CN108727480B

CN108727480B - 一种转录抑制结构域、其编码基因及其应用

Info

Publication number: CN108727480B
Application number: CN201810512170.6A
Authority: CN
Inventors: 崔素娟; 赵红桃; 张国芳
Original assignee: Hebei Normal University
Current assignee: Hebei Normal University
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2038-05-25
Also published as: CN108727480A

Abstract

本发明公开了一种转录抑制结构域、其编码基因及其在调控植物耐逆性中的应用，该转录抑制结构域含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。由于现有的SRDX转录抑制活性太强，可能导致某些转录因子融合SRDX的转基因植物无法存活，与此相比，本发明抑制序列具有转录抑制活性，但其活性低于SRDX，这对于探究转录因子功能和基因表达调控，具有重大的科研和实用价值。

Description

一种转录抑制结构域、其编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域，尤其涉及一种转录抑制结构域sEAR及其编码基因及其在转录因子调控下游靶基因表达中的应用。

背景技术

植物体从一粒种子发育成为一棵完整的植株，各个生长阶段始终伴随着基因的表达和沉默。双子叶植物拟南芥是一种重要的模式植物，可以用来探究基因之间的表达调控。而基因表达调控的理论研究，为改良农作物的产量、质量和抗逆性等提供重要的理论依据。

在基因表达调控过程中，转录因子发挥着重要功能。转录因子分为DNA结合域和转录激活或抑制结构域。目前，在拟南芥中已知的起抑制作用的结构域主要有四类，分别是EAR（Ethylene-responsive element binding factor-associated AmphiphilicRepression）结构域(LxLxL或DLNxxP)、LxLxPP结构域、R/KLFGV结构域和TLLLFR结构域。其中，EAR结构域占绝大多数。在模式植物拟南芥中，转录因子间的功能冗余，单基因的突变往往不会表现出发育缺陷。所以，在研究转录因子功能时，通常会在C端融合一个EAR结构域，从而获得一个显性负突变体，用来研究该转录因子的功能。由于EAR的转录抑制活性太强，可能导致某些转录因子融合SRDX的转基因植物无法存活，因此，亟需发掘其他的具有类似功能但是活性略低一些的转录抑制结构域。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种转录抑制结构域、其编码基因及其应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种转录抑制结构域，该转录抑制结构域含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

作为本发明的一种优选技术方案，所述转录抑制结构域含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

作为本发明的一种优选技术方案，所述转录抑制结构域含有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

本发明还包括上述转录抑制结构域在调控植物耐逆性中的应用。

本发明还包括上述转录抑制结构域的编码基因。

本发明还包括上述基因的扩增引物对。

本发明还包括上述基因的重组表达载体、转化体、或转基因植物。

本发明还包括上述基因在调控植物耐逆性中的应用。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

本发明通过正向遗传学图位克隆，得到一个TCP7的显性负突变体lcu。通过序列比对，LCU是由于TCP7编码基因的680-682位点的GTC三个碱基的缺失造成的；这使得TCP7的氨基酸序列的227-228位点的GH突变成为D。进一步，本发明公开的结构域瞬时转化拟南芥原生质体能够显著降低VP16的转录激活活性，并且，其抑制活性低于已经报道的SRDX（转录抑制基序EAR的一种，保守序列为LxLxL），并且发挥功能最少需要6个氨基酸，且能够有效的在植物体内也能发挥功能。

本发明的结构域具有重要的实际价值。由于现有的SRDX转录抑制活性太强，可能导致某些转录因子融合SRDX的转基因植物无法存活，与此相比，本发明抑制序列具有转录抑制活性，但其活性低于SRDX，这对于探究转录因子功能和基因表达调控，具有重大的科研和实用价值。

实验证实，本发明发掘的sEAR结构域（6/9/12AA）具有特定的转录抑制功能，融合到TCP7蛋白的C端，导入植物中可以得到TCP7的显性负突变体，证明该结构域能够在植物体内发挥转录抑制功能，在植物抗逆性研究或转基因植物培育的实践当中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例4中TCP7分别融合3/6/9/12/13个氨基酸的转基因植株表型。

图2显示实施例5中双报告酶检测系统检测转录活性；图中，A：效应因子（effector）,报告基因（reporter）和内参（internal control）结构示意图；B：转录活性检测图。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规生物技术试验方法。

实施例1、基于pCIMBIA1300-35S构建重组表达载体。

提取拟南芥Col-0的RNA，反转录成cDNA为模板，分别以如下引物进行PCR扩增：

TCP7F：5′GCTCTAGAaccATGTCTATTAACAACAAC 3′（SEQ ID NO：4）；

TCP7-3R：5′CGGGATCCTTAATCCGGAAGACGTGGATCTTCCTCTCTTC 3′（SEQ ID NO：5）；

TCP7-6R：5′CGGGATCCTTACAAATTAAGATCCGGAAGACGTGGATCTTCCTCTCTTC 3′（SEQ IDNO：6）；

TCP7-9R：5′CGGGATCCTTAAGAAGCAAGCAAATTAAGATCCGGAAGACGTGGATCTT CCTCTCTTC3′（SEQ ID NO：7）；

TCP7-12R：5′CGGGATCCTTAACCGGATAAAGAAGCAAGCAAATTAAGATCCGGAAGACGTGGATCTTCCTCTCTTC 3′（SEQ ID NO：8）；

TCP7-13R：5′CGGGATCCTTAACCGGATAAAGAAGCAAGCAAATTAAGATGACCCGGAAGACGTGGATCTTCCTCTCTTC 3′（SEQ ID NO：9）；

将片段分别插入pCIMBIA1300-35S载体的XbaI和BamHI酶切位点得到35S:TCP7-3/ 6/9/12/13AA 六组重组表达载体。

实施例2、转化体的构建。

所得六组重组表达载体分别测序正确后，构建好的质粒分别转入农杆菌（Agrobacterium）GV3101中，得到转化体。

实施例3、转基因植物的获取。

采用浸花法转基因到拟南芥中(Clough and Bent, 1998)。浸花法具体操作步骤如下：

挑单菌落接种于5 ml YEB（Rif 50 mg/L,Kana 100 mg/L）中，30°C培养过夜。 1:100接种于300 ml YEB（Rif 50 mg/L,Kana 100 mg/L）中扩培，至OD600=1.0-1.2。

集菌，将菌收集到500 ml的灭菌离心瓶中，室温4000 rpm，离心20 min。

弃上清。将菌体重悬于转化介质中（1/2MS，5%蔗糖，0.5 g/L MES, 10 μg 6-BA，KOH调pH到5.7，现用现配，无需灭菌），加入适量的转化介质至OD600=0.8-0.85。加入0.03%silwetL-77。

将植株去除角果和已开的花。分别将4-6盆植株压实土，将盆倒扣在盛菌的转化介质中，浸泡5 min。暗培养（6-24 h, 22°C）光照培养。

收获的转基因T0代的种子，消毒后，种植在含有25mg/L潮霉素的MS培养基进行筛选，得到有外源转基因插入的阳性苗。

实施例4、转基因植物表型分析。

参见图1，为所得 TCP7及分别融合3/6/9/12/13个氨基酸的转基因植株表型。

图中可见，35S:TCP7-6/9/12AA转基因的T1植株会表现出一定比例的不同程度的叶片上卷的表型，但是35S:TCP7-3/13AA和35S:TCP7的T1植株都没有表现出叶片上卷的表型。这一结果也暗示着，sEAR发挥功能最短需要6个氨基酸。这就说明，6/9/12AA这些抑制结构域在拟南芥体内能够发挥有效功能。

实施例5、pMN6-VP16-3/6/9/12/13/SRDX转录活性的检测。

以pMN6-VP16为模板，分别用如下引物进行PCR扩增：

VP16F：5′TCCcccgggATGGACTCCGCCCCCTACGGC 3′（SEQ ID NO：10）；

VP16-3R：5′cGGggtaccTTAATCCGGAAGCCCACCGTACTCGTCAATTCCAAG 3′（SEQ ID NO：11）；

VP16-6R：5′cGGggtaccTTACAAATTAAGATCCGGAAGCCCACCGTACTCGTCAATTCC AAG 3′（SEQ ID NO：12）；

VP16-9R：5′cGGggtaccTTAAGAAGCAAGCAAATTAAGATCCGGAAGCCCACCGTACTCGTCAATTCCAAG 3′（SEQ ID NO：13）；

VP16-12R：5′cGGggtaccTTAACCGGATAAAGAAGCAAGCAAATTAAGATCCGGAAGCCCACCGTACTCGTCAATTCCAAG 3′（SEQ ID NO：14）；

VP16-13R：5′cGGggtaccTTAACCGGATAAAGAAGCAAGCAAATTAAGATGACCCGGAAGCCCACCGTACTCGTCAATTCCAAG 3′（SEQ ID NO：15）；

VP16-SRDXR：5′cGGggtaccTTAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGATCTAGCCCACCGTACTCGTCAATTCCAAG 3′（SEQ ID NO：16）；

将片段插入pMN6载体的SmaI和KpnI酶切位点得到的载体。测序正确后，分别与报告基因（effector）和内参（internal control）共转到拟南芥原生质体中，检测转录活性。

选取4-5周未抽薹的长势较好的拟南芥小苗的平整幼嫩的叶片。用刀片将叶片切成宽度1 mm左右加到酶解液中。使用尽量多的材料，材料过少原生质体容易破碎。将酶解液避光用摇床25°C，65 rpm酶解4-5小时。将充分酶解的原生质体用100 mm的滤网过滤到一个新的塑料平皿中或直接过滤到50 ml的离心管中，过滤时用枪头导流。室温70 g离心10min，离心机升速降速都为1。弃上清后，先加1 ml的W5溶液将原生质体轻轻的重悬起来。之后加9 ml的W5，轻柔混匀后冰上静置30 min。室温70g离心4 min，离心机升速降速都为1。弃上清后，先加1 ml的MaMg溶液将原生质体轻轻的重悬起来，加入适量的MaMg，使原生质体的浓度大约为2x10⁵个/ml。

将混好的质粒20 ng加到10 ml的离心管底部，每管中加入300μl的原生质体。轻柔混匀。加与上述等体积的PEG溶液，快速轻柔混匀。静置20 min。每管用10 ml的W5溶液洗两次。每次室温70 g离心4 min，离心机升速降速都为1。之后加10 ml W5溶液避光22°C培养12-16 h。

用Dual-Luciferase® Reporter Assay System reagents检测LUC和RLUC活性。室温70g离心4 min，离心机升速降速都为1，收集原生质体，加入50μl的1× Passive LysisBuffer。吸取10 μl上清分别加40 μl 的 Luci ferase Assay Buffer和40 μl的 Stop andGlow™ buffer用Centro LB 960 Microplate Luminometer检测。程序为 2s延时和10s测量。

参见附图2，序列比对的结果显示，LCU的225–237位点的LPDLNLLASLSG（12AA）与EAR (LxLxLxLx, DLNxxP)结构域比较类似，我们把它命名为sEAR（similar to EAR）。为了验证sEAR是否有转录抑制活性，我们将VP16融合sEAR作为效应因子，检测转录活性。与VP16相比，VP16-12AA的转录激活活性显著降低，表现出转录抑制活性。但是降低的程度没有VP16-SRDX（LDLDLELRLGFA）高，VP16-SRDX转录活性相对于对照pMN6显著降低。但是VP16融合TCP7蛋白同样位置的13个氨基酸LPGHLNLLASLSG（13AA），也就是VP16-13AA，检测的转录活性与VP16相比，没有显著区别。为了进一步探究sEAR发挥功能最短需要几个氨基酸，我们分别将VP16融合包含突变位点的3、6和9个氨基酸作为效应因子，检测转录活性。结果显示，VP16-3AA与VP16相比没有显著差异，而VP16-6AA和VP16-9AA与VP16相比转录激活活性都有显著降低。这就暗示着，sEAR发挥转录抑制功能最短需要6个氨基酸。

综上实施例，本发明发掘的sEAR结构域（6/9/12AA）具有特定的转录抑制功能，融合到TCP7蛋白的C端，导入植物中可以得到TCP7的显性负突变体，证明该结构域能够在植物体内发挥转录抑制功能，在植物抗逆性研究或转基因植物培育的实践当中具有重要的应用价值。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

序列表

<110> 河北师范大学

<120> 一种转录抑制结构域、其编码基因及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

Leu Pro Asp Leu Asn Leu

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

Leu Pro Asp Leu Asn Leu Leu Ala Ser

1 5

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 3

Leu Pro Asp Leu Asn Leu Leu Ala Ser Leu Ser Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

gctctagaac catgtctatt aacaacaac 29

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

cgggatcctt aatccggaag acgtggatct tcctctcttc 40

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

cgggatcctt acaaattaag atccggaaga cgtggatctt cctctcttc 49

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

cgggatcctt aagaagcaag caaattaaga tccggaagac gtggatcttc ctctcttc 58

<210> 8

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

cgggatcctt aaccggataa agaagcaagc aaattaagat ccggaagacg tggatcttcc 60

tctcttc 67

<210> 9

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

cgggatcctt aaccggataa agaagcaagc aaattaagat gacccggaag acgtggatct 60

tcctctcttc 70

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

tcccccggga tggactccgc cccctacggc 30

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

cggggtacct taatccggaa gcccaccgta ctcgtcaatt ccaag 45

<210> 12

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

cggggtacct tacaaattaa gatccggaag cccaccgtac tcgtcaattc caag 54

<210> 13

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

cggggtacct taagaagcaa gcaaattaag atccggaagc ccaccgtact cgtcaattcc 60

aag 63

<210> 14

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

cggggtacct taaccggata aagaagcaag caaattaaga tccggaagcc caccgtactc 60

gtcaattcca ag 72

<210> 15

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

cggggtacct taaccggata aagaagcaag caaattaaga tgacccggaa gcccaccgta 60

ctcgtcaatt ccaag 75

<210> 16

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

cggggtacct taagcgaaac ccaaacggag ttctagatcc agatctagcc caccgtactc 60

gtcaattcca ag 72

Claims

1.一种转录抑制结构域，其特征在于：该转录抑制结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。

2.权利要求1所述的转录抑制结构域的编码基因。