PROMOTOR PREFERIDO DE SEMILLA DE MAÍZ
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de biología molecular vegetal, mas particularmente a la 5 regulación de la expresión de genes en vegetales. La e.fres?on de las secuencias de ADN heterologo en un huésped vegetal es dependiente de la presencia de un
F- promotor enlazado operablemente que es funcional dentro del nuesped vegetal. La selección de la secuencia promotora
10 determinara cuando y en donde dentro de la planta la secuencia de ADN heterologa se expresa. En donde se desea la expresión continua a través de las células de un vegetal, los
F promotores constitutivos se utilizan. En contraste, en donde se desea una expresión de genes en respuesta a un estimulo,
15 los promotores inducibles son el elemento regulador de selección. En donde se desea la expresión en tejidos u órganos específicos, se usan promotores preferidos de tejido. Esto es, estos promotores pueden impulsar la expresión en tejidos u órganos específicos. Las secuencias reguladoras
20 adicionales hacia el extremo 5' y/o extremo 3' a partir de la secuencia promotora de núcleo puede incluirse en cassettes de expresión de vectores de transformación para lograr diversos iiveles de expresión de las secuencias de nucleotidos peterologas en una planta transgenica. Véase, por ejemplo, la
2L :a;ente Norteamericana No. 5,850,018.
Las secuencias reguladoras también pueden ser útiles para controlar la expresión temporal y/o espacial del ADN endógeno. Por ejemplo, los tejidos especializados están involucrados en la fertilización y el desarrollo de semillas. 5 Es de ínteres la identificación de promotores que son activos en estos tejidos de semilla. En los cultivos de grano de importancia agronómica, - la formación de semillas es la meta ultima del desarrollo del vegetal. Las semillas se cosechan para uso en alimentos,
10 alimentación y productos industriales. Las cantidades y proporciones de los componentes de proteina, aceite, y almidón en esas semillas determinan su utilidad y valor. El tiempo de desarrollo de semillas es critico. Las condiciones ambientales en cualquier punto antes de la
15 fertilización a través de la maduración de las semillas puede afectar la calidad y cantidad de semilla producida. En particular, los primeros 10 a 12 días después de la polinización (la fase lag) son críticos en el desarrollo de la semilla de maíz. Diversos eventos del desarrollo durante
20 la fase lag son determinantes e importantes del destino del subsecuente crecimiento y desarrollo de la semilla. (Chei h, N. et al . , Plant Physiology 106 : 45-51 (1994) ) . Por lo tanto, un medio para influenciar el desarrollo del vegetal, particularmente en respuesta a la tensión durante esta fase
25 del crecimiento, es de ínteres. La identificación de una
ecuencia promotora activa en tejidos de semillas en lesarrollo e>paestas a tensiones abioticas seria util. Los tejidos vegetales especializados son centrales .1 desarrollo de la semilla. Después de la fertilización, las
5 =enillas en desarrollo se vuelven vertederos de carbono translocado por medio del floema a partir de sitios de fotosíntesis. Sin embargo, las semillas de cereal en
F desarrollo no tienen conexiones vasculares directas con el vegetal; en cambio, un mecanismo de transporte de distancia
10 corta opera para mover los asimilados a partir de los tejidos vasculares al endosperma y embrión. Por ejemplo, en el maíz, el fotosmtato entra a la semilla por medio del pedicelo; en
F el trigo, por medio de la proyección nucelar y la capa aleurona. Es posible que esta ruta de asimilado de corta
15 distancia entre el floema y endosperma pueda operar para regular la velocidad del transporte de sacarosa dentro del grano. (Bewley, J.D., and M. Black. Seeds : Physiol ogy of Devel opmen t and Germina tion . N.Í., Plenum Press, 1985. pp . 38-39) . Por lo tanto, un promotor activo en la expresión del
20 gen dentro de estos tejidos especializados, tal como el
" pedicelo, puede tener efectos significativos en el desarrollo del grano . Durante el rápido crecimiento de la semilla, la sacarosa se descarga pasivamente a partir del floema dentro
- ?-_ apoplasto de la parenquima de pedicelo e invertido en
;-» ~*- azúcares de hexosa por una invertasa acida enlaz-adaa a la pared celular. La hidrólisis de la sacarosa en el apoplasto mantiene un gradiente favorable para la descarga continua a partir del floema y proporciona hexosas que se.- recogen por 5 las células del endospermo basal. Se ha mostrado que las semillas inducidas para abortar, in vi tro, tienen 'solamente bajos niveles de actividad invertasa en el pedicelo. (Hanft,
' t --**»*$, J. M. et a l . (1986) Plant Physiol. 81:503-510). La tensión de agua al vegetal alrededor de la
10 antesis frecuentemente resulta en el aborto de la semilla o el desarrollo restringido. Los estudios sugieren que la sacarosa continúe descargándose a partir del floema 'a bajo potencial de agua del ovario pero se acumula en el simplas a y el apoplasma del pedicelo debido a la baja actividad de la
15 invertasa. ( Zinselmeier , C, et al . , (1995) Plant Physiol. 107:385-391) . Esta conclusión está soportada por los descubrimientos de Miller y Chourey (Plant Cell 4:297- 305(1992)), que mostraron que la falla del desarrollo de semillas de minia tura -1 de maíz estaba enlazada a la carencia
20 de actividad de invertasa en el tejido del pedicelo durante las etapas tempranas del desarrollo de la semilla. Otros tejidos vegetales especializados están también cercanamente involucrados en los procesos críticos de fertilización y desarrollo de semilla. Por ejemplo, en el
25 maíz, los carpelos, que forman la pared del ovario, se vuelve
en el pericarpio, una cubierta de la semilla exterior protectora resistente. El escutelio, junto con el endospermo, esta involucrado en ia translocacion de asimilados hacia el roDrión en desarrollo. La aleurona, la capa superficial de 5 las células del endospermo, se desarrolla para servir como una fuente de enzimas necesaria en la germinación. (Kiesselbach, T.A. The Structure and Reproductíon of Corn . w~ N.Y., Cold Spring Harbor Press, 1999). A la luz de las importantes contribuciones de estos
10 tejidos de semillas especializados para el desarrollo del grano apropiado, la identificación de una secuencia promotora que afecta la expresión del gen en estos tejidos sería útil.
• Adicionalmente, sería deseable identificar una secuencia promotora activa en estos tejidos específicos en momentos
15 apropiados, críticos. Aún más deseable sería la identificación de una secuencia promotora activa en estos tejidos específicos en momentos apropiados, críticos, que no sea negativamente afectada por la tensión ambiental al vegetal . 20 El gen Glbl del maíz codifica globulina-1, una proteína de almacenamiento del embrión principal. (Kriz, A.L., et al . (1986) Plant Physiol 82:1069-1075) Glbl se expresa en la semilla de maíz en desarrollo durante el Jesarrollo del embrión. (Belanger, F.C., et al . (1989) Plant
2 Í hys ol. 91:636-643) . La región promotora de Glbl se ha
identificado, clonado, e introducido dentro de Los vegetales de tabaco por transformación mediada por Agrobactepum. (Liu, et al . (1996) Plant Cell Reports 16 : L58-162) . Los vegetales transformados demostraron que el promotor Glbl 5 tiene especificidad temporal deseable y de tejido. Sin embargo, el promotor Glbl se regula positivamente por el ácido abscisico (ABA). (Kriz, A.L., et al . (1990) Plant
^¡^"*W» Physiol. 92:538-542; Paiva, R., et al . , (1994) Planta 192:332-339). Los niveles de la hormona vegetal ABA se conoce
10 que fluctúan bajo condiciones de frío o desecación. (Himmelbach, A., et al . (1998) Phil. Trans. R. Soc. Lond. 353:1439-1444). Así, la actividad del promotor Glbl- puede w afectarse diferencialmente por la tensión ambiental. Existe una necesidad de una secuencia promotora activa en tejidos
15 relacionados a las semillas especificas en momentos críticos en el desarrollo de semillas y que no sea impactado negativamente por las tensiones ambientales al vegetal. En particular, es deseable que la actividad del promotor no se regule a la ba a por las tensiones ambientales. 20 Es un objeto de la presente invención proporcionar una secuencia de nucleótidos novedosa para modular la expresión de genes en un vegetal . Cs un objeto adicional de la presente invención proporcionar un promotor aislado capaz de impulsar la
25 transcripción en una forma preferida de semilla.
Es un objeto adicional te la presente invención proporcional un método de control mejorado de un producto ndogeno n e-ogeno en la semilla J - un vegetal _ansfoimedo . Es un objeto adicional le la presente invención proporcionar un método para efectuar cambios útiles en el fenotipo de una semilla de una planta transformada. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para producir un producto novedoso en la semilla de un vegetal transformado. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para producir una función novedosa en la semilla de un vegetal transformado. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para modular el tiempo o velocidad de desarrollo de la semilla de un vegetal transformado. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para regular la acumulación de productos fotosinteticos en la semilla en desarrollo de un vegetal transformado. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para regular la producción de fi-ohormoras involucradas en el desarrollo de semillas. Es un objeto adicional de la presente invención, proporcionar un método para regular la maquinaria del ciclo .j.ar de las semillas durante su desarrollo.
J&é-
Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención ^ refiere a un ácido nucleico aislado que comprenae un miembro seleccionado a partir del grupo que consiste de: a) ácidos nucleicos ^apaces de impulsar la 5 expresión en el carpelo, escutelio de embrión, pedicelo, pericarpio, aleurona, o región que forma el pedicelo de una semilla en desarrollo; b) ácidos nucleicos capaces de impulsar la e.-presión en el carpelo, escutelio del embrión, pedicelo,
10 pericarpio, aleurona, o región que forma el pedicelo de una semilla en desarrollo durante períodos críticos del desarrollo de la semilla; c) ácidos nucleicos capaces de impulsar la expresión en el carpelo, escutelio del embrión, pedicelo,
15 pericarpio, aleurona, o región que forma el pedicelo de una semilla en desarrollo durante condiciones de crecimiento favorables o desfavorables; d) ácidos nucleicos que comprenden una variante funcional o fragmento de al menos 20 nucleotidos contiguos de
20 la secuencia indicada en la SEC. DE IDENT. NO. 1; e) el segmento de acido nucleico indicado en la SEC. DE IDENT. NO. 1; f) los ácidos nucleicos que se hibridizan a cualquiera de uno de a), b) , c), o d) , ba o condiciones
25 severas; en donde las condiciones severas incluyen: una .'
Inbridizacion a 42°C en una so ución de 50 (p/v) de fcormamida, 6X de SSC, 0.5.5 de SD. , lOOug/ml de esperma de .sa.raón, lavado con 0.5% de SDS y > - . IX de S5C a 65°C durante 'P minutos y repetido; g) ácidos nucleicos que tienen al menos 5", de identidad de secuencia con la SEC. DE IDENT. NO. 1 en donde el % de identidad de secuencia se basa en la secuencia
I^-*» completa y se determina por análisis de BESTFIT bajo parámetros de omisión, con la condición de que tal secuencia
10 homologa no sea de cebada. En otros aspectos, la presente invención se refiere a cassettes de expresión que comprenden el promotor enlazado operablemente a una secuencia de nucleótidos, vectores que contienen el cassette de expresión, y vegetales establemente
15 transformados con al menos un cassette de expresión. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para modular la expresión en la semilla de un vegetal establemente trasformado que comprende los pasos de (a) transformar una célula vegetal con un cassette
20 de expresión que comprende el promotor de la presente invención enlazado operablemente al menos a una secuencia de nucleótidos; (b) cultivar la célula vegetal ba o condiciones de cultivo vegetal y (c) regenerar un vegetal establemente transformado a partir de la célula vegetal en donde la
Z ^-ciencia de nucleótidos enlazada se expresa en la semilla.
De acuerdo con la invención, se proporciona una secuencia de nucleotidos que permite la mu. ^acion de la I lanscppcion en la semilla. La secuencia de la -emprende legiones de iniciación de transcppc ion asrciadas 5 con la formación de semillas y tejidos de semillas. Asi, las composiciones de la presente invención comprenden una secuencia de nucleotidos novedosa a partir de un promotor f^* vegetal, y mas particularmente un promotor preferido de semilla . 10 Por "semilla" o "almendra" se intenta incluir el grano u óvulo madurado de un vegetal, o mas ampliamente, una estructura vegetal propagativa. Los términos "semilla" y "almendra" se usan intercambiablemente en la presente. Por "preferido de semilla" se intenta la expresión
15 favorecida en la semilla, incluyendo al menos una de embrión, semilla, o almendra, pericarpio, endosperma, nucelio, aleurona, pedicelo, y similares. Por "secuencia de nucleotidos heterologa" se intenta una secuencia que no ocurre naturalmente con la
20 secuencia promotora. Mientras que esta secuencia de nucleotidos es heterologa con la secuencia promotora, puede ser homologa (nativa) o heterologa (extraña al huésped vegetal . Por "promotor" se intenta una reacción reguladora
25 de ADN que comprende normalmente una ca a de TATA capaz de
L.j.g?r la polimerasa II de ARN p^ la que inicie la síntesis ¡r ARN en el sitio de iniciación le transcripc ón apropiado t 1a una secuencia de codificación particular. Un promotor cié adicionalmente comprender otras secuencias de
5 leconocimiento generalmente ubicadas corriente arriba o 5' en la ca a de TATA, referidas como elementos promotores hacia el e-tremo 5' que influencia la velocidad de iniciación de transcripción. Se reconoce que habiendo identificado las secuencias de nucleótidos para la región promotora descrita
10 en la presente, está dentro del estado de la técnica aislar e identificar elementos reguladores adicionales en la región no traducida 5' hacia el extremo 5' a partir de la región promotora particular identificada en la presente. Así, la región promotora descrita en la presente se define adicional
15 y generalmente comprendiendo los elementos reguladores hacía el extremo 5' tales como aquellos responsables de la expresión temporal y de tejido de la secuencia de codificación, mejoradores y similares. En la forma anterior, los elementos promotores que permiten la expresión en el
20 tejido deseado tales como la semilla pueden identificarse, aislarse y usarse con otros promotores de núcleo para "afirmar la expresión preferida de semilla. La secuencia promotora aislada de la presente L' -encion puede modificarse para proporcionar un rango de
Z _ eles de expresión de la secuencia de nucleotidos heteróloga. Puede utilizarse menos de la región promotora completa y retenerse la capacidad para impulsar la expresión preferido ele semilla retenida. Sin embargo, se reconoce que ios niveles de expresión de ARNm pueden disminuirse con 5 sustracciones de porciones de la secuencia promotora. Así, el promotor puede modificarse para ser un promotor débil o fuerte. Generalmente, el "promotor débil" intenta ser un promotor que impulsa la expresión de una secuencia de codificación a un nivel bajo. Por "nivel bajo"
10 intentan ser niveles de aproximadamente 1/10,000 transcripciones hasta aproximadamente 1/100,000 transcripciones hasta aproximadamente 17500,000 transcripciones. Inversamente, un promotor fuerte impulsa la expresión de una secuencia de codificación a un alto nivel, o
15 a aproximadamente 1/10 transcripciones hasta aproximadamente 1/100 transcripciones hasta aproximadamente • 1/1,000 transcripciones. Generalmente, se usarán al menos aproximadamente 20 nucleótidos de una secuencia promotora aislada para impulsar la expresión de una secuencia de
20 nucleótidos. Se reconoce que para aumentar los niveles de transcripción, pueden utilizarse mejoradores en combinación con las regiones promotoras de la invención. Los mejoradores son secuencias de nucleótidos que actúan para aumentar la
25 expresión de ana región promotora. Los mejoradores se conocen ^n la técnica e incluyen la r° ¡ion me oradoia SV'O, el elemento mejorador 35S, y similares. El termino "aislado" s° .efiere -il material, cal orno un acicio nucleico o una ^rotema, que esta: (1) substancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactuan con el < orno se encuentra en su ambiente natural. El material aislado comprende
F~ opcionalmente el material no encontrado con el material en su ambiente natural; o (2) si el material esta en su ambiente
10 natural, el material ha sido sintéticamente alterado o sintéticamente producido por la deliberada intervención humana y/o colocado en una ubicación diferente dentro de la
F célula. La alteración o creación sintética del material puede realizarse sobre el material dentro o aparte de su estado
15 natural. Por ejemplo, un acido nucleico que ocurre naturalmente se vuelve un ácido nucleico aislado si es alterado o producido por métodos sintéticos no naturales, o si es transcrito a partir de ADN que se ha alterado o producido por métodos sintéticos no naturales. El acido
20 nucleico aislado puede también producirse por el rearreglo
^f sintético ("redistribución") de una parte o partes de una o mas formas alelicas del gen de ínteres. Igualmente, un acido nuc e?co que ocurre naturalmente (por ejemplo, un promotor) :>e vuelve aislado si se introduce en un lugar diferente del
Z Z jfenoma. Los ácidos nucleicos que son "aislados" como se
define en la presente, se refieren también como ácidos nucleicos "heterologos" . Los métodos para el aislamiento de regiones promotoras son bien conocidos en la técnica. Un método se
5 describe en la Solicitud de Patente Norteamei icana No. de Serie 06/098,690 presentada el 31 de agosto * de 1998, incorporada en la presente para referencia. La secuencia para la región promotora de la presente invención se indica en la SEC. DE IDENT. NO. 1. 10 La región promotora de la invención puede aislarse a partir de cualquier vegetal, que incluye, pero no se limita al maíz (Zea mays), cañóla (Brassica napus , Brassica rape ssp.), alfalfa (Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa) , centeno [Sécale cereale) , sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum
15 vulgare) , girasol (Helianthus annuus), trigo (Triticum aestivum) , soya (Glycme max) , tabaco (Nicotiana tabacum) , papa (Solanum tuberosum) , cacahuate (Arachis hypogaea) , algodón (Gossypium hirsutum) , camote (Ipomoea batatus), yuca (Manihot esculenta) , cafe (Cofea spp.), coco (Cocos
20 nucífera) , pina (Ananas comosus) . arboles cítricos (Citrus spp.), cocoa (Theobroma cacao), te (Camellia s nensis) , plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana) , higo (Ficus casica) , guayaba (Psidium guajava) , mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea), avena {Avena sativa), verduras,
25 plantas ornamentales y coniferas. Preferiblemente, los
vegetales incluyen maíz, soya, Mirasol, cártamo, cañóla, ngo, centeno, alfalfa, y sorgo. Las secuencias promotoras de otros vegetales pueden ..blarse conforme a técnicas bien conocidas basadas en su Z nomología de secuencia, la secuencia promotora indicada en la presente. En estas técnicas, se usa toda o parte de la secuencias promotora conocida como una sonda que se hibridiza selectivamente con otras secuencias presentes en una población de fragmentos de ADN genomicos clonados (es decir 0 bibliotecas genomicas) a partir de un organismo seleccionado. Los métodos están fácilmente disponibles en la técnica para la hibpdizacion de secuencias de acido nucleico. La secuencia promotora completa o porciones de la misma pueden usarse como una sonda capaz de hibridizarse 5 específicamente con las secuencias promotoras correspondientes. Para lograr la hibridizacion especifica ba o una diversidad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y son preferiblemente de al menos aproximadamente 10 nucleotidos de longitud, y de mayor 0 preferencia al menos aproximadamente 20 nucleotidos de longitud. Tales sondas pueden usarse para intensificar las secuencias promotoras correspondientes a partir de un rrran?smo seleccionado por los procesos bien conocidos de leaccion en cadena de polimerasa (PCR) . Esta técnica puede f tbarse para arslar secuencias promotoras adicionales a partir
mW*
ele un organismo deseado o como una prueba de diagnóstico para determinar la presencia de la secuencia promotora en un organismo. Los ejemplos incluyen la selección de hibridización o bibliotecas de ADN sembradas (ya sea placas o 5 colonias; véase por ejemplo Innis et al . , eds., (1990) PCR Protocol s , A Guide to Methods and Appl i ca tions,' Academia Press ) . *9& - Los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridización severas" incluye la referencia a condiciones
10 bajo las cuales una sonda se hibridizará con su secuencia objetivo, a un grado detectablemente mayor que a otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces sobre l'a línea base) . Las condiciones de severidad son dependientes de la secuencia objetivo y diferirán dependiendo de la estructura
15 del polinucleótido . Al controlar la severidad de las condiciones de hibridización y/o lavado, pueden identificarse secuencias objetivo que sean 100% complementarias con una sonda (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de severidad pueden ajustarse para permitir algún desajuste en
20 la secuencia para que se detecten grados inferiores de similapdad (sondeo heterólogo) . Generalmente, las sondas de este tipo están en un rango de aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud hasta aproximadamente 250 nucleótidos de longitud. 25 Una guía extensa a la hibridización de ácidos
ÍSsíSR
nucleicos se encuentra en Tijssen, Labora tory Techniques in Biochemis try and Molecular Biology üybridi za ion wi th Nucleic Acid Probas , Part I, Chapter 2 "Overview f principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays", ' Elsevier, New York (1993); y Current Protocol e in Mol ecular Biol ogy, Chapter 2, Ausubel, et a l . , Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York (1995) . Véase también r Sambrook et al . (1989) Molecular Cl oning: A Labora tory Manual (2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
10 N . Y . ) . En general, las secuencias que corresponden a la secuencia promotora de la presente invención e hibridizan a la secuencia promotora descrita en la presente serán ai menos 50% homologas, 70% homologas, y aún 85% homologas o más con
15 la secuencia descrita. Esto es, la similaridad de secuencia entre la sonda y el objetivo puede variar, compartiendo al menos aproximadamente 50%, aproximadamente 70%, y aún aproximadamente 85% de similaridad de secuencia. La especificidad es típicamente la función de los
20 lavados pos-hibridación, siendo los factores críticos la
~^^F^ concentración iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Generalmente, se seleccionan condiciones de temperatura de lavado de severidad y se seleccionan para ser aproximadamente 5°C hasta aproximadamente 2°C menores que el
.15 punto de fusión (Tm) de la secuencia específica a una
concentración iónica definida y pH . El punto de fusión, o desnaturalización, del ADN ocurre sobre un rango de temperatura estrecho y representa la desorganización de la doble hélice en sus hebras sencillas complementarias. El proceso se describe por la temperatura del punto meclio de transición, T„ que se llama también la temperatura de fusión. Están disponibles fórmulas en la técnica para la ? determinación de las temperaturas de fusión. Las condiciones de hibridización preferidas para la
10 secuencia promotora de la rnvención incluyen la hibpdización a 42°C en 50% (p/v) de formamida, 6X de SSC, 0.5% (p/v) de SDS, lOOµg/ml de ADN de esperma de salmón. Ejemplos de condiciones de lavado de ba a severidad incluyen la hibridizacion a 42°C en una solución de 2X de SSC, 0.5% (p/v)
15 de SDS durante 30 minutos y repetir. Ejemplos de condiciones de severidad moderada incluyen un lavado en 2X de SSC, 0.5% (p/v) de SDS a 50°C durante 30 minutos y repetir. Ejemplos de condiciones de severidad de alta incluyen un lavado en 2X de SSC, 0.5% (p/v) de SDS, a 65°C durante 30 minutos y repetir. 20 Las secuencias que corresponden al promotor de la presente invención pueden obtenerse usando todas las condiciones anteriores. Para los propósitos de definir la invención, se usan las condiciones de severidad alta. Los métodos de alineación de las secuencias para
25 comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación
1Q
óptima de las secuencias para comparación pueden conducirse por el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, V/i . Appl . Ma th . 2 : 182 (1981 ; por el algoritmo de ilmeación de homología de Needl-man and Wunsch, J. Mol . 5 Biol . 48: 443 (1970); por la búsqueda del método de similapdad de Pearson and Lipman, Proc . Na ti . Acad . Sci . 85: 2444 (1988); por la implementación computapzada de estos
9- algoritmos que incluye, pero no se limita a: CLUSTAL en el programa PC/Gene por Intelligenetics, Mountam View,
10 California; GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, and TFASTA m the isconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG) , 575 Science Dr . , Madison, isconsin, USA; el programa
^*^ de CLUSTAL se describe bien por Higgins and Sharp, Gene 73: 237-244 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989);
15 Corpet, et a l . , Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huang, et al . , Computer Applications m the Biosciences 8: 155-65 (1992), y Pearson, et al . , Methods m Molecular Biology 24: 307-331 (1994). BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) se describe por Altschul, S. F., et al . , (1993)
20 J. Mol. Biol. 215:403410; véase también m ww . nebí . nlm. nih . gov/BLAST/ . La identidad con la secuencia de la presente xnvención significaría una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 65% de identidad de secuencia, de mayor
Z í preferencia al menos 70% de identidad de secuencia, de mayor
i*?Aá*k *?*.. »*M.?.U.. J»""*»-" * ** t* a a....-^-. kASA**M?.** l preferencia al menos 75% de identidad de secuencia, de mayor preferencia al menos 80% de identidad, de ma\or preferencia al menos 85 de identidad de secuencia, de mayor preferencia al menos 90 de identidad de secuencia y de mayor preferencia al menos 95% de identidad de secuencia en donde el por ciento de identidad de secuencia se basa en la región ' promotora completa . Los fragmentos de secuencia con alto porcentaje de identidad con la secuencia de la presente invención se refiere también a aquellos fragmentos de una secuencia de nucleótidos promotora particular descrita en la presente que opera para promover la expresión preferida de semilla' de una secuencia de nucleótidos heteróloga enlazada operablemente. Estos fragmentos comprenderán al menos aproximadamente 20 nucleótidos contiguos, preferiblemente al menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos, de - mayor preferencia al menos aproximadamente 75 nucleótidos contiguos, aún de mayor preferencia al menos aproximadamente 100 nucleotidos contiguos de la secuencia de nucleótidos promotora particular descrita en la presente. Los nucleotidos de tales fragmentos comprenderán normalmente la secuencia de reconocimiento TATA de la secuencia promotora particular. Tales fragmentos pueden obtenerse por el uso de las enzimas de restricción para desdoblar las secuencias de nucleotidos promotoras que ocurren naturalmente descritas en la presente;
sintetizando una secuencia de nucleotidos a partir ele la secuencia de ADN promotora que ocurre naturalmente; o puede obtenerse a través del uso de tecnología ele PCR. Véase particularmente, Mullís et al . (1987) Me tnods E?:r,ymol . 5 155:335-350, y Erlich, ed. (1989) PCR Technol ogy (Stockton Press, New York) . De nuevo, variantes de estos fragmentos promotores, tales como aquellos que resultan a partir de la - mutagénesis dirigida al sitio, están abarcadas por las composiciones de la presente invención. 10 Las secuencias de nucleotido que comprenden al menos aproximadamente 20 secuencias contiguas de la secuencia indicada en la SEC. DE IDENT. NO. 1 están abarcadas. Estas secuencias pueden aislarse por hibridización, PCR, y similares . Tales secuencias abarcan fragmentos capaces de
15 impulsar la expresión preferida de semilla, fragmentos útiles como sondas para identificar secuencias similares, así como elementos responsables de la especificidad de tejido o temporal . Las variantes biológicamente activas de la
20 secuencia promotora también están abarcadas por la composición de la presente invención. Una "variante" reguladora es una forma modificada de una secuencia' reguladora en donde una o más bases se han modificado, eliminado o agregado. Por ejemplo, una forma de rutina para
25 eliminar parte de una secuencia de ADN es usar una
e-aonucleasa en combinación con la amplificación de ADN para producir sust acciones de nido unidireccionales de clones de ADN de hebra doble. Un equipo comercial para este proposito >r vende ba o el nombre comercial Exo-Si-3 (New Cngland Biolabs, Beverly, Mass.). Brevemente, este procedimiento vincula incubar la exonucleasa III con ADN para eliminar progresivamente nucleotidos en la dirección 3' a 5' en las colgaduras 5 ' , extremos romos o muescas en la plantilla de ADN. Sin embargo, la exonucleasa III es incapaz de eliminar los nucleotidos en las colgaduras de 4-base 3'. La digestión cronometrada de un clon con su enzima produce sustracciones de nido unidireccionales. Un ejemplo de una variante de secuencia reguladora es un promotor formado por una o mas sustracciones a partir de un promotor mas grande. La porción 5' de un promotor hasta la caja de TATA cerca del sitio de inicio de transcripción puede sustraerse sin abolir la actividad promotora, como se describe por Zhu et al . , The Plan t Cell 7: 1681-89 (1995). Tales variantes deben retener la actividad promotora, particularmente la capacidad para impulsar la expresión en la semilla o tejidos de semilla. Las variantes biológicamente activas incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras nativas de la invención que tienen una o mas sustituciones de nucleotidos, sustracciones o inserciones. La actividad promotora puede medirse por an lisis de Northern blot,
mediciones de actividad de reportero cuando se usan fusiones Lranscripcionales, y similares. V^ase, por ejemplo, Samorook ^ a l . (1989) Molecular Cloninq : ? Labora toi , Me mal ( Z ^ :l d . oíd Spring Harbor Laboratory, ' Lcl Sppng harbor, i ... ) ,
5 incorporado en la presente para referencia. La secuencia de nucleoticlos para el promotor de la invención, asi como los fragmentos y variantes del mismo, pueden proporcionarse en cassettes de expresión junto con las secuencias de nucleótidos heterologas para la expresión en el
10 vegetal de ínteres, mas particularmente en la semilla del vegetal. Tal cassette de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción de
• la secuencia de nucleotidos este bajo la regulación transcppcional del promotor. Estos cassettes de expresión
15 son útiles en la manipulación genética de cualquier vegetal para lograr una respuesta fenotipica deseada. Los genes de ínteres expresados por el promotor de la invención pueden usarse para variar el fenotipo de las semillas. Esto puede lograrse aumentando la expresión de los
20 productos endógenos o exogenos en las semillas. ü^ Alternativamente, pueden lograrse los resultados proporcionanao una reducción de la expresión en uno o más productos endógenos, particularmente enzimas o cofactores en la semilla. Estas modificaciones resultan en un cambio en el
25 fenotipo de la semilla transformada.
1 fr l ^
Las categorías generales de genes de ínteres para los propósitos de la presente rnvencion incluyen, por ejemplo, aquellos genes involucrados en la ínrormacion, tales ( orno dedos de Zinc, aquellos involucrados en la omunicacion, 5 tales como cinasas, y aquellos involucrados en mantenimiento domestico, tales como proteínas de choque dé calor. Categorías mas especificas de transgenes incluyen genes que codifican rasgos importantes para calidad agronómica, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, 10 resistencia a herbicida, y características de grano. Aún otras categorías de transgenes incluyen genes para inducir la expresión de productos exogenos tales como enzimas,
^^^ cofactores, y hormonas a partir de vegetales y otros eucapontes asi como organismos procapoticos . Se reconoce 15 que cualquier gen de ínteres, incluyendo la secuencia de codificación nativa, puede unirse operablemente al promotor de la invención y expresarse en la semilla. Modificaciones que afectan los rasgos de los grano incluyen alterar los niveles de ácidos grasos saturados y no 20 saturados. Igualmente, puede desearse aumentar los niveles de lisina y aminoácidos que contienen azufre, asi como modificaciones de la cantidad y/o tipo de almidón contenido en las semillas. Ejemplos de modificaciones de la protema hordotionina se describen en PCT/US94/382 presentada el 10 de 25 abril de 1997; PCT/US96/08219 presentada el 26 de marzo de
1997; PCT/US96/08220 presentada el _6 de marzo de 1997 \ la Patente Norteamericana No. 5, 70 409 expedida el 0 ele diciembre ele 1997; las descripciones de las cuales se incorporan en la presente pal a referencia. Ejemplos adicionales son proteína de semilla rica en azufre y/o lisma codificada por la albúmina 2S de soya descrita en PCT/US97/04409 presentada el 20 de marzo de 1996, y el inhibidor de quimotppsina de cebada, illiamson et al . (1987) Eur . J. Biochem . 165:99-106, las descripciones de las cuales se incorporan para referencia . En una modalidad más preferida, el promotor de la invención actual modula genes que codifican proteínas que actúan como reguladores del ciclo celular, o que controlan el metabolismo de carbohidrato o los niveles de fitohormonas como se ha mostrado en tabaco y cañóla con otros promotores preferidos de tejido. (Ma, Q.H., et al . , (1998) Aus tralian Journal of Plan t Physiol ogy 25(1): 53-59; Roeckel, P., et al . , (1997) Transpenic Research 6 ( 2 ) : 133-141. ) La expresión de nucleotidos endógenos o heterologos bajo la dirección del promotor puede resultar en el mantenimiento de un fenotipo de semilla deseable que de otra forma pudiera alterarse bajo las condiciones ambientales adversas . Los derivados de los siguientes genes pueden hacerse por mutagénesis dirigida al sitio para aumentar el na"el de aminoácidos preseleccionados en el polipeptido
"^""W
codificado. Por ejemplo, el gen que codifica f-1 polipeptido de alta lisma de cebada (BHL) , se deriva a partir del mnrbidor ele quimotripsina de cebada, PCT/US97 /20441 presentada el 1 de noviembre de 1996 y PCT/US97 /20441 5 presentada el 31 de octubre de 1997; las descripciones de cada una se incorporan en la presente para referencia. Otras proteínas incluyen proteínas vegetales ricas en metionma tales como de semilla de girasol, Lilley et al . (1989) Proceedmgs of the World Congress on Vegetabl e Proteíñ- 10 Util iza tion m Human Foods and Animal Feeds tuffs , Applewhite, H. (ed.); American Oil Chemists Soc., Champaign, IL: 497-502, incorporada en la presente para referencia; maíz, Pedersen et
• al . (1986) J. Biol . Chem . 261 :6279; Kiphara et al . (1988) Gene 71 :359, incorporadas ambas en la presente para
15 referencia; y arroz, Musumura et al . (1989) Plan t Mol . Biol . 12:123, incorporada en la presente para referencia.- Otros genes importantes codifican látex, Floury 2, factores del crecimiento, factores de almacenamiento de semillas y factores de transcripción. 20 Los rasgos agronómicos en las semillas pueden mejorarse alterando la expresión de los genes que afectan la respuesta del crecimiento de semillas y el desarrollo durante la tensión ambiental, Cheikh-N et a l . , (199¿) Plan t Physiol . 106(1) :45-51, y genes que controlan el metabolismo de
25 carbohidratos para reducir la aborción de semillas en maíz,
*
Zmselmeier et al . (1995) Plan t Pi ±ol . 107 ( 2 ): 385-3^1. Los genes de resist fia a insectos oueclen oaificar resistencia a plagas que i íenen gran resistencia a i producción tales como gusan de la raíz, a laDtis, r Barrenador Europeo del Maíz, \ similares. Tales genes incluyen, por ejemplo, genes dQ endoto/ina de Ba cillus th urmgiensis , Patentes Norteamericanas Nos. 5,366,892;
• 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; Geiser et al . (1986) Gene 48:109; lectmas, Van Damme et a l . (1994) Plant
10 Mol . Biol . 24:825; y similares. Los genes que codifican los rasgos de resistencia a enfermedad incluyen los genes de destoxificacion, tales como
• en contra de fumonosina (PCT/US95/10284 presentada el 7 de junio de 1995); genes de avirulencia (avr) y resistencia a 15 enfermedades (R) Jones et al . (1994) Science 266:789; Martin et a l . (1993) Science 262:1432; Mmdpnos et al . (1994) Cell 78:1089; y similares. Las alteraciones en la expresión del gen también pueden afectar el tipo o cantidad de productos de ínteres
20 comercial; por ejemplo, almidón para la producción de papel, textiles y etanol. Otro uso comercial importante de los vegetales transformados es la producción de polímeros y oíoplasticos tales como los descritos en la Patente -Jorteamepcana No. 5,602,321 presenta da el 11 de febrero de
"5 j ? ~ . Genes tales como B-Ketothiolase, PHBase
(polihidroxibutirato sintasa) y acetoacetil-CoA recluctasa (véase Schubert et al . (1988) J. Ba ctapol 170 ( 1 ): 5837-5847 ) facilitan la expresión de pol?h?ro<?alcanoatos íPHAs) . La secuencia de nucleoticlos enlazado operablemente al promotor descrito en la presente puede ser una secuencia de antisentido para un gen seleccionado. Por "secuencia de nucleotidos de ADN antisentido" se intenta una secuencia que esta en orientación inversa a la orientación normal de 5 ' a 3' de esa secuencia de nucleotido. Cuando se suministra dentro de una célula vegetal, la expresión de la secuencia de ADN de antisentido previene la expresión normal de la secuencia de nucleotido de ADN para el gen seleccionado. La secuencia de nucleotidos antisentido codifica una transcripción de ARN que es complementaria y capaz de hibpdizarse con el ARN mensajero (ARNm) endógeno producido por la transcripción de la secuencia de nucleotidos de ADN para el gen seleccionado. En este caso, la producción de la proteina nativa codificada por el gen seleccionado se inhibe para lograr una respuesta fenotipica deseada. Asi, la secuencia promotora descrita en la presente puede enlazarse operablemente en las secuencias de ADN antisentido para reducir o inhibir la expresión de una proteina nativa en la semilla vegetal. El cassette de expresión también incluirá en el termino 3' de la secuencia de nucleotidos heterologa de
interés, una región de terminación de transcripción y de traducción funcional en vegetales. La región ele terminación puede ser nativa con la secuencia de nucleóticlos promotora de Z Ú presente invención, puede ser nativa con la secuencia de 5 ADN de interés, o puede derivarse de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes están disponibles a partir del plásmido de Ti de A . t umefa ciens , tal como las w- regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Véase también, Guerineau et al . (1991) Mol . Gen .
10 Genet . 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al . (1991) Genes Dev . 5:141-149; Mogen et al . (1990) Plan t Cell 2:1261-1272; Munroe et al . (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al . 1989) Nucl eic Acids Res . 17:7891- 7903; Joshi et al . (1987) Nucleic Acid Res . 15:9627-9639. 15 Los cassettes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias guía 5' . Tales secuencias guía pueden actuar para mejorar la traducción. Los guías de traducción son conocidas en la técnica e incluyen: guías de picornavirus , por ejemplo, guía de EMCV (región que
20 nocodifica 5' de Encephalomyocarditis ) , Elroy-Stein et al . ß ^*P^- (1989) Proc. Na t . Acad . Sci . USA 86:6126-6130; guías de potivirus, por ejemplo, guía de TEV (Virus del Grabado del Tabaco), Alirson et al . (1986); guía de MDMV (Virus Mosaico del Maíz Enano), Virology 154:9-20; proteína que enlaza la
25 cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) , Macejak et al .
(1991) Nature 353:90-94; guía no traducido a partir de ARNm ele la proteína de recubrimiento de virus mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4), Jobling et a l . (1987) Nature 325:622- 625); guía del virus mosaico del tabaco (TMV) , Gallie et al . 5 (1989) Mol ecular Biology of ARN, páginas 237-256; y guía del virus del moteado de maíz clorótico (MCMV) Lommél et al . (1991) Virology 81:382-385. Véase también Della-Cioppa et al .
*tß - (1987). Plant Physiology 84:965-968. El cassette también puede contener secuencias que mejoran la traducción y/o
10 estabilidad del ARNm tales como intrones. En aquellos casos en donde es deseable tener el producto expresado de la secuencia de nucleótidos heüeróloga dirigida a un organelo particular, particularmente el plástido, amiloplasto, o el retículo endoplasmático, o
15 secretado en la superficie de la célula o extracelularmente, el cassette de expresión puede comprender adicionalmente una secuencia de codificación para un péptido de tránsito. Tales péptidos de tránsito son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, el péptido de tránsito para
20 la proteína portadora de acilo, la subunidad pequeña de RUBISCO, EPSP sintasa vegetal, y similares. Para preparar el cassette de expresión, los diversos fragmentos de ADN pueden manipularse, para proporcionar las secuencias de ADN en ia orientación
25 apropiada y, como sea apropiado, en la apropiada estructura
de lectura. Hacia este fin, pueden emplearse adaptadores o enlazantes para unir los fragmentos de ADN u otras manipulaciones pueden estar involucradas para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminación de ADN superfluo, eliminación de sitios de restricción, o similares. Para este proposito, puede involucrarse la mutagenesis ín vi tro, reparación de cebador, digeridos de restricción, templado, y resustituciones, tales como transiciones y transversiones. Como se nota en la presente, la presente invención proporciona vectores capaces de expresar genes de interés bajo el control del promotor. En general, los vectores deben ser funcionales en las células vegetales. A veces, puede ser preferible tener vectores gue son funcionales en E . col l (por ejemplo, la producción de proteína para surgir anticuerpos, análisis de secuencia ADN, construcción de insectos, obtener cantidades de ácidos nucleicos) . Los vectores y procedimientos para clonación y expresión en E . col l se discuten en Sambrook et al . ( supra ) . El vector de transformación que comprende la secuencia promotora de la presente invención enlazado operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga en un cassette de expresión, también puede contener al menos una secuencia de nucleótidos adicional para que se cotransforme un gen dentro del organismo. Alternativamente, pueden
proporcionarse la o las secuencias adicionales sobre otro vector de transformación. Los vectores que son funcionales en vegetales pueden ser plásmidos binarios derivados a partir de 5 Agrobacteriu . Tales vectores son capaces de transformar células vegetales. Estos vectores contienen secuencias de limite izquierdo y derecho que se requieren para la integración dentro del cromosoma del huésped (vegetal) . A lo mínimo, entre estas secuencias de límite está el gen a ser
10 expresado ba o el control del promotor. En las modalidades preferidas, también se incluyen un marcador capaz de seleccionar y un gen reportero. Para facilidad de 'obtener cantidades suficientes de vector, se prefiere un origen de bacteria que permite la replicación en E . col i . 15 Los genes reportero pueden incluirse en los vectores de transformación. Ejemplos de genes reportero adecuados conocidos en la técnica pueden encontrarse en, por ejemplo, Jefferson et a l . (1991) en Plan t Mol ecular Biology Manual , ed. Gelvm et al . (Kluwer Academic Publishers), pp . 20 1-33; De et et al . (1987) Mol . Cell . Biol . 7:725-737; Goff et al . (1990) EMBO J. 9:2517-2522; Kain et al . (1995) BioTechmques 19:650-655; y Chiu et al . (1996) Current Biol ogy 6:325-330. Los genes marcadores capaces de seleccionar para la
25 selección de células o tejidos transformados pueden incluirse
en los vectores de transformación. Estos pueden incluir genes ¡ue confieren resistencia a a?r_b?ot?co o resistencia a .í rbicidas. Ejemplos de genes marcadores capaces de t aleccionar adecuados incluyen, p ro no se limitan a genes 5 que codifican resistencia a cloranfenicol , Herrera Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-Q92; metotrexato, Herrera Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820; higromicina, Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108; Zhijian et al. (1995) 10 Plant Science 108:219-227; estreptomicina, Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet . 210:86-91; espectmomicina, Bretagne- Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5:131-137; bleomicma,
9 Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176; sulfonamida, Guepneau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136; 15 bromoximl, Stalker et al. (1988) Science 242:419-423; glifosato, Shaw et al. (1986) Science 233:478-481; fosfmotricma, DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518. Otros genes que podrían servir de utilidad en la recuperación de eventos transgenicos pero que pudieran no 20 requerirse en el producto final incluirían, pero no se limitan a, ejemplos tales como GUS (ß-glucuronidasa) , Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387); GFP (proteína ae fluorescencia verde), Chalfie et al. (1994) Science 263:802; luciferasa, Teep et al. (1989) EMBO J. 8:343; y los Z" <enes de maíz que codifican para la producción de
antocianma, Ludwig et al . (1990) Science 247:44Q. Cl vector de transformación que .. omprencle la secuencia promotora particular de la presente invención, enlazado operablemente a una secuencia ele nuclectidos 5 heterologa de ínteres en un cassette de «--presión, puede usarse para transformar cualquier vegetal. En esta forma, pueden obtenerse vegetales modificados genéticamente, células
F vegetales, tejido vegetal, semillas y similares. Los protocolos de transformación pueden variar dependiendo del
10 tipo de vegetal o célula vegetal, es decir monocotiledonea o dicotiledónea, seleccionada para transformación. Los métodos adecuados para transformar células vegetales incluyen microinyeccion, Crossway et al . (1986) Biotechmques 4:320- 334; electroporacion, Riggs et al . (1986) Proc . Na ti . Acad. 15 Sci . USA 83:5602-5606; transformación mediada por Agroba cteri um , véase por ejemplo, Townsend et al . Patente Norteamericana 5,563,055; transferencia de gen directa, Paszkowski et al . (1984) EMBO J. 3:2717-2722; y aceleración de partículas balísticas, véase por ejemplo, Sanford et al . 20 Patente Norteamericana 4,945,050; Tomes et al . (1995) en
'^p Plan t Cell , Tissue , and Organ Cul t ure : Fundamen tal Methods , ed . Gamborg and Phillips (Spnnger, -Verlag, Berlín); y McCabe et al . (1988) Biotechnology 6:923-926. Véase también Weissinger et al . (1 988) Annual Rev. Gene t . 22:421-477 ; 25 Sanford et a l . (1987) Parti cula te Science and Tecnnology
).^7-37 (cebolla); Chpstou et al. (1988) Plant Physiol. 7-671-674 (sova); McCabe et al. (1988) Bio/Tecnnology 6:923- r^2fi (soya), Datta et al. (19Q01 Biotecn tology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Pioc. Nati. Acad. Sci. USA 5 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559- - 563 (maíz); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91 440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839; Hooydeas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311: 763-764; Bytebier et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 10 84:5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet et al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues , ed. G. P. Chapman et al. (Longman, New York), pp . 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada
15 por pivote); D. Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporacion) ; Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou et al. (1995) Annals of Botany 75:407- 413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz por medio de Agrobactepum tumefaciens) ; 20 todas las cuales se incorporan en la presente para
WH referencia . Las células que se han transformado pueden cultivarse en vegetales de acuerdo con las formas convencionales. Véase por ejemplo, McCormick et al. (1986)
25 ^l^ t Cell Reports 5:81-84. Estos vegetales pueden cultivarse
después y polinizarse con la misma cepa t ansformada o diferentes cepas. El híbrido resultante aue tiene la expresión preferida de semilla de le c racterística fenotipica deseada puede identificarse después. pueden cultivarse dos o mas generaciones para aseaurar cjue la expresión preferida de semilla de la característica fenotipica deseada se mantiene establemente y se hereda. Los siguientes ejemplos se ofrecen en forma de ilustración y no en forma de limitación. EJEMPLOS La región promotora para un gen de maíz homologa a la del gen pZE40 de cebada se aislo y se clono y su expresión se probo como se describe posteriormente. Ejemplo 1: Aislamiento del Promotor mZE40-2 : Se identifico un maíz ortholog para el gen pZE40 de cebada (Smith, L., M., et al . ; Plant. Mol. Biol . 20:255-266 (1992)) en una base de datos propiedad de Pioneer Hi-Bred International. Se diseñaron tres cebadores con base en la secuencia ortholog: SEC. DE IDENT. NO. 2: GCCGCAGCAAGACATGCTTTGATGAGTC; SEC. DE IDENT. NO .3 : GCGGTCTCCACGTCAGGGAACATCTT; SEC. DE IDENT. NO .4 : TTGCCGCCGCAGCAAGACATGCTTT . Los cebadores y el ADN genomico B73 de maíz se usaron junto con el GenomeWalker Kit™ (Clontech) para aislar el promotor. El protocolo del fabricante se siguió y se
l^í^Z, 37
obtuvieron aproximadamente 2.9 ib de secuencia 5'. El análisis de la secuencia hacia ^1 extremo no reveló motivos de elemento de control obvio. Un fragmento de aproximadamente 1.6 Kb de la secuencia hacia el extremo 5', 5 iniciando en la primera metionina basada en la secuencia de cebada se aisló después. Dos cebadores (SEC. DE IDENT. NO. 5: CCCAAGCTTAGTTATGGCGGTACTACCTATCATCTAG y la SEC. DE IDENT. NO. 6: CGGGATCCCGGCTTTGATGAGTCGAAGGAA) con sitios de restricción se diseñaron y se usó PCR para aislar el fragmento promotor
10 usando técnicas conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. El fragmento promotor se inserto entonces en un vector de transformación (véase Ejemplo 2, posterior) . La estructura se transformó en maíz y los vegetales se usaron para evaluar la actividad promotora. El fragmento fue de
15 1626 pb de longitud (Secuencia de I.D. No.: 1) y se designó mZE40-2. Ejemplo 2: Expresión del Promotor mZE40-2 : La cepa de Agrobactepum utilizada en este ejemplo se modifico para contener ácido nucleico que codifica el
20 promotor mZE40-2 y un gen reportero GUS para expresarse en ^ las células transformadas. El ácido nucleico a ser transferido se incorpora dentro de la región T y se flanquea por al menos una secuencia que limita el ADN-T. En el plásmido Ti, la región T es distinta de la
25 .egion vir cuyas funciones son responsables de transferencia
I integgrraacciióonn. SsÍe han desarrollado sistemas de vectores binarios en donde el ADN-T desarmado manipulado que transforma ADN extraño y las funciones vi están presentes en plasmidos separados. En esta forma, una región de ADN-T modificado que comprende ADN extraño (el ácido nucleico a ser transferido) se construye en un plásmido pequeño que se replica en E. coli . Este plasmido se transfiere con ugativamente en un ajuste tp-parental dentro de A. turne faciens que contiene un gen de virulencia que transporta plasmido compatible. Las funciones vir se suministran en trans para transferir el ADN-T dentro del genoma vegetal. Los vectores preferidos son vectores • super- bmapos . Véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,591,616 y EPA 0604662A1, incorporadas en la presente para referencia. Se ha construido el vector super-bmario que contiene una región de ADN que se origina a partir de la región de virulencia del plásmido de Ti pT?Bo542 (Jm et al , (1987.) J. Bacteriol 169:4417-4425) contenido en un Agroba cteri um tumefaciens A281 super-virulente que presenta eficiencia de transformación extremadamente alta (Hood et al . (1984) Biotechnol . 2:702-709; Hood et al . (1986) J. Ba ctepol . 168:1283-1290; Komari et al . (1986) J. Ba ctepol . 166:88-94; Jm et al . (1987) J. Bacteriol . 169:4417-4425; Komari T. (1989) Plan t Science 60:223-229; ATCC No. de Acceso 37394) .
i l lí Los vectores super-bmai.os son conocidos en la técnica e incluyen pTOK162 (Solicitud de Patente Japonesa, (lo ai) No. 4-222527, EP-A-504 , 86^ , EP-A-604 , 662 , y Patente Norteamericana No. 5,591,616 incorporadas en la presente para 5 referencia) y pTOK233 (Komari, T., (1990) Plant Cell Reports 9:303-306; e Ishida et al . (1996) Na t ure Biotechnology 14:745; incorporadas en la presente para referencia) . Otros f vectores super-bmapos pueden construirse por los métodos indicados en las referencias anteriores. Por ejemplo, el
10 vector super-binapo pTOK162 es capaz de replicacion en E. col i y en A . tumefaciens . Adicionalmente, el vector contiene los genes virB, virC, y virG de la región de virulencia de
*B pT?Bo542. El plasmido también contiene un gen de resistencia a antibióticos, un gen marcador capaz de seleccionar, y el
15 acido nucleico de ínteres a ser transformado dentro del vegetal . La región T de los vectores super-binarios y otros vectores para uso en la expresión del gen se construyen para tener sitios de restricción para la inserción de los genes a
20 ser suministrados. Alternativamente, el ADN a ser i F» transformado puede insertarse en la región de ADN T del vector utilizando recombinacion homologa m vivo . Véase, Herrera-Esterella et al . (1983) EMBO J. 2:987-995; Horch et a l (1984) Science 223:496-498). Tal recombmacion homologa
25 aescansa en el hecho de que el vector super-binario tiene una
región homologa con una región ele pBR322 u otro plásmido similar. Así, cuando los dos plásmidos se ponen juntos se inserta un gen deseado dentro del vector super-binario por recombinación genética por medio de las regiones homologas. Los vectores de este ejemplo se construyeron usando técnicas de biología molecular estándar conocidas por aquellos con experiencia común en la técnica. Un gen reportero y un gen marcador capaces de seleccionar se insertaron entre los límites de ADN-T de un vector super- binario. El gen reportero fue el gen ß-glucuronidasa (GUS) (Jefferson, R.A. et al . , 1986, Proc . Na ti . Acad . Sci . (USA) 83:8447-8451) dentro de cuya región de codificación se insertó el segundo intrón del gen ST-LS1 de papa (Vancanneyt et al . , Mol . Gen . Genet . 220:245-250, 1990), para producir el intron-GUS para prevenir la expresión del gen en Agrobacterium (véase Ohta, S., et al . , 1990, Plan t Cell Physiol . 31 ( 6) : 805-813 ) . Un fragmento que contiene las bases 2 a 310 a partir del terminador del gen inhibidor de proteinasa de papa (pinll) (An et al . Plan t Cell 1:115-122, 1989) se ligó del extremo romo hacia el extremo 3' de la secuencia que codifica GUS, para crear el cassette de expresión de GUS. Para el marcador capaz de seleccionar, se creo un promotor de Virus Mosaico de la Coliflor 35S con una región mejoradora duplicada (2X35S; bases -421 a -90 y -421 a +2 del
Gardner et ai., Nucí . Acids Res . 9:2871-2888, 1981). Se insertó un fragmento que contiene secuencia guia de cebador Omega (Gallie, D.R., et al . , 1987, Nucleic Acids Research 15(8) :3257-3273) se insertó hacia el extremo 3' del promotor 35S seguido por un fragmento que contiene el primer intrón del gen ADH1-S de alcohol deshidrogenasa de maíz (Dennis et al . , Nucí . Acids Res . 12:3983-3990 1984). La secuencia que codifica BAR (Thompson et al . , EMBO J. 6:2519-2523, 1987) se clonó hacia el extremo 3' de la secuencia guía, con el termmador pmll ligado hacia el extremo III de BAR, para crear el cassette de expresión de BAR. En resumen, el plásmido se contruyó insertando el cassette de expresión GUS y el cassette de expresión BAR entre los límites de ADN-T derecho e izquierdo en pSBll. El cassette GUS se insertó próximo al límite de ADN-T derecho. El fragmento promotor mZE40-2 se insertó dentro del vector enfrente del gen intron-GUS . El plásmido pSBll se obtuvo a partir de Japan Tobacco Inc. (Tokio, Japan) . La construcción de pSBll a partir de pSB21 y la construcción de pSB21 a partir de los vectores iniciales se describe por Komari et a l . (1996, Plant J. 10:165-174). El ADN-T de este plásmido se integró dentro del plásmido superbmario (Saito et al . , EP 672 752 Al) por la recombinación homologa entre los dos ±asmidos. El plásmido pSBl también se obtuvo a partir de la :spa HB101 de E. coll de Japan Tobacco Inc. que contiene el
* ..*tate.. *. ZUtí?i % ?.? n.¿5,.s» -*A ** plásmido que contiene el promotor mZE40-2 se ajustó con la cepa LBA4404 de Agrobacterium que albergan pSBl para crear el plásmido cointegrado en la cepa LBA4404 de Agroba cterium t umefa ciens usando el método de Ditta et di., ( Proc . Na ti . Acad . Sci : USA 77:7347-7351, 1980). ( Véase también , la Solicitud de Patente Norteamericana No. '0"8/788,018, Publicación WO No. 98/32326, para una discusión adicional de la transformación mediada por Agrobacterium, incorporada en la presente para referencia) . El plásmido cointegrado resultante, el producto del apareamiento triparental descrito anteriormente, se transformó en los genotipos (1) Hi-II y (2) Hi-II x' PHN46. ( Véase Patente Norteamericana No. 5,567,861 para más información acerca de PHN46.) Se generaron vegetales TO y se condujo a análisis de promotor en semilla TI de ambos genotipos . Las semillas inmaduras de 26 eventos transgénicos se recolectaron a intervalos específicos después de la polinización, iniciando 2 días después de la polinización (DAP) y extendiéndose hasta madurez fisiológica. Cada semilla se disecó verticalmente de la cicatriz de seda hasta el pedicelo y se examinó por tinción histoquímica . Específicamente, cada sección se incubó en una solución de regulador de fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.0, conteniendo 0.5% de X-gluc (sal sódica del ácido 5-bromo-cloro-3-indol?l-ß-D-
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glucuronica, disuelta en DMSO primero) y 0.1 de Tritón X- 100. Las secciones se incubaron duiante la noche a 37°C, pero en algunos casos, las secciones se tiñeron e?tendidamente dentro de 2 a 3 horas. 5 La mayoría de los eventos expresaron GUS muy fuertemente en el carpelo o pericarpio y el pedicelo antes de 10 DAP. Entre 10 y 15 DAP, la expresión se localizó
^¡^ mayormente en la aleurona y después a aproximadamente 15 a 20 DAP, la tinción de GUS también se observo en el lado del
10 escutelio del embrión. La expresión de la aleurona y el escutelio es consistente con la observada en cebada, con el gen de cebada. Además de cosechar las semillas en desarrollo, cedas, vainas, hojas, campanillas y raíces también se recolectaron. Se observó una expresión variable en hojas y
15 raices de algunos eventos. El tejido y la especificidad temporal del promotor se confirmó en la generación T2. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica al cual pertenece esta
20 invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente para referencia al mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada para ser incorporada como referencia. 25 Aunque la invención anterior se ha descrito en
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algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y entendimiento, será obvio que algunos cambios y modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Depósito Los plásmidos que contienen secuencias de polinucleótidos de la invención se depositaron el 13 de junio del 2000, en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia USA, 201 10- 2209, y se les asignó el No. de Acceso PTA-2022. Este depósito será mantenido bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patente. Además, durante el período pendiente de esta solicitud de patente, el acceso a los cultivos depositados estará disponible al Comisionado de patentes y • Marcas comerciales y a personas determinadas por el Comisionado para ser autorizados a eso bajo 37 C.F.R. § 114 y 35 U.S.C. § 122. Este depósito se hizo meramente como una conveniencia para aquellos con experiencia en la técnica y no es un reconocimiento de que se requiera un depósito bajo 35 U.S.C. § 112. Todas las restricciones impuestas por el que deposita sobre la disponibilidad al público del material depositado serán eliminadas irrevocablemente a la concesión. de una patente. Sin embargo, debe entenderse que la
disponibilidad de un deposito no constituye una licencia para practicar la rnvención objeto en derogación de los derechos de patente concebidos por la acción del gobierno.
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