：5，

ATAF1(100-133)：见SEQ ID №：6，

RD26(108-141)：见SEQ ID №：7，

SNAC(109-142)：见SEQ ID №8。

其中，NST1，来自拟南芥，Arabidopsis thaliana，ACCESSION Q84WP6；

AtNAC2，来自拟南芥，Arabidopsis thaliana，ACCESSION NM_123323；

ATAF1，来自拟南芥，Arabidopsis thaliana，ACCESSION NM_100054；

RD26，来自拟南芥，Arabidopsis thaliana，ACCESSION BAB63913；

SNAC，来自水稻，Oryza sativa，ACCESSION ABD52007.1。

如图7所示，以上多肽是由SEQ ID №：2的下列保守位置之外进行1个到5个的取代和/或缺失和/或添加所得到的具有抑制转录因子的转录激活活性的由SEQ ID №：2衍生的多肽：自氨基末端第7位、第10位、第12-15位、第17位、第20位、第22位、第24位、第27位和第29-34位。

这些与NARD在上述位点具有100％同源性且编码相同功能的多肽，总称为NACsRD，将GmNAC11(110-140)、NST1(113-146)、AtNAC2(114-147)、ATAF1(100-133)、RD26(108-141)和SNAC(109-142)分别命名为GmNAC11RD，NST1RD，AtNAC2RD，ATAF1RD，RD26RD和SNACRD)。实验结果表明这些NACsRD与NARD一样具有相同程度的对转录因子激活的转录抑制作用。

效应基因表达载体pGAL4DBD-目的片段(图6C)pGAL4DBD-GmNAC11RD·VIP16、pGAL4DBD-NST1RD·VP16、pGAL4DBD-AtNAC2RD·VP16、pGAL4DBD-ATAF1RD·VP16、pGAL4DBD-RD26RD·VP16和pGAL4DBD-SNACRD·VP16的构建方法同实施例2.2.的2)。GmNAC11RD，NST1RD，AtNAC2RD，ATAF1RD，RD26RD和SNACRD的PCR引物见表1.

按照实施例2的方法，用报告基因表达载体、内参基因表达载体pPTRL和下述一种效应基因表达载体转化哥伦比亚生态型拟南芥叶肉细胞原生质体：pGAL4DBD、pGAL4DBD-VP16、pGAL4DBD-VP16·VP16、pGAL4DBD-NARD·VP16、pGAL4DBD-GmNAC11RD·VIP16、pGAL4DBD-NST1RD·VP16、pGAL4DBD-AtNAC2RD·VP16、pGAL4DBD-ATAF1RD·VP16、pGAL4DBD-RD26RD·VP16和pGAL4DBD-SNACRD·VP16。按照实施例2的方法，并检测报告基因和内参基因的荧光素酶活性。报告基因和内参基因的荧光素酶活性比值即为荧光素酶相对活性。结果表明，转染效应基因表达载体pGAL4DBD的拟南芥叶肉细胞原生质体的荧光素酶相对活性为1.5±0，转染效应基因表达载体pGAL4DBD-VP16的拟南芥叶肉细胞原生质体的荧光素酶相对活性为20.0±3.0；转染效应基因表达载体pGAL4DBD-VP16·VP16的拟南芥叶肉细胞原生质体的荧光素酶相对活性为33.0±4.5；转染效应基因表达载体pGAL4DBD-NARD·VP16的拟南芥叶肉细胞原生质体的荧光素酶相对活性为4.2±0.8；转染效应基因表达载体pGAL4DBD-GmNAC11RD·VIP16的拟南芥叶肉细胞原生质体的荧光素酶相对活性为2.6±0.3；转染效应基因表达载体pGAL4DBD-NST1RD·VP16的拟南芥叶肉细胞原生质体的荧光素酶相对活性为2.8±0.5；转染效应基因表达载体pGAL4DBD-AtNAC2RD·VP16的拟南芥叶肉细胞原生质体的荧光素酶相对活性为3.0±0.9；转染效应基因表达载体pGAL4DBD-ATAF1RD·VP16的拟南芥叶肉细胞原生质体的荧光素酶相对活性为2.5±0.8；转染效应基因表达载体pGAL4DBD-RD26RD·VP16的拟南芥叶肉细胞原生质体的荧光素酶相对活性为3.2±0.8；转染效应基因表达载体pGAL4DBD-SNACRD·VP16的拟南芥叶肉细胞原生质体的荧光素酶相对活性为4.2±0.8。上述荧光素酶相对活性均为3-5次重复实验的均值±标准差。说明图7所示的6个NACsRD与NARD一样可以分子内明显地抑制VP16的活性，起到转录抑制的作用。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>具有抑制转录因子的转录激活活性的多肽及其编码基因与应用

<160>12

<210>1

<211>105

<212>DNA

<213>大豆属大豆[Glycine max(L.)Merr]

<221>CDS

<222>(1)..(105)

<400>1

ggc aaa ccg aaa cct gtt ggg atc aag aaa gca ttg gtt ttt tac gcc 48

Gly Lys Pro Lys Pro Val Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Ala

1 5 10 15

gga aaa gcg ccc aag gga gtg aaa act aac tgg atc atg cac gag tat 96

Gly Lys Ala Pro Lys Gly Val Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr

20 25 30

cgt ctc gcc 105

Arg Leu Ala

35

<210>2

<211>35

<212>PRT

<213>大豆属大豆[Glycine max(L.)Merr]

<400>2

Gly Lys Pro Lys Pro Val Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Ala

1 5 10 15

Gly Lys Ala Pro Lys Gly Val Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr

20 25 30

Arg Leu Ala

35

<210>3

<211>31

<212>PRT

<213>大豆属大豆[Glycine max(L.)Merr]

<400>3

Val Gly Val Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Lys Gly Arg Pro Pro Lys

1 5 10 15

Gly Val Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Val Asp

20 25 30

<210>4

<211>34

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>4

Gly Arg Arg Ile Gly Met Arg Lys Thr Leu Val Phe Tyr Lys Gly Arg

1 5 10 15

Ala Pro His Gly Gln Lys Ser Asp Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu

20 25 30

Asp Asp

<210>5

<211>34

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>5

Lys Ser Leu Val Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Phe Tyr Lys Gly Arg

1 5 10 15

Ala Pro Lys Gly Val Lys Thr Asn Trp Val Met His Glu Tyr Arg Leu

20 25 30

Glu Gly

<210>6

<211>34

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>6

Pro Lys Pro Val Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Ala Gly Lys

1 5 10 15

Ala Pro Lys Gly Glu Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu

20 25 30

Ala Asp

<210>7

<211>34

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>7

Gly Arg Arg Val Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Ala Gly Lys

1 5 10 15

Ala Pro Lys Gly Thr Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu

20 25 30

Ile Glu

<210>8

<211>34

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>8

Gly Arg Thr Leu Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Ala Gly Lys

1 5 10 15

Ala Pro Arg Gly Val Lys Thr Asp Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu

20 25 30

Ala Asp

<210>9

<211>268

<212>PRT

<213>大豆属大豆[Glycine max(L.)Merr]

<400>9

Met Ala Ala Ala Thr Gln Leu His Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His

1 5 10 15

Leu Thr Asp Glu Glu Leu Val Val His Tyr Leu Cys Arg Lys Cys Ala

20 25 30

Ser Gln Glu Ile Ala Val Pro Ile Ile Ala Glu Ile Asp Leu Tyr Lys

35 40 45

Tyr Asp Pro Trp Asp Leu Pro Gly Met Ala Leu Tyr Gly Lys Lys Glu

50 55 60

Trp Tyr Phe Phe Thr Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg

65 70 75 80

Pro Asn Arg Ser Ala Gly Thr Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp

85 90 95

Lys Pro Val Gly Lys Pro Lys Pro Val Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val

100 105 110

Phe Tyr Ala Gly Lys Ala Pro Lys Gly Val Lys Thr Asn Trp Ile Met

115 120 125

His Glu Tyr Arg Leu Ala Asp Val Asp Arg Ser Val Arg Lys Lys Asn

130 135 140

Ser Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Asn Lys Lys

145 150 155 160

Gly Ala Ile Glu Lys Gln Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ser Gly Val

165 170 175

His Lys Ile Glu Cys Tyr Glu Met Glu Asp Val Lys Pro Glu Tyr Thr

180 185 190

Ala Ala Asp Cys Leu Tyr Phe Glu Ala Ser Asp Ser Val Pro Arg Leu

195 200 205

His Thr Thr Glu Ser Ser Cys Ser Glu Gln Val Val Ser Ala Glu Phe

210 215 220

Ala Ser Glu Val Gln Ser Glu Arg Lys Arg Gln Gly Asn Ser Glu Phe

225 230 235 240

Ser Tyr Asn Tyr Met Asp Ala Thr Leu Gly Asn Asn Gln Met Ser Pro

245 250 255

Leu Gln Asp Ile Phe Met Tyr Leu Ser Arg Pro Phe

260 265

<210>10

<211>807

<212>DNA

<213>大豆属大豆[Glycine max(L.)Merr]

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(807)

<400>10

atg gcc gca gca aca caa ctc cac tta ccc cct gga ttc cga ttc cac 48

Met Ala Ala Ala Thr Gln Leu His Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His

1 5 10 15

ctc acc gat gaa gaa ctc gtc gtt cac tat ctc tgc cgc aaa tgc gct 96

Leu Thr Asp Glu Glu Leu Val Val His Tyr Leu Cys Arg Lys Cys Ala

20 25 30

tcg caa gaa atc gca gtt cca ata atc gcc gaa atc gat ctc tac aag 144

Ser Gln Glu Ile Ala Val Pro Ile Ile Ala Glu Ile Asp Leu Tyr Lys

35 40 45

tac gac cca tgg gac ctt cca gga atg gct ttg tac gga aag aaa gag 192

Tyr Asp Pro Trp Asp Leu Pro Gly Met Ala Leu Tyr Gly Lys Lys Glu

50 55 60

tgg tat ttt ttc acg ccg agg gac cgc aag tac ccg aac ggt tcg cgg 240

Trp Tyr Phe Phe Thr Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg

65 70 75 80

ccg aac cgg tcc gcg ggg acc gga tac tgg aag gca acc gga gcg gat 288

Pro Asn Arg Ser Ala Gly Thr Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp

85 90 95

aaa ccg gtt ggc aaa ccg aaa cct gtt ggg atc aag aaa gca ttg gtt 336

Lys Pro Val Gly Lys Pro Lys Pro Val Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val

100 105 110

ttt tac gcc gga aaa gcg ccc aag gga gtg aaa act aac tgg atc atg 384

Phe Tyr Ala Gly Lys Ala Pro Lys Gly Val Lys Thr Asn Trp Ile Met

115 120 125

cac gag tat cgt ctc gcc gac gtg gat cgt tcg gtt cgc aaa aag aac 432

His Glu Tyr Arg Leu Ala Asp Val Asp Arg Ser Val Arg Lys Lys Asn

130 135 140

agc tta agg ctg gat gac tgg gtg ctg tgt cga att tac aac aag aaa 480

Ser Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Asn Lys Lys

145 150 155 160

ggt gca att gag aag cag caa cca gca ccg cca cca ccg agt ggg gtc 528

Gly Ala Ile Glu Lys Gln Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ser Gly Val

165 170 175

cac aaa att gaa tgt tac gaa atg gaa gac gtg aag ccg gag tat acg 576

His Lys Ile Glu Cys Tyr Glu Met Glu Asp Val Lys Pro Glu Tyr Thr

180 185 190

gcg gcg gat tgc ctg tac ttc gag gct tcc gac tcg gtg ccg cgg ctg 624

Ala Ala Asp Cys Leu Tyr Phe Glu Ala Ser Asp Ser Val Pro Arg Leu

195 200 205

cac acg acg gag tcg agc tgt tcg gag cag gtg gtg tcg gcg gag ttt 672

His Thr Thr Glu Ser Ser Cys Ser Glu Gln Val Val Ser Ala Glu Phe

210 215 220

gcg agc gag gtg cag agc gag cgg aag agg cag ggc aac agc gag ttt 720

Ala Ser Glu Val Gln Ser Glu Arg Lys Arg Gln Gly Asn Ser Glu Phe

225 230 235 240

tcg tat aat tac atg gat gcc act ctc ggg aat aat cag atg tcg ccg 768

Ser Tyr Asn Tyr Met Asp Ala Thr Leu Gly Asn Asn Gln Met Ser Pro

245 250 255

ctc cag gat atc ttc atg tac ctc tcc agg ccc ttc tga 807

Leu Gln Asp Ile Phe Met Tyr Leu Ser Arg Pro Phe

260 265

<210>11

<211>837

<212>DNA

<213>HSV病毒

<400>11

atgaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag 60

tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac 120

tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg 180

ctagaaagac tggaacagct atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt 240

ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat 300

aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta 360

acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt 420

caaagacagt tgactgtatc gattgaattc agcagaggca gaaccagaaa caactacggc 480

tctaccatcg agggcttgct cgacctccca gacgacgacg acgctccagc cgaagcaggt 540

ctcgttgctc caagaatgtc tttcctctcc gctggacaga gaccaagaag actttctacc 600

accgctccaa tcaccgacgt ttctttggtt gacgaattga gattggacgg cgaggaggtt 660

gacatgaccc cagccgacgc cttggacgac ttcgacttgg agatgttggg tgacgttgag 720

tccccatccc caggcatgac ccacgaccca gtttcctacg gcgctttgga cgttgacgac 780

ttcgagtttg agcagatgtt caccgacgcc ttgggcatcg acgacttcgg tggctag 837

<210>12

<211>444

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>12

atgaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag 60

tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac 120

tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg 180

ctagaaagac tggaacagct atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt 240

ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat 300

aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta 360

acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt 420

caaagacagt tgactgtatc gccg 444

Claims

1.一种多肽，是如下1)-10)中任一所述的多肽：

1)由序列表中SEQ ID №：2所示的氨基酸残基组成的多肽；

2)由SEQ ID №：2的自氨基末端第1-16位氨基酸残基组成的多肽；

3)由SEQ ID №：2的自氨基末端第1-22位氨基酸残基组成的多肽；

4)由SEQ ID №：3的自氨基末端第1-31位氨基酸残基组成的多肽；

5)由SEQ ID №：4的自氨基末端第1-34位氨基酸残基组成的多肽；

6)由SEQ ID №：5的自氨基末端第1-34位氨基酸残基组成的多肽；

7)由SEQ ID №：6的自氨基末端第1-34位氨基酸残基组成的多肽；

8)由SEQ ID №：7的自氨基末端第1-34位氨基酸残基组成的多肽；

9)由SEQ ID №：8的自氨基末端第1-34位氨基酸残基组成的多肽；

10)由SEQ ID №：2的下列位置之外进行1个到5个的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制转录因子的转录激活活性的由SEQ ID №：2衍生的多肽：自氨基末端第7位、第10位、第12-15位、第17位、第20位、第22位、第24位、第27位和第29-34位。

2.权利要求1所述多肽的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的编码序列是序列表中SEQ ID №：1的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

5.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

8.权利要求2或3所述基因在抑制植物转录因子激活活性中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述应用为将权利要求2或3所述基因连接到具有转录激活活性的转录因子的前或后。

10.权利要求2或3所述基因在改变转基因植物表型中的应用，所述转基因植物中含有具有转录激活活性的转录因子。