BR122021014193B1 - Método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa e/ou tolerância ao estresse por deficiência de nutriente de uma planta - Google Patents

Abstract

São providos métodos para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntica à SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130-137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364666, 671, 673-1333, 2414-2441, 2443-2445, 2447-2455, 2458-2495, 2497-2505, 2507-2511, 2513-2521 ou 2522; e para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, eficiência de uso de fertilizantes e/ou teor de óleo de uma planta expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntica à SEQ ID N°: 3, 5, 6, 9, 10, 14, 15, 288, 294, 2398-2412 ou 2413; também são providos polipeptídios e polinucleotídeos isolados que podem ser usados para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta de uma planta.

Description

CAMPO E ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção, em algumas de suas configurações, está relacionada a polinucleotídeos e polipeptídeos isolados, combinações de ácido nucléico compreendendo os mesmos, plantas transgênicas expressando os mesmos e métodos para usar os mesmos para aumentar eficiência de uso do nitrogênio, produção, biomassa, vigor, taxa de crescimento, teor de óleo, eficiência de uso de fertilizantes, eficiência de uso de água e tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[002] Uma abordagem comum para promover o crescimento da planta era e continua a ser o uso de nutrientes naturais e sintéticos (fertilizantes). Dessa forma, os fertilizantes são o combustível por trás da "revolução verde", diretamente responsável pelo aumento excepcional nos rendimentos das safras durante os últimos 40 anos, e são considerados a despesa geral número um na agricultura. Dos três macronutrientes providos como fertilizantes principais [Nitrogênio (N), Fosfato (P) e Potássio (K)], o nitrogênio é o único que geralmente precisa ser reposto todo ano, em especial para cereais, que compreendem mais da metade das áreas cultivadas no mundo todo. Por exemplo, fertilizantes nitrogenosos inorgânicos tais como nitrato de amônio, nitrato de potássio, ou ureia, normalmente são responsáveis por 40% dos custos associados a safras tais como milho e trigo.

[003] O nitrogênio é um macronutriente essencial para a planta, responsável pela biosíntese de aminoácidos e ácidos nucléicos, grupos prostéticos, hormônios vegetais, defesas químicas das plantas, etc. Além disso, o nitrogênio é, muitas vezes, o elemento limitador de taxa no crescimento da planta e todas as safras do campo têm uma dependência fundamental do nitrogênio inorgânico. Dessa forma, o nitrogênio é translocado para os galhos, onde é armazenado nas folhas e no caule durante a rápida etapa de desenvolvimento da planta e até a florescência. No milho, por exemplo, as plantas acumulam o lote de seu nitrogênio orgânico durante o período de germinação do grão e até a florescência. Uma vez ocorrida a fertilização da planta, os grãos começam a se formar e se tornam o dreno principal de nitrogênio da planta. O nitrogênio armazenado pode então ser redistribuído a partir das folhas e do caule que serviram de compartimentos de armazenamento até a formação do grão.

[004] Uma vez que o fertilizante se esgota rapidamente na maioria dos tipos de solo, deve ser fornecido para cultivar safras duas ou três vezes durante a época de cultivo. Além disso, a baixa eficiência de uso do nitrogênio (EUN) das principais safras (ex., na faixa de apenas 30-70 %) afeta negativamente as despesas de insumo para o fazendeiro, devido ao excesso de fertilizante aplicado. Além do mais, a utilização excessiva e ineficiente de fertilizantes são fatores importantes responsáveis por problemas ambientais tais como eutroficação de lençóis freáticos, lagos, rios e mares, a poluição do nitrato na água potável que pode causar metemoglobinemia, poluição do fosfato, poluição atmosférica e similares. No entanto, apesar do impacto negativo dos fertilizantes sobre o ambiente e dos limites sobre a utilização de fertilizantes, que foram legislados em vários países, espera-se que o uso de fertilizantes aumente para dar suporte à produção de alimentos e fibras para atender ao rápido crescimento da população em recursos de terra limitados. Por exemplo, foi estimado que até 2050, mais de 150 milhões de toneladas de fertilizante nitrogenoso serão usadas anualmente no mundo todo.

[005] O aumento da eficiência de uso do nitrogênio pelas plantas deve possibilitar que as safras sejam cultivadas com menor insumo de fertilizantes, ou de maneira alternativa cultivadas em solos de qualidade inferior e teriam, portanto, um impacto econômico significativo em sistemas agrícolas desenvolvidos e em desenvolvimento.

[006] O aperfeiçoamento genético da eficiência de uso de fertilizantes (EUF) em plantas pode ser obtido através do cultivo tradicional ou por engenharia genética.

[007] Tentativas de geração de plantas com maior EUF foram descritas no Pedido de Patente Americana N° 20020046419 para Choo, et al.; Pedido de Patente Americana N° 2005010879 para Edgerton et al; Pedido de Patente Americana N° 20060179511 para Chomet et al; Good, A, et al. 2007 (Engineering nitrogen use efficiency with alanine aminotransferase. Canadian Journal of Botany 85: 252-262); e Good AG et al. 2004 (Trends Plant Sci. 9:597-605).

[008] Yanagisawa et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004 101:7833-8) descreve plantas transgênicas de Dofl que apresentam crescimento aprimorado em condições de baixo nitrogênio.

[009] A Patente Americana N° 6.084.153 para Good et al. divulga a utilização de um promotor que reage ao estresse para controlar a expressão de Alanina Aminotransferase (ALT) e plantas de canola transgênicas com tolerância à seca e à deficiência do nitrogênio melhoradas quando comparadas a plantas de controle.

[0010] A escassez global do fornecimento de água, desertificação, condições de estresse abiótico (ABS) (ex., seca, salinidade, osmótico, inundação, temperaturas não ideais tais como frio e calor, poluição química tóxica, radiação, deficiências de nutrientes e similares) juntamente com a presença de fontes limitadas de nitrogênio e fertilizante causam danos substanciais a plantas agrícolas tais como alterações importantes no metabolismo da planta, morte celular e diminuições no crescimento da planta e produtividade da safra.

[0011] A seca é um fenômeno gradativo que envolve períodos de clima irregularmente seco que persiste o suficiente para ocasionar desequilíbrios hidrológicos sérios tais como danos à safra, escassez no fornecimento de água e aumento da suscetibilidade a diversas doenças.

[0012] A salinidade afeta um em cinco hectares de terra irrigada. Nenhuma das cinco principais culturas alimentares, i.e., trigo, milho, arroz, batata e soja é capaz de tolerar sal em excesso. Os efeitos prejudiciais do sal em plantas resultam tanto do déficit de água, que leva ao estresse osmótico (similar ao estresse por seca), quanto do efeito do excesso de íons de sódio em processos bioquímicos críticos. Como ocorre com o congelamento e a seca, a alta concentração de sal ocasiona o déficit de água; e a alta concentração de sal faz com que as raízes das plantas tenham dificuldade em extrair a água de seu ambiente. Dessa forma, a salinação dos solos que são usados para produção agrícola é um problema significativo e cada vez maior em regiões que dependem decisivamente da agricultura, e é piorado pela utilização excessiva, fertilização excessiva e escassez de água, normalmente causados por alterações climáticas e pelas demandas de uma população cada vez maior.

[0013] Temperaturas extremas tais como abaixo do ideal ou temperaturas de calor afetam o crescimento e o desenvolvimento das plantas ao longo de todo o ciclo de vida da planta. Dessa forma, temperaturas baixas reduzem a taxa de germinação e temperaturas altas resultam em necrose das folhas. Além disso, plantas maduras que são expostas ao calor excessivo podem experimentar choque de calor, que pode se originar em diversos órgãos, inclusive as folhas e, em especial, frutos, quando a transpiração é insuficiente para superar o estresse do calor. O calor também danifica estruturas celulares, inclusive organelas e o citoesqueleto e prejudica a função da membrana. O choque de calor pode produzir uma diminuição na síntese geral das proteínas, acompanhada de uma expressão de proteínas de choque de calor, ex., chaperonas, que estão envolvidas no redobramento de proteínas desnaturadas pelo calor. O dano por altas temperaturas ao pólen quase sempre ocorre em conjunto com o estresse por seca e raramente ocorre em condições de boa umidificação. O estresse combinado pode alterar o metabolismo da planta de novas maneiras. Condições de resfriamento excessivo, ex., temperaturas baixas, mas acima do congelamento, afetam as safras de origens tropicais, tais como soja, arroz, milho e algodão. Os danos por resfriamento típicos incluem definhamento, necrose, clorose ou vazamento de íons das membranas celulares. Condições de luz excessiva, que ocorrem em condições atmosféricas limpas subsequentes a noites frias e tardias de verão/outono, podem levar à fotoinibição da fotossíntese (interrupção da fotossíntese). Além disso, o resfriamento pode levar a perdas de produção e qualidade de produto inferior através da maturação atrasada do milho.

[0014] As deficiências de nutrientes causam adaptações da arquitetura da raiz, particular e notavelmente, por exemplo, é a proliferação da raiz em pequenos pedaços de terra ricos em nutrientes para aumentar a absorção de nutrientes. As deficiências de nutrientes também causam a ativação de uma série de reações químicas metabólicas da planta que maximizam os processos de absorção, assimilação e distribuição tais como ativando alterações de arquitetura. A engenharia da expressão dos genes acionados pode fazer com que a planta exiba as alterações de arquitetura e um metabolismo aprimorado também sob outras condições.

[0015] Além disso, é bastante difundido que plantas normalmente respondem à deficiência de água criando um sistema de raízes mais profundas que permite o acesso à umidade situada em camadas mais profundas do solo. O desencadeamento desse efeito permitirá que as plantas acessem nutrientes e água situados em horizontes de solos mais profundos em especial aqueles imediatamente dissolvidos em nitratos como a água.

[0016] A produção é afetada por diversos fatores tais como o número e o tamanho dos órgãos da planta, a arquitetura da planta (por exemplo, o número de ramos), o comprimento definido dos grãos, o número de grãos preenchidos, vigor (ex. muda), taxa de crescimento, desenvolvimento da raiz, utilização de água, nutrientes (ex., nitrogênio) e fertilizantes e tolerância ao estresse.

[0017] Safras tais como, milho, arroz, trigo, canola e soja são responsáveis por mais da metade da ingestão calórica humana total, seja por consumo direto das próprias sementes ou através do consumo de produtos alimentícios produzidos em forragem ou sementes processadas. As sementes também são uma fonte de açúcares, proteínas, óleos e metabólitos utilizados em processos industriais. A capacidade de aumentar a produção das plantas, seja pelo aumento da taxa de acúmulo de matéria seca, modificando a composição de lignina ou celulose, aumento da força do caule, ampliação do tamanho do meristema, alteração do padrão de ramificação da planta, ereção das folhas, aumento na eficiência da fertilização, taxa aprimorada de acúmulo de matéria seca da semente, modificação do desenvolvimento da semente, preenchimento aprimorado da semente ou aumento do teor de óleo, amido ou proteína nas sementes poderia ter muitas aplicações em usos agrícolas e não agrícolas tais como na produção biotecnológica de produtos farmacêuticos, anticorpos ou vacinas.

[0018] A publicação WO N° 2009/013750 divulga genes, combinações e métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico, biomassa e/ou produção em plantas geradas com isso.

[0019] A publicação WO N° 2008/122980 divulga genes, combinações e métodos para aumentar o teor de óleo, a taxa de crescimento e biomassa das plantas.

[0020] A publicação WO N° 2008/075364 divulga polinucleotídeos envolvidos no desenvolvimento da fibra vegetal e métodos de utilizá-los.

[0021] A publicação WO N° 2007/049275 divulga polipeptídeos isolados, polinucleotídeos codificando-os, plantas transgênicas expressando- os e métodos para sua utilização para aumentar a eficiência de uso de fertilizantes, tolerância da planta ao estresse abiótico e biomassa.

[0022] A publicação WO N° 2004/104162 divulga métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou biomassa em plantas e plantas geradas por meio disso.

[0023] A publicação WO N° 2005/121364 divulga polinucleotídeos e polipeptídeos envolvidos no desenvolvimento da fibra vegetal e métodos e métodos de utilizá-los para melhorar a qualidade da fibra, produção e/ou biomassa de uma planta produtora de fibras.

[0024] A publicação WO N° 2007/020638 divulga métodos para aumentar a tolerância ao estresse abiótico e/ou biomassa em plantas e plantas geradas através disso.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0025] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provido um método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntica à SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130-137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364666, 671, 673-1333, 2414-2441, 2443-2445, 2447-2455, 2458-2495, 24972505, 2507-2511, 2513-2521 ou 2522, com isso aumentando eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[0026] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provido um método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130-137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364-666, 671, 673-1333, 2414-2441, 2443-2445, 2447-2455, 24582495, 2497-2505, 2507-2511, 2513-2522, 3, 5, 6, 9, 10, 14, 15, 20, 61, 62, 129, 288, 294, 307, 363, 667, 668, 669, 670, 672, 2398-2413, 2456 e 2457, com isso aumentando a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[0027] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provido um método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo pelo menos 80% idêntico à SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154-156, 158-161, 163-183, 185-187, 189-197, 200-237, 239-264, 266269, 1351, 1365-1425, 1429-1457, 1459, 1461-1730, 1735, 1739-2397, 25332541, 2544-2556, 2558, 2559, 2561-2562 or 2563, com isso aumentando a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[0028] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provido um método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154-156, 158-161, 163-183, 185-187, 189-197, 200-237, 239-264, 266-269, 1351, 1365-1425, 1429-1457, 1459, 1461-1730, 1735, 1739-2397, 2533-2541, 2544-2556, 2558, 2559, 2561-2563, 138-143, 146, 148, 150-152, 157, 162, 198, 265, 1334-1350, 1352-1364, 1426-1428, 1458, 1460, 1732-1734, 1737-1738, 2523-2532, 2542 e 2543, com isso aumentando a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[0029] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provido um método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes e/ou teor de óleo de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntica à SEQ ID N°: 3, 5, 6, 9, 10, 14, 15, 288, 294, 2398-2412 ou 2413, com isso aumentando a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, e/ou teor de óleo da planta.

[0030] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provido um método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes e/ou teor de óleo de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 3, 5, 6, 9, 10, 14, 15, 288, 294, 2398-2413, com isso aumentando a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes e/ou teor de óleo da planta.

[0031] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente é provido um método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes e/ou teor de óleo de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo pelo menos 80% idêntico à SEQ ID N°: 138-153, 1334-1350, 1352-1364, 1458, 1460, 2523-2531 ou 2532, com isso aumentando a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes e/ou teor de óleo da planta.

[0032] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provido um método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes e/ou teor de óleo de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 138-153, 13341350, 1352-1364, 1458, 1460, 2523-2532, com isso aumentando a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes e/ou teor de óleo da planta.

[0033] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntica à SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364-666, 671, 673-1333, 24142441, 2443-2445, 2447-2455, 2458-2495, 2497-2505, 2507-2511, 2513-2521 ou 2522, onde a sequência de ácido nucléico é capaz de aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou estresse abiótico de uma planta.

[0034] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de ácido nucléico selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 2160, 63-128, 130-137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364-666, 671, 673-1333, 2414-2441, 2443-2445, 2447-2455, 2458-2495, 2497-2505, 25072511, 2513-2522, 3, 5, 6, 9, 10, 14, 15, 20, 61, 62, 129, 288, 294, 307, 363, 667, 668, 669, 670, 672, 2398-2413, 2456 e 2457.

[0035] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% homóloga à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154-156, 158-161, 163-183, 185-187, 189-197, 200-237, 239-264, 266-269, 1351, 1365-1425, 1429-1457, 1459, 1461-1730, 1735, 1739-2397, 2533-2541, 2544-2556, 2558, 2559, 2561-2562 ou 2563, onde a sequência de aminoácidos é capaz de aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[0036] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154-156, 158-161, 163-183, 185-187, 189197, 200-237, 239-264, 266-269, 1351, 1365-1425, 1429-1457, 1459, 14611730, 1735, 1739-2397, 2533-2541, 2544-2556, 2558, 2559, 2561-2563, 138143, 146, 148, 150-152, 157, 162, 198,265, 1334-1350, 1352-1364, 14261428, 1458, 1460, 1732-1734, 1737-1738, 2523-2532, 2542 e 2543.

[0037] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provido uma combinação de ácido nucléico compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucléico em uma célula hospedeira.

[0038] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% homóloga à SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154-156, 158-161, 163-183, 30 185-187, 189-197, 200237, 239-264, 266-269, 1351, 1365-1425, 1429-1457, 1459, 1461-1730, 1735, 1739-2397, 2533-2541, 2544-2556, 2558, 2559, 2561-2562 ou 2563, onde a sequência de aminoácidos é capaz de aumentar eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[0039] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provido um polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154-156, 158-161, 163-183, 185-187, 189197, 200-237, 239-264, 266-269, 1351, 1365-1425, 1429-1457, 1459, 14611730, 1735, 1739-2397, 2533-2541, 2544-2556, 2558, 2559, 2561-2563, 138143, 146, 148, 150-152, 157, 162, 198, 265, 1334-1350, 1352-1364, 14261428, 1458, 1460, 1732-1734, 1737-1738, 2523-2532, 2542 e 2543.

[0040] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provida uma célula vegetal que expressa de forma exógena o polinucleotídeo da invenção ou a combinação de ácido nucléico da invenção.

[0041] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção é provida uma célula vegetal que expressa de forma exógena o polipeptídeo da invenção.

[0042] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácido nucléico é conforme estabelecida na SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364-666, 671, 673-1333, 24142441, 2443-2445, 2447-2455, 2458-2495, 2497-2505, 2507-2511, 2513-2521 ou 2522.

[0043] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo consiste na sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130-137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364-666, 671, 673-1333, 2414-2441, 2443-2445, 2447-2455, 24582495, 2497-2505, 2507-2511, 2513-2522.

[0044] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácido nucléico codifica uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% homóloga à SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154-156, 158-161, 163-183, 185-187, 189-197, 200-237, 239-264, 266-269, 1351, 1365-1425, 1429-1457, 1459, 1461-1730, 1735, 1739-2397, 2533-2541, 2544-2556, 2558, 2559, 2561-2562 ou 2563.

[0045] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácido nucléico codifica a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154156, 158-161, 163-183, 185-187, 189-197, 200-237, 239-264, 266-269, 1351, 1365-1425, 1429-1457, 1459, 1461-1730, 1735, 1739-2397, 2533-2541, 2544-2556, 2558, 2559, 2561-2563.

[0046] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácido nucléico é conforme estabelecida na SEQ ID N°: 3, 5, 6, 9, 10, 14, 15, 288, 294, 2398-2412 ou 2413.

[0047] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo consiste na sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 3, 5, 6, 9, 10, 14, 15, 288, 294, 23982413.

[0048] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácido nucléico codifica uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% homóloga à SEQ ID N°: 138-153, 1334-1350, 1352-1364, 1458, 1460, 2523-2531 ou 2532.

[0049] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácido nucléico codifica a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 138-153, 1334-1350, 13521364, 1458, 1460, 2523-2532.

[0050] De acordo com algumas configurações da invenção, a célula vegetal forma parte de uma planta.

[0051] De acordo com algumas configurações da invenção, o método ainda compreendendo o cultivo da planta expressando o polinucleotídeo exógeno sob estresse abiótico.

[0052] De acordo com algumas configurações da invenção, o estresse abiótico é selecionado dentre um grupo que consiste em salinidade, seca, privação de água, inundação, estiolamento, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade de metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e Irradiação UV.

[0053] De acordo com algumas configurações da invenção, a produção compreende produção de sementes ou produção de óleo.

[0054] A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e/ou científicos utilizados no presente documento têm o mesmo significado normalmente compreendido por alguém de habilidade comum na técnica à qual diz respeito a invenção. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser utilizados na prática ou teste de configurações da invenção, são descritos abaixo exemplos de métodos e/ou materiais. Em caso de conflito, a especificação da patente incluindo definições, aplicar-se-á. Além disso, os materiais, métodos e exemplos têm caráter somente ilustrativo e não se destinam necessariamente a limitar a invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES

[0055] Algumas configurações da invenção são descritas no presente documento somente como forma de exemplo, com referência às ilustrações em anexo. Agora se referindo especificamente às ilustrações detalhadas, é enfatizado que as especificidades mostradas são uma forma de exemplo e para fins de discussão ilustrativa de configurações da invenção. A esse respeito, a descrição feita com as ilustrações torna aparente àqueles com experiência na técnica como as configurações da invenção podem ser colocadas em prática.

[0056] Nas ilustrações: A figura 1 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário pGI utilizado para expressar as sequências do polinucleotídeo isolado de algumas configurações da invenção. RB - borda direita do T - DNA; LB - borda esquerda do T - DNA; H - enzima de restrição Hind III; X - enzima de restrição Xbal; B - enzima de restrição BamHI; S - enzima de restrição SalI; Sm - enzima de restrição SmaI; R-I - enzima de restrição EcoRI; Sc - SacI/SstI/Ecll36II; (números) - Extensão em pares-base; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = 15 gene de neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); GUSintron - o gene repórter GUS (sequência de codificação e íntron). As sequências de polinucleotídeo isolado da invenção foram clonadas no vetor ao substituir o gene repórter GUSintron; a figura 2 é uma ilustração esquemática do plasmídeo binário modificado pGI utilizado para expressar as sequências de polinucleotídeo isolado da invenção. RB - borda direita do T-DNA; LB - borda esquerda do T - DNA; MCS - Local de clonagem múltipla; RE - qualquer enzima de restrição; (números) - Extensão em pares-base; NOS pro = promotor da nopalina sintase; NPT-II = gene de neomicina fosfotransferase; NOS ter = terminador da nopalina sintase; Sinal Poli-A (sinal de poliadenilação); GUSintron - o gene repórter GUS (sequência de codificação e íntron) As sequências de polinucleotídeo isolado da invenção foram clonadas no vetor ao substituir o gene repórter GUSintron; e as figuras 3A-B são imagens que representam a visualização do desenvolvimento da raiz de plantas cultivadas em placas de ágar transparentes. Os diferentes transgenes foram cultivados em placas de ágar transparentes por 10 dias e as placas foram fotografadas a cada 3-4 dias começando no dia 1. Figura 3A - Uma imagem de uma fotografia de plantas tirada após 10 dias em placas de ágar. Figura 3B - Uma imagem da análise da raiz na qual a extensão da raiz medida é representada por uma seta vermelha.

DESCRIÇÃO DE CONFIGURAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

[0057] A presente invenção, em algumas de suas configurações, está relacionada a polinucleotídeos e polipeptídeos isolados, vetores de expressão compreendendo-os e plantas transgênicas expressando-os e, mais especificamente, mas não exclusivamente, a métodos para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, produção, biomassa, vigor, taxa de crescimento, teor de óleo e tolerância ao estresse abiótico de uma planta utilizando-os.

[0058] Antes de explicar pelo menos uma configuração da invenção em detalhes, deve ser compreendido que a invenção em sua aplicação não se limita necessariamente aos detalhes estabelecidos na descrição a seguir ou exemplificados pelos exemplos. A invenção é capaz de outras configurações ou de ser praticada ou executada de diversas formas.

[0059] Ao reduzir a presente invenção à prática, os presentes inventores identificaram novos polipeptídeos e polinucleotídeos que podem ser usados para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, a eficiência de uso de água, produção, taxa de crescimento, biomassa, teor de óleo, vigor e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[0060] Dessa forma, conforme mostrado na seção de exemplos a seguir, os presentes inventores utilizaram ferramentas de bioinformática para gerar perfis de expressão digital de agrupamentos de genes cujo nível de expressão é associado a diversas condições e estresses tais como deficiência de nutrientes, frio, salinidade, seca, estresse por calor, estiolamento, alagamento e estresse oxidativo (Tabelas 1-19; Exemplo 1 da Seção de exemplos a seguir), e com base nos perfis de expressão identificaram genes dos quais se espera o aprimoramento da eficiência de uso do nitrogênio, biomassa, taxa de crescimento, produção, vigor, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta (Tabela 20; polinucleotídeo SEQ ID N°: 1137; polipeptídeos SEQ ID N°: 138-269; Exemplo 1 da seção de exemplos a seguir). Polipeptídeos e polinucleotídeos homólogos contendo a mesma função também foram identificados (Tabela 21, polinucleotídeo SEQ ID N°:270-1333; polipeptídeo SEQ ID N°: 1334-2397; Exemplo 2 da seção de exemplos a seguir). Para testar o efeito dos genes isolados no traço de interesse, os polinucleotídeos foram clonados nos vetores binários (Tabela 23, polinucleotídeo SEQ ID N°: 2398-2522; Exemplo 3 da seção de exemplos a seguir) e as proteínas previstas foram identificadas (Tabela 23, Exemplo 3). Foi constatado que plantas transgênicas com excesso de expressão dos polinucleotídeos identificados apresentam aumento de eficiência de uso do nitrogênio, produção, biomassa, áreas fotossintéticas e taxa de crescimento (Tabelas 24-521 Exemplos 5, 6 e 7 da seção de exemplos a seguir), bem como aumento de tolerância ao estresse abiótico (ex., sob estresse de salinidade; Tabelas 53-55, Exemplo 8 da seção de exemplos a seguir). No todo, esses resultados sugerem a utilização dos novos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção e suas sequências homólogas para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção (inclusive a produção de óleo, a produção de sementes e o teor de óleo), taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta.

[0061] Assim, de acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção, é provido um método para aumentar a eficiência de uso de fertilizantes, a eficiência de uso do nitrogênio, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta, compreendendo expressar dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo a sequência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntica à SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130-137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364666, 671, 673-1333, 2414-2441, 2443-2445, 2447-2455, 2458-2495, 24972505, 2507-2511, 2513-2521 ou 2522, com isso aumentando a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, eficiência de uso de água e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[0062] Conforme utilizada no presente documento, a frase "eficiência de uso de fertilizantes" refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que levam a um aumento da produção, biomassa, vigor, e taxa de crescimento por unidade de fertilizante aplicada na planta. O processo metabólico pode ser a absorção, dispersão, absorvente (sic), acúmulo, remanejamento (dentro da planta) e utilização de um ou mais dos minerais e partes orgânicas absorvidos pela planta, tais como nitrogênio, fosfatos e/ou potássio.

[0063] Conforme utilizada no presente documento, a frase "condições limitadas por fertilizantes" refere-se às condições de crescimento que incluem um nível (ex., concentração) de um fertilizante aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade normais da planta.

[0064] Conforme utilizada no presente documento, a frase "eficiência de uso do nitrogênio (EUN)" refere-se ao(s) processo(s) metabólico(s) que levam a um aumento na produção, biomassa, vigor, e taxa de crescimento por unidade de nitrogênio aplicada na planta. O processo metabólico pode ser a absorção, dispersão, absorvente, acúmulo, remanejamento (dentro da planta) e utilização do nitrogênio absorvido pela planta.

[0065] Conforme utilizada no presente documento, a frase "condições limitadas pelo nitrogênio" refere-se às condições de crescimento que incluem um nível (ex., concentração) de nitrogênio (ex., amônio ou nitrato) aplicado que está abaixo do nível necessário para o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade normais da planta.

[0066] EUN e EUF melhoradas são traduzidas no campo como a colheita de quantidades similares de produção, implementando menos fertilizantes, ou produções maiores obtidas com a implementação dos mesmos níveis de fertilizantes. Dessa forma, EUN ou EUF aprimoradas têm um efeito direto na produção da planta no campo. Assim, os polinucleotídeos e polipeptídeos de algumas configurações da invenção afetam positivamente a produção da planta, a produção de sementes e a biomassa da planta. Além disso, o benefício da EUN melhorada irá certamente melhorar a qualidade da safra e os componentes bioquímicos da semente tais como a produção de proteínas e a produção de óleo.

[0067] Conforme utilizada no presente documento, a frase "produção da planta" refere-se à quantia (conforme determinada por peso ou tamanho) ou quantidade (números) de tecido produzido por planta ou por época de cultivo. Por isso o aumento da produção poderia afetar o benefício econômico que se pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou tempo de cultivo.

[0068] Deve ser observado que a produção da planta pode ser afetada por diversos parâmetros incluindo, entre outros, biomassa da planta; vigor da planta; taxa de crescimento; produção de sementes; quantidade de grãos ou sementes; qualidade dos grãos ou sementes; produção de óleo; teor de óleo, amido e/ou proteína em órgãos ceifados (ex., sementes ou partes vegetativas da planta); número de flores (florículos) por panícula (expressa como uma taxa do número de sementes preenchidas sobre o número de panículas primárias); índice de colheita; número de plantas cultivadas por área; número e tamanho de órgãos ceifados por planta e por área; número de plantas por área de cultivo (densidade); número de órgãos ceifados no campo; área de folhagem total; assimilação de carbono e particionamento de carbono (a distribuição/alocação do carbono dentro da planta); resistência à sombra; número de órgãos ceifáveis (ex. sementes), sementes por vagem, peso por semente; e arquitetura modificada [tal como aumento do diâmetro ou espessura do caule ou aprimoramento de propriedades físicas (ex. elasticidade)].

[0069] Conforme utilizada no presente documento, a frase "biomassa da planta" refere-se à quantia (medida em gramas de tecido seco ao ar) de um tecido produzido a partir da planta em uma época de cultivo, o que também poderia determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por área de cultivo. Um aumento na biomassa da planta pode ser na planta toda ou em suas partes tais como partes acima do solo (ceifáveis), biomassa vegetativa, raízes e sementes.

[0070] Conforme utilizada no presente documento, a frase "taxa de crescimento" refere-se ao aumento de massa ou tamanho dos órgãos da planta por tempo (pode ser medida em cm2 por dia, dia ou como o coeficiente de regressão do curso no decorrer do tempo).

[0071] Conforme utilizada no presente documento, a frase "vigor da planta" refere-se à quantia (medida por peso) de tecido produzido pela planta em um determinado tempo. Por isso um aumento de vigor poderia determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por tempo de cultivo ou área de cultivo. Além disso, o vigor precoce (semente e/ou muda) resulta em uma sustentação melhorada do campo.

[0072] Conforme utilizada no presente documento, a frase "produção de sementes" refere-se ao número ou peso de sementes por planta, sementes por vagem, ou por área de cultivo ou ao peso de uma única semente, ou ao óleo extraído por semente. Portanto a produção de sementes pode ser afetada pelas dimensões da semente (ex., comprimento, largura, perímetro, área e/ou volume), número de sementes (preenchidas) e taxa de preenchimento de sementes e por teor de óleo da semente. Portanto, um aumento na produção de sementes por planta poderia afetar o benefício econômico que se pode obter da planta em uma determinada área de cultivo e/ou tempo de cultivo; e um aumento na produção de sementes por área de cultivo poderia ser obtido aumentando a produção de sementes por planta e/ou aumentando o número de plantas cultivadas na mesma determinada área.

[0073] O termo "semente" (também denominado "grão") conforme utilizado no presente documento refere-se a uma pequena planta embrionária encerrada em uma cobertura chamada de casca da semente (normalmente com algum alimento armazenado), o produto do óvulo amadurecido de plantas angiospermas e gimnospermas que ocorre após a fertilização e algum crescimento dentro da planta mãe.

[0074] A frase "teor de óleo" conforme utilizada no presente documento refere-se à quantia de lipídios em um determinado órgão da planta, sejam as sementes (teor de óleo da semente) ou a parte vegetativa da planta (teor de óleo vegetativo) e é normalmente expressa como a porcentagem de peso seco (10% da umidade das sementes) ou peso líquido (para a parte vegetativa).

[0075] Deve ser observado que o teor de óleo é afetado pela produção de óleo intrínseca de um tecido (ex., semente, parte vegetativa), bem como a massa ou tamanho do tecido produtor de óleo por planta ou por período de cultivo.

[0076] Em uma configuração, o aumento no teor de óleo da planta pode ser obtido aumentando o tamanho/massa do(s) tecido(s) de uma planta que compreendem óleo por período de cultivo. Dessa forma, o aumento do teor de óleo de uma planta pode ser obtido aumentando a produção, taxa de crescimento, biomassa e vigor da planta.

[0077] Deve ser observado que a produção da planta pode ser determinada em condições de estresse (ex., estresse abiótico, condições limitadas pelo nitrogênio) ou condições de não estresse (normais).

[0078] Conforme utilizada no presente documento, a frase "condições de não estresse" refere-se a condições de crescimento (ex., água, temperatura, ciclos de presença/ausência de luz, umidade, concentração de sal, concentração de fertilizante no solo, fornecimento de nutrientes tais como nitrogênio, fosforoso (sic) e/ou potássio), que possibilitam metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade normais de uma planta em qualquer etapa de seu ciclo de vida (da semente à planta madura e de volta à semente novamente). Deve ser observado que embora as condições de não estresse possam incluir algumas variações moderadas das condições ideais (que variam de um tipo/espécie de uma planta para outra), tais variações não fazem com que a planta deixe de crescer sem a capacidade de retomar o crescimento.

[0079] A frase "estresse abiótico", conforme utilizada no presente documento, refere-se a qualquer efeito adverso no metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade de uma planta. Como tal, o estresse abiótico pode ser induzido por condições de crescimento ambientais abaixo do ideal tais como, por exemplo, salinidade, privação de água, inundação, congelamento, baixa ou alta temperatura, toxicidade de metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, poluição atmosférica ou irradiação UV. As implicações do estresse abiótico são discutidas na seção Antecedentes da Invenção.

[0080] A frase "tolerância ao estresse abiótico", conforme utilizada no presente documento, refere-se à habilidade de uma planta de suportar um estresse abiótico sem sofrer uma alteração substancial no metabolismo, crescimento, produtividade e/ou viabilidade.

[0081] Conforme utilizada no presente documento, a frase "eficiência de uso de água (EUA)" refere-se ao nível de matéria orgânica produzida por unidade de água consumida pela planta, i.e., o peso seco de uma planta em relação ao uso de água da planta, ex., a biomassa produzida por transpiração de unidade.

[0082] Conforme utilizado no presente documento, o termo "aumento" refere-se a pelo menos aproximadamente 2%, pelo menos aproximadamente 3%, pelo menos aproximadamente 4%, pelo menos aproximadamente 5%, pelo menos aproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 15%, pelo menos aproximadamente 20%, pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80%, aumento na eficiência de uso do nitrogênio, eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, eficiência de uso de água e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta em comparação a uma planta nativa [i.e., uma planta não modificada com as biomoléculas (polinucleotídeos ou polipeptídeos) da invenção, ex., uma planta não transformada da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de crescimento].

[0083] Conforme utilizada no presente documento, a frase "polinucleotídeo exógeno" refere-se a uma sequência de ácido nucléico heteróloga que pode não ser naturalmente expressa dentro da planta ou cujo excesso de expressão na planta é desejado. O polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido na planta de maneira estável ou temporária, a fim de produzir uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) e/ou uma molécula de polipeptídeo. Deve ser observado que o polinucleotídeo exógeno pode compreender uma sequência de ácido nucléico que é idêntica ou parcialmente homóloga a uma sequência de ácido nucléico endógena da planta.

[0084] De acordo com algumas configurações da invenção o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácido nucléico que é pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 81%, pelo menos aproximadamente 82%, pelo menos aproximadamente 83%, pelo menos aproximadamente 84%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 86%, pelo menos aproximadamente 87%, pelo menos aproximadamente 88%, pelo menos aproximadamente 89%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, ex., 100% idêntica à sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364-666, 671, 673-1333, 24142441, 2443-2445, 2447-2455, 2458-2495, 2497-2505, 2507-2511,2513-2522.

[0085] A identidade (ex., porcentagem de homologia) pode ser determinada utilizando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastN do National Center of Biotechnology Information (NCBI) tal como utilizando parâmetros padrão.

[0086] De acordo com algumas configurações da invenção o polinucleotídeo exógeno é pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente 81%, pelo menos 83%, pelo menos 85%, pelo menos 87%, pelo menos 89%, pelo menos 91%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente 82%, pelo menos 84%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, ex., 100% idêntico ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130-137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364-666, 671, 6731333, 2414-2441, 2443-2445, 2447-2455, 2458-2495, 2497-2505, 2507-2511, 2513-2522.

[0087] De acordo com algumas configurações da invenção o polinucleotídeo exógeno é estabelecido pela SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130-137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364-666, 671, 673-1333, 2414-2441, 2443-2445, 2447-2455, 2458-2495, 2497-2505, 2507-2511, 2513-2521 ou 2522.

[0088] Conforme utilizado no presente documento o termo "polinucleotídeo" refere-se a uma sequência de ácido nucléico de um ou dois filamentos que é isolada e provida na forma de uma sequência de RNA, uma sequência de polinucleotídeo complementar (cDNA), uma sequência de polinucleotídeo genômica e/ou sequências de polinucleotídeo compostas (ex., uma combinação dos itens acima).

[0089] O termo "isolado" refere-se a pelo menos parcialmente separado do ambiente natural ex., de uma célula vegetal.

[0090] Conforme utilizada no presente documento, a frase "sequência de polinucleotídeo complementar" refere-se a uma sequência que resulta da transcrição reversa do RNA mensageiro utilizando uma transcriptase reversa ou qualquer outra DNA polimerase dependente de RNA. Tal sequência pode ser amplificada subsequentemente in vivo ou in vitro utilizando uma DNA polimerase dependente de DNA.

[0091] Conforme utilizada no presente documento, a frase "sequência de polinucleotídeo genômica" refere-se a uma sequência derivada (isolada) de um cromossomo e assim representa uma parte contígua de um cromossomo.

[0092] Conforme utilizada no presente documento, a frase "sequência de polinucleotídeo composta" refere-se a uma sequência que é pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. Uma sequência composta pode incluir algumas sequências exonais necessárias para codificar o polipeptídeo da presente invenção, bem como algumas sequências intrônicas se interpondo entre elas. As sequências intrônicas podem ser de qualquer fonte, inclusive de outros genes e normalmente incluem sequências de sinais de união conservadas. Tais sequências intrônicas podem ainda incluir elementos regulatórios de expressão de ação cis.

[0093] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção codifica um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos pelo menos aproximadamente 80%, pelo aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente menos 81%, 83%, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, pelo pelo pelo pelo pelo pelo pelo pelo pelo menos menos menos menos menos menos menos menos menos aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, pelo pelo pelo pelo pelo pelo pelo pelo pelo menos menos menos menos menos menos menos menos menos aproximadamente 99%, ou mais, digamos 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154-156, 158-161, 163-183, 185-187, 189-197, 200-237, 239-264, 266-269, 1351, 1365-1425, 1429-1457, 1459, 1461-1730, 1735, 1739-2397, 2533-2541, 2544-2556, 2558,2559, 2561-2563.

[0094] A homologia (ex., porcentagem de homologia) pode ser determinada utilizando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastP ou TBLASTN do National Center of Biotechnology Information (NCBI) tal como utilizando parâmetros padrão, ao começar a partir de uma sequência de polipeptídeo; ou o algoritmo tBLASTX (disponível através do NCBI) tal como utilizando parâmetros padrão, que compara os produtos de tradução conceitual de seis estruturas de uma sequência de consulta de nucleotídeos (ambos os filamentos) com um banco de dados de sequências de proteínas.

[0095] Sequências homólogas incluem tanto sequências ortólogas como sequências parálogas. O termo "parálogo" está relacionado a duplicações de genes dentro do genoma de uma espécie que leva a genes parálogos. O termo "ortólogo" está relacionado a genes homólogos em diferentes organismos devido à relação hereditária.

[0096] Uma opção para identificar ortólogas em uma espécie de planta monocotiledônea é realizando uma busca recíproca por blast. Isso pode ser feito por um primeiro blast envolvendo a utilização da sequência de interesse na blast comparada com qualquer banco de dados de sequência, tal como o banco de dados do NCBI disponível ao público em geral que pode ser encontrado em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Se foram buscadas ortólogas no arroz, a sequência de interesse seria comparada no blast com, por exemplo, os 28.469 clones inteiros de cDNA do Oryza sativa Nipponbare disponível na NCBI. Os resultados da blast podem ser filtrados. As sequências inteiras dos resultados filtrados ou dos resultados não filtrados são então novamente comparadas no blast (segundo blast) com as sequências do organismo do qual a sequência de interesse é derivada. Os resultados da primeira e segunda blasts são então comparados. Uma ortóloga é identificada quando a sequência resultante na maior pontuação (melhor acerto) na primeira blast identifica na segunda blast a sequência da consulta (a sequência de interesse original) como o melhor acerto. Utilizando a mesma lógica, é encontrada uma paráloga (homologa a um gene no mesmo organismo). No caso de famílias de sequências grandes, pode ser usado o programa ClustalW [http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html], seguido de uma neighbor joining tree (http://en.wikipedia.org/wiki/Neighbor-joining) que ajuda a visualizar o agrupamento (clustering).

[0097] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos estabelecida pela SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154-156, 158-161, 163-183, 185-187, 189-197, 200-237, 239-264, 266-269, 1351, 1365-1425, 1429-1457, 1459, 1461-1730, 1735, 1739-2397, 25332541, 2544-2556, 2558, 2559, 2561-2562 ou 2563.

[0098] De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção é provido um método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta. O método é executado expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno, compreendendo a sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130-137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364-666, 671, 673-1333, 2414-2441, 2443-2445, 2447-2455, 2458-2495, 2497-2505, 2507-2511, 2513-2522, 3, 5, 6, 9, 10, 14, 15, 20, 61, 62, 129, 288, 294, 307, 363, 667, 668, 669, 670, 672, 2398-2413, 2456 e 2457, com isso aumentando a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[0099] De acordo com algumas configurações da invenção o polinucleotídeo exógeno é estabelecido pela SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130-137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364-666, 671, 673-1333, 2414-2441, 2443-2445, 2447-2455, 2458-2495, 2497-2505, 2507-2511, 2513-2522, 3, 5, 6, 9, 10, 14, 15, 20, 61, 62, 129, 288, 294, 307, 363, 667, 668, 669, 670, 672, 2398-2413, 2456 ou 2457.

[00100] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção codifica um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154-156, 158-161, 163-183, 185-187, 189-197, 200-237, 239-264, 266-269, 1351, 1365-1425, 1429-1457, 1459, 1461-1730, 1735, 1739-2397, 2533-2541, 2544-2556, 2558, 2559, 2561-2563, 138-143, 146, 148, 150-152, 157, 162, 198, 265, 1334-1350, 1352-1364, 1426- 1428, 1458, 1460, 1732-1734, 1737-1738, 2523-2532, 2542 e 2543, com isso aumentando a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo e/ou tolerância ao estresse abiótico da planta.

[00101] De acordo com um aspecto de algumas configurações da invenção é provido um método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes e/ou teor de óleo de uma planta. O método é executado expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno compreendendo uma sequência de ácido nucléico pelo menos 80% idêntica à SEQ ID N°: 3, 5, 6, 9, 10, 14, 15, 288, 294, 2398-2412 ou 2413, com isso aumentando a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, e/ou teor de óleo da planta.

[00102] De acordo com algumas configurações da invenção o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácido nucléico que é pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 81%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, ex., 100% idêntica à sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 3, 5, 6, 9, 10, 14, 15, 288, 294, 2398-2413.

[00103] De acordo com algumas configurações da invenção o polinucleotídeo exógeno é pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 81%, pelo menos aproximadamente 82%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, ex., 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 3, 5, 6, 9, 10, 14, 15, 288, 294, 2398-2413.

[00104] De acordo com algumas configurações da invenção o polinucleotídeo exógeno é estabelecido pela SEQ ID N°: 3, 5, 6, 9, 10, 14, 15, 288, 294, 2398-2412 ou 2413.

[00105] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno da invenção codifica um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 99%, ou mais, digamos 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 138- 153, 1334-1350, 1352-1364, 1458, 1460, 2523-2532.

[00106] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos estabelecida pela SEQ ID N°: 138-153, 1334-1350, 13521364, 1458, 1460, 2523-2531 ou 2532.

[00107] Sequências de ácido nucléico que codificam os polipeptídeos da presente invenção podem ser otimizadas para expressão. Exemplos não limitadores de sequências de ácido nucléico otimizadas são providos na SEQ ID N°: 2415, 2420, 2428, 2430, 2431, 2436, 2437, 2441, 2444, 2445, 2446, 2451, 2456, 2468, 2471, 2478, 2481, 2484, 2520 e 2522 (Tabela 23). Exemplos de tais modificações de sequências incluem, entre outros, um teor de G/C alterado para abordar mais de perto aquele normalmente encontrado na espécie de planta de interesse e a remoção de códons atipicamente encontrados na espécie de planta comumente denominada otimização de códon.

[00108] A frase "otimização de códon" refere-se à seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para uso dentro de um gene estrutural ou de um fragmento seu que aborda a utilização do códon dentro da planta de interesse. Então, um gene ou uma sequência de ácido nucléico otimizada refere-se ao gene no qual a sequência de nucleotídeos de um gene nativo ou de ocorrência natural tenha sido modificada para utilizar códons preferidos ou favorecidos estatisticamente dentro da planta. A sequência de nucleotídeos é normalmente examinada no nível do DNA e a região de codificação é otimizada para expressão na espécie de planta determinada utilizando qualquer procedimento adequado, por exemplo, conforme descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). Nesse método, o desvio padrão da utilização do códon, uma medida da tendência de utilização do códon, pode ser calculado encontrando primeiro o desvio proporcional ao quadrado de utilização de cada códon do gene nativo em relação àquele de genes de planta de alta expressão, seguido de um cálculo desvio médio ao quadrado. A fórmula utilizada é: 1 SDCU = n = 1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N, onde Xn refere-se à frequência de utilização do códon n em genes de planta de alta expressão, onde Yn refere-se à frequência de utilização do códon n no gene de interesse e N refere-se ao número total de códons no gene de interesse. Foi compilada uma tabela da utilização de códons de genes de alta expressão de plantas dicotiledôneas utilizando os dados de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498).

[00109] Um método de otimizar a sequência de ácido nucléico de acordo com a utilização preferida do códon para um tipo específico de célula vegetal é baseado no uso direto, sem a realização de nenhum cálculo estatístico extra, de tabelas otimização de códon tais como aquelas oferecidas online no Banco de Dados de Utilização de Códons através do banco de DNA do NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences) no Japão (http://www.kazusa.or.jp/codon/). O Banco de Dados de Utilização de Códons contém tabelas de utilização de códons para uma série de diferentes espécies, com cada tabela de utilização de códons tendo sido estatisticamente determinada com base nos dados presentes no Genbank.

[00110] Utilizando as tabelas acima para determinar os códons mais preferidos ou mais favorecidos para cada aminoácido em uma espécie específica (por exemplo, arroz), uma sequência de nucleotídeos de ocorrência natural codificando uma proteína de interesse pode ser otimizada para códon para aquela espécie de planta em especial. Isso é realizado substituindo códons que possam ter uma baixa incidência estatística no genoma da espécie em particular com códons correspondentes, com relação a um aminoácido, que são estatisticamente mais favorecidos. No entanto, um ou mais códons menos favorecidos podem ser selecionados para apagar locais de restrição existentes, para criar novos em junções potencialmente úteis (extremidades de 5' e 3' para adicionar peptídeo sinal ou cassetes de terminação, locais internos que poderiam ser usados para cortar e juntar segmentos para produzir uma sequência inteira correta), ou para eliminar sequências de nucleotídeos que podem afetar negativamente a estabilidade ou expressão do mRNA.

[00111] A sequência de nucleotídeos de codificação de ocorrência natural pode já, antes de qualquer modificação, conter uma série de códons que correspondem a um códon estatisticamente favorecido em uma espécie de planta específica. Então, a otimização do códon da sequência de nucleotídeos nativa pode compreender a determinação de quais códons, dentro da sequência de nucleotídeos nativa, não são estatisticamente favorecidos com relação a uma planta em especial, e a modificação desses códons de acordo com a tabela de utilização de códons da planta em particular para produzir um derivado de códon otimizado. Uma sequência de nucleotídeos modificada pode ser total ou parcialmente otimizada para utilização de códon da planta contanto que a proteína codificada pela sequência de nucleotídeos modificada seja produzida em um nível maior do que a proteína codificada pelo gene nativo ou de ocorrência natural correspondente. A construção de genes sintéticos alterando a utilização do códon é descrita, por exemplo, no Pedido de Patente PCT 93/07278.

[00112] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é um RNA não codificador.

[00113] Conforme utilizada no presente documento, a frase “RNA não codificador” refere-se a uma molécula de RNA que não codifica uma sequência de aminoácidos (um polipeptídeo). Exemplos de tais moléculas de RNA não codificador incluem, entre outros, um RNA antissentido, um pré- miRNA (precursor de um microRNA) ou um precursor de um RNA de interação com Piwi (piRNA).

[00114] De acordo com uma configuração específica, o polinucleotídeo não codificador compreende a sequência de ácido nucléico da SEQ ID N°: 64 ou 2459 (NUE512).

[00115] Assim, a invenção abrange sequências de ácido nucléico descritas anteriormente no presente documento; seus fragmentos, sequências hibridizáveis com elas, sequências homólogas a elas, sequências que codificam polipeptídeos similares com diferente utilização de códons, sequências alteradas caracterizadas por mutações tais como deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, sejam por ocorrência natural ou induzidas pelo homem, sejam aleatoriamente ou de maneira dirigida.

[00116] A invenção provê um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 81%, pelo menos aproximadamente 82%, pelo menos aproximadamente 83%, pelo menos aproximadamente 84%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 86%, pelo menos aproximadamente 87%, pelo menos aproximadamente 88%, pelo menos aproximadamente 89%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, ex., 100% idêntica ao polinucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130-137, 270-287, 289-293 , 295-306, 308-362, 364-666, 671, 673- 1333 , 2414-2441, 2443-2445, 2447-2455, 2458-2495, 2497-2505, 25072511, 2513-2522.

[00117] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de ácido nucléico é capaz de aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência de uso de água de uma planta.

[00118] De acordo com algumas configurações da invenção o polinucleotídeo isolado compreendendo a sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130-137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364-666, 671, 673-1333, 2414-2441, 2443-2445, 2447-2455, 2458-2495, 2497-2505, 2507-2511, 2513-2522, 3, 5, 6, 9, 10, 14, 15, 20, 61, 62, 129, 288, 294, 307, 363, 667, 668, 669, 670, 672, 2398-2413, 2456 e 2457.

[00119] De acordo com algumas configurações da invenção o polinucleotídeo isolado é estabelecido pela SEQ ID N°: 2506, 2512, 2442, 2496, 2446, 1, 2, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16-19, 21-60, 63-128, 130-137, 270-287, 289-293, 295-306, 308-362, 364-666, 671, 673-1333, 2414-2441, 2443-2445, 2447-2455, 2458-2495, 2497-2505, 2507-2511, 2513-2522, 3, 10 5, 6, 9, 10, 14, 15, 20, 61, 62, 129, 288, 294, 307, 363, 667, 668, 669, 670, 672, 23982413, 2456 ou 2457.

[00120] A invenção provê um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 81%, pelo menos aproximadamente 82%, pelo menos aproximadamente 83%, pelo menos aproximadamente 84%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 86%, pelo menos aproximadamente 87%, pelo menos aproximadamente 88%, pelo menos aproximadamente 89%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, ou mais, digamos 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154-156, 158- 161, 163-183, 185-187, 189-197, 200-237, 239-264, 266-269, 1351, 13651425, 1429-1457, 1459, 1461-1730, 1735, 1739-2397, 2533-2541, 25442556, 2558, 2559, 2561-2563.

[00121] De acordo com algumas configurações da invenção a sequência de aminoácidos é capaz de aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, a eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência de uso de água de uma planta.

[00122] A invenção provê um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154-156, 158-161, 163183, 185-187, 189-197, 200-237, 239-264, 266-269, 1351, 1365-1425, 14291457, 1459, 1461-1730, 1735, 1739-2397, 2533-2541, 2544-2556, 2558, 2559, 2561-2563, 138-143, 146, 148, 150-152, 157, 162, 198, 265, 13341350, 1352-1364, 1426-1428, 1458, 1460, 1732-1734, 1737-1738, 2523- 2532, 2542 e 2543.

[00123] A invenção provê um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 81%, pelo menos aproximadamente 82%, pelo menos aproximadamente 83%, pelo menos aproximadamente 84%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 86%, pelo menos aproximadamente 87%, pelo menos aproximadamente 88%, pelo menos aproximadamente 89%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, ou mais, digamos 100% homóloga a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154156, 158-161, 163-183, 185-187, 189-197, 200-237, 239-264, 266-269, 1351, 1365-1425, 1429-1457, 1459, 1461-1730, 1735, 1739-2397, 2533-2541, 2544-2556, 2558, 2559, 2561-2563.

[00124] De acordo com algumas configurações da invenção, o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154156, 158-161, 163-183, 185-187, 189-197, 200-237, 239-264, 266-269, 1351, 1365-1425, 1429-1457, 1459, 1461-1730, 1735, 1739-2397, 2533-2541, 2544-2556, 2558, 2559, 2561-2563, 138-143, 146, 148, 150-152, 157, 162, 198, 265, 1334-1350, 1352-1364, 1426-1428, 1458, 1460, 1732-1734, 17371738, 2523-2532, 2542 e 2543.

[00125] De acordo com algumas configurações da invenção, o polipeptídeo é estabelecido pela SEQ ID N°: 2557, 2560, 184, 238, 188, 154156, 158-161, 163-183, 185-187, 189-197, 200-237, 239-264, 266-269, 1351, 1365-1425, 1429-1457, 1459, 1461-1730, 1735, 1739-2397, 2533-2541, 2544-2556, 2558, 2559, 2561-2563, 138-143, 146, 148, 150-152, 157, 162, 198, 265, 1334-1350, 1352-1364, 1426-1428, 1458, 1460, 1732-1734, 17371738, 2523-2532, 2542 ou 2543.

[00126] A invenção também abrange fragmentos dos polipeptídeos e polipeptídeos descritos acima contendo mutações, tais como deleções, inserções ou substituições de um ou mais aminoácidos, sejam por ocorrência natural ou induzidas pelo homem, sejam aleatoriamente ou de maneira dirigida.

[00127] O termo '"planta" conforme utilizado no presente documento abrange plantas inteiras, ancestrais e progênie das plantas e partes das plantas, incluindo sementes, brotos, tronco, raízes (incluindo bulbos) e células vegetais, tecidos e órgãos. A planta pode ter qualquer forma incluindo culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen e microesporos. Plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em especial plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo uma forragem ou legume de forragem, planta ornamental, cultura agrícola, árvore ou arbusto selecionado a partir da lista que compreende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorgo bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargo, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, couve-manteiga, linheiro, couve, lentilha, colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, tomate, chá de abóbora, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilha, lentilha e alfafa, algodão, semente de colza, canola, pimenta, girassol, tabaco, berinjela, eucalipto, uma árvore, uma planta ornamental, grama perene e cultura de forragem. De maneira alternativa, algas e outras não Viridiplantae podem ser usadas para os métodos da presente invenção.

[00128] De acordo com algumas configurações da invenção, a planta utilizada pelo método da invenção é uma planta de cultura agrícola tal como arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliveira, óleo de palma, banana, soja, girassol, canola, cana-de-açúcar, alfafa, painço, leguminosas (feijão, ervilha), linheiro, lupino, semente de colza, tabaco, álamo e algodão.

[00129] De acordo com algumas configurações da invenção, é provida uma célula vegetal que expressa exogenamente o polinucleotídeo de algumas configurações da invenção, a combinação de ácido nucléico de algumas configurações da invenção e/ou o polipeptídeo de algumas configurações da invenção.

[00130] De acordo com algumas configurações da invenção, a expressão do polinucleotídeo exógeno da invenção dentro da planta é executada transformando uma ou mais células da planta com o polinucleotídeo exógeno, seguida pela geração de uma planta madura a partir das células transformadas e o cultivo da planta madura em condições adequadas para expressar o polinucleotídeo exógeno dentro da planta madura.

[00131] De acordo com algumas configurações da invenção, a transformação é executada introduzindo na célula vegetal uma combinação de ácido nucléico que inclui o polinucleotídeo exógeno de algumas configurações da invenção e pelo menos um promotor para direcionar a transcrição do polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira (uma célula vegetal). Maiores detalhes sobre abordagens de transformação apropriadas são fornecidas abaixo no presente documento.

[00132] De acordo com algumas configurações da invenção, é provida uma combinação de ácido nucléico compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção, e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucléico do polinucleotídeo isolado em uma célula hospedeira.

[00133] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo isolado é operavelmente ligado à sequência do promotor.

[00134] Uma sequência de ácido nucléico codificadora é "operavelmente ligada" a uma sequência reguladora (ex., promotor) se a sequência reguladora for capaz de exercer um efeito regulatório sobre a sequência codificadora ligada a ela.

[00135] Conforme utilizado no presente documento, o termo "promotor" refere-se a uma região do DNA que está situada a montante do local de iniciação transcricional de um gene ao qual a RNA polimerase obriga a iniciação da transcrição de RNA. O promotor controla onde (ex., qual parte de uma planta) e/ou quando (ex., em que etapa ou condição no tempo de vida de um organismo) o gene é expresso.

[00136] Qualquer sequência de promotor adequada pode ser usada pela combinação de ácido nucléico da presente invenção. De preferência, o promotor é um promotor constitutivo, específico de tecido ou um promotor induzível por estresse abiótico.

[00137] Promoters constitutivos adequados incluem, por exemplo, o promotor CaMV 35S (SEQ ID N°:3063; Odell et al, Nature 313:810-812, 1985); promotor Arabidopsis At6669 (SEQ ID N°:3064; ver Publicação PCT N° WO04081173A2); maize Ubi 1 (Christensen et al, Plant Sol. Biol. 18:675689, 1992); rice actin (McElroy et al, Plant Cell 2:163-171, 1990); pEMU (Last et al, Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al, Physiol. Plant 100:456-462, 1997); GOS2 (de Pater et al, Plant J Nov;2(6):837-44, 1992); ubiquitin (Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992); Rice cyclophilin (Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25(5):837- 43, 1994); Maize H3 histone (Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Actin 2 (An et al, Plant J. 10(1); 107-121, 1996) e Synthetic Super MAS (Ni et al, The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Outros promotores constitutivos incluem aqueles na patente americana N°. 5.659.026, 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597: 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; e 5.608.142.

[00138] Promotores adequados específicos de tecido incluem, entre outros, promotores específicos de folhas [tais como os descritos, por exemplo, por Yamamoto et al, Plant J. 12:255-265, 1997; Kwon et al, Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al, Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor et al, Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al, Plant Mol. Biol. 23:1129-1138, 1993; e Matsuoka et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-9590, 1993], promotores preferidos por sementes [ex., de genes específicos de sementes (Simon, et al, Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al, J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), Brazil Nut albumin (Pearson' et al., 5 Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), legumin (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), Glutelin (arroz) (Takaiwa, et al, Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al, FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), Zein (Matzke et al Plant Mol Biol, 143).323-32 1990), napA (Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996), Wheat SPA (Albanietal, Plant Cell, 9: 171- 184, 1997), oleosina do girassol (Cummins, etal, Plant Mol. Biol. 19: 873-10 876, 1992)], promotores específicos do endosperma [ex., trigo LMW e HMW, glutenin-1 (Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), trigo a, b e g gliadinas (EMB03:1409-15, 1984), promotor ltrl de cevada, cevada Bl, C, D hordeína (Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750- 60, 1996), Barley DOF (Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), promotor sintético (Vicente-Carbajosa et al, Plant J. 13: 629-640, 1998), prolamina do arroz NRP33, arroz -globulina Glb-1 (Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885- 889, 1998), arroz alfa-globulina REB/OHP- 1 (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), arroz ADP-glicose PP (Trans Res 6:157-68, 1997), família de genes ESR do milho (Plant J 12:23546, 1997), sorgo gama- kafirina (PMB 32:1029-35, 1996)], promoters específicos de embriões [ex., arroz OSH1 (Sato et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma ef al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999), oleosina de arroz (Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998)], e promotores específicos de flores [ex., AtPRP4, chalene synthase (chsA) (Van der Meer, et al, Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al Mol. Gen Genet. 217:240-245; 1989), apetala- 3].

[00139] Promotores induzíveis por estresse abiótico incluem, entre outros, promotores induzíveis por sal tais como RD29A (Yamaguchi- Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993); promotores induzíveis por seca tais como o promotor do gene rabl7 do milho (Pla et. al, Plant Mol. Biol. 21:259-266, 1993), promotor do gene rab28 do milho (Busk et. al., Plant J. 11:1285-1295, 1997) e promotor do gene Ivr2 do milho (Pelleschi et. al, Plant Mol. Biol. 39:373-380, 1999); promotores induzíveis por calor tais como o promotor hsp80 de calor do tomate (patente americana N° 5.187.267).

[00140] A combinação de ácido nucléico de algumas configurações da invenção pode incluir ainda um marcador selecionável apropriado e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas configurações da invenção, a combinação de ácido nucléico utilizada é um vetor de transporte, que pode se propagar em E. coli (onde a combinação compreende um marcador selecionável apropriado e a origem da replicação) e ser compatível com a propagação nas células. A combinação de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, um plasmídeo, um bacmideo, um fagemídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.

[00141] A combinação de ácido nucléico de algumas configurações da invenção pode ser utilizada para transformar de maneira estável ou temporária células vegetais. Na transformação estável, o polinucleotídeo exógeno é integrado no genoma da planta e, como tal, representa um traço estável e herdado. Na transformação temporária, o polinucleotídeo exógeno é expresso pela célula transformada, mas não é integrado no genoma e, como tal, representa um traço temporário.

[00142] Há diversos métodos de se introduzir genes estranhos em plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol, Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al, Nature (1989) 338:274-276).

[00143] Os principais métodos de se causar uma integração estável do DNA exógeno no DNA genômico da planta incluem duas abordagens principais: (i) Transferência de gene mediada por agrobacteria: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee and Rogers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112.

[00144] (ii) Absorção direta de DNA: Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; including methods for direct uptake of DNA into protoplasts, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:10721074. DNA uptake induced by brief electric shock of plant cells: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793. DNA injection into plant cells or tissues by particle bombardment, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; by the use of micropipette systems: Neuhaus et al, Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus and Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformação de whisker de carboneto de silício ou fibras de fidro de culturas de células, embriões ou tecido de calo, patente americana N° 5.464.765 ou pela incubação direta do DNA com o pólen em germinação, DeWet et al. in Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. and Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; and Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:715-719.

[00145] O sistema Agrobacterium inclui a utilização de vetores plasmídeos que contêm segmentos de DNA definidos que se integram ao DNA genômico da planta. Métodos de inoculação do tecido da planta variam dependendo da espécie de planta e do sistema de distribuição Agrobacterium. Uma abordagem amplamente usada é o procedimento de disco de folha que pode ser realizado com qualquer explante de tecido que forneça uma boa fonte para a iniciação da diferenciação da planta inteira. Ver, ex., Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem complementar emprega o sistema de distribuição Agrobacterium juntamente com a infiltração a vácuo. O sistema Agrobacterium é especialmente viável na criação de plantas dicotiledôneas transgênicas.

[00146] Há diversos métodos de transferência direta de DNA para células vegetais. Na eletroporação, os protoplastos são brevemente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é mecanicamente injetado diretamente nas células utilizando pequenas micropipetas. No bombardeio de micropartículas, o DNA é adsorvido em microprojéteis tais como cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio e os microprojéteis são fisicamente acelerados em células ou tecidos de plantas.

[00147] Após a transformação estável é realizada a propagação da planta. O método mais comum de propagação da planta é pela semente. A regeneração por propagação da semente, no entanto, tem a deficiência de que devido à heterozigosidade há uma falta de uniformidade na safra, uma vez que as sementes são produzidas por plantas de acordo com as variações genéticas governadas pelas regras de Mendel. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma irá crescer com seus próprios traços específicos. Então é preferível que a planta transformada seja produzida de tal forma que a planta regenerada tenha traços e características idênticos aos da planta transgênica reprodutora. Portanto, é preferível que a planta transformada seja regenerada por micropropagação o que proporciona uma reprodução rápida e consistente das plantas transformadas.

[00148] A micropropagação é um processo de cultivar plantas de uma nova geração a partir de uma única peça de tecido que foi removida de uma planta reprodutora ou cultivada selecionada. Esse processo permite a reprodução em massa de plantas contendo o tecido preferido expressando a proteína da fusão. As plantas da nova geração que forem produzidas são geneticamente idênticas e têm todas as características da planta original. A micropropagação permite a produção em massa de material vegetal de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação das plantas cultivadas selecionadas na preservação das características da planta original transgênica ou transformada. As vantagens de clonar plantas são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e uniformidade das plantas produzidas.

[00149] A micropropagação é um procedimento de múltiplas etapas que requer a alteração do meio de cultura ou das condições de crescimento entre etapas. Dessa forma, o processo de micropropagação envolve quatro etapas básicas: etapa um, cultura inicial do tecido; etapa dois, multiplicação da cultura do tecido; etapa três, diferenciação e formação da planta; e etapa quatro, cultura em estufa e enrijecimento. Durante a etapa um, cultura inicial do tecido, a cultura do tecido é estabelecida e obtém a certificação de isenção de contaminantes. Durante a etapa dois, a cultura inicial do tecido é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecido seja produzido para satisfazer as metas de produção. Durante a etapa três, as amostras de tecido cultivadas na etapa dois são divididas e cultivadas em plântulas individuais. Na etapa quatro, as plântulas transformadas são transferidas para uma estufa para enrijecimento quando a tolerância das plantas à luz é gradativamente aumentada para que possam ser cultivadas no ambiente natural.

[00150] De acordo com algumas configurações da invenção, as plantas transgênicas são geradas pela transformação temporária de células de folhas, células meristemáticas ou da planta inteira.

[00151] A transformação temporária pode ser executada por qualquer um dos métodos de transferência direta de DNA descritos acima ou por infecção viral utilizando vírus de plantas modificados.

[00152] Vírus que se mostraram úteis para a transformação de hospedeiros de plantas incluem CaMV, Vírus do mosaico do tabaco (TMV), vírus do mosaico do bromo (BMV) e vírus do mosaico comum do feijoeiro (BV or BCMV). A transformação de plantas utilizando vírus de plantas é descrita na patente americana N° 4.855.237 (vírus do mosaico dourado do feijoeiro; BGV), EP-A 67,553 (TMV), Pedido japonês Publicado N° 6314693 (TMV), EPA 194,809 (BV), EPA 278,667 (BV); and Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988). Partículas de pseudovírus para uso na expressão de DNA estranho em muitos hospedeiros, incluindo plantas são descritas na WO 87/06261.

[00153] De acordo com algumas configurações da invenção, o vírus utilizado para transformações temporárias é avirulento e assim é incapaz de causar sintomas graves tais como taxa de crescimento reduzida, mosaico, manchas anelares, enrolamento das folhas, amarelamento, riscos, formação de inchação, formação de tumores e furos. Um vírus avirulento adequado pode ser um vírus avirulento de ocorrência natural ou um vírus atenuado artificialmente. A atenuação do vírus pode ser realizada utilizando métodos bem conhecidos na técnica incluindo, entre outros, aquecimento subletal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese direcionada tais como as descritas, por exemplo, por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Galon et al. (1992), Atreya et al. (1992) e Huet et al. (1994).

[00154] Variedades de vírus adequados podem ser obtidas a partir de fontes disponíveis tais como, por exemplo, a American Type Culture Collection (ATCC) ou por isolamento de plantas infectadas. O isolamento de vírus de tecidos de plantas infectadas pode ser realizado por técnicas bem conhecidas na técnica tais como as descritas, por exemplo, por Foster e Tatlor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Vírus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Human Press, 1998. Em resumo, tecidos de uma planta infectada dos quais se acredita que contenham uma alta concentração de um vírus adequado, de preferência folhas jovens e pétalas de flores, são colocados em uma solução tampão (ex., solução tampão de fosfato) para produzir uma seiva do vírus infectado que pode ser usaada em inoculações subsequentes.

[00155] A construção de vírus de RNA de plantas para a introdução e expressão de sequências de polinucleotídeos exógenos não virais em plantas é demonstrada pelas referências acima e também por Dawson, W. O. et al, Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; e pela patente americana N° 5.316.931.

[00156] Quando o vírus é um vírus de DNA, podem ser feitas modificações adequadas ao vírus em si. De maneira alternativa, o vírus pode primeiro ser clonado em um plasmídeo bacteriano para facilitar a construção do vetor viral desejado com o DNA estranho. O vírus pode então ser removido do plasmídeo. Se o vírus for um vírus de DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser anexada ao DNA viral, que é então replicado pela bacteria. A transcrição e a tradução desse DNA produzirão uma proteína de revestimento que irá encapsidar o DNA viral. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus é geralmente clonado como um cDNA e inserido em um plasmídeo. O plasmídeo é então utilizado para fazer todas as construções. O vírus RNA é então produzido transcrevendo a sequência viral do plasmídeo e a tradução dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que encapsidam RNA viral.

[00157] Em uma configuração, é provido um polinucleotídeo viral de uma planta no qual sequência de codificação de uma proteína de revestimento nativa foi apagada de um polinucleotídeo viral, uma sequência de codificação de uma proteína de revestimento nativa viral de uma planta não nativa e um promotor não nativo, de preferência, foi inserido o promotor subgenômico da sequência de codificação de uma proteína de revestimento não nativa, capaz de expressão no hospedeiro da planta, empacotamento do polinucleotídeo viral recombinante da planta, e de garantir uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotídeo viral recombinante da planta. De maneira alternativa, o gene da proteína de revestimento pode ser inativado pela inserção da sequência do polinucleotídeo não nativa dentro dele de tal forma que é produzida uma proteína. O polinucleotídeo viral recombinante da planta pode conter um ou mais promotores subgenômicos não nativos. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transcrever ou expressar sequências de polinucleotídeo ou genes adjacentes no hospedeiro da planta e incapaz de recombinação um com o outro e com promotores subgenômicos nativos. Sequências de polinucleotídeo não nativas (estranhas) podem ser inseridas adjacentes ao promotor subgenômico viral da planta nativa ou aos promotores subgenômicos virais de plantas nativas ou não nativas se for incluída mais de uma sequência de polinucleotídeo. As sequências de polinucleotídeo não nativas são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob o controle do promotor subgenômico para produzir os produtos desejados.

[00158] Em uma segunda configuração, é provido um polinucleotídeo viral recombinante da planta como na primeira configuração com exceção de que a sequência de codificação da proteína de revestimento nativa é disposta adjacente a um dos promotores subgenômicos da proteína de revestimento não nativa ao invés de uma sequência de codificação da proteína de revestimento não nativa.

[00159] Em uma terceira configuração, é provido um polinucleotídeo viral recombinante da planta no qual o gene da proteína de revestimento nativa é adjacente a seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos foram inseridos no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos não nativos inseridos são capazes de trascrever ou expressar genes adjacentes em um hospedeiro da planta e são incapazes de recombinação um com o outro e com promotores subgenômicos nativos. Sequências de polinucleotídeo não nativas podem ser inseridas adjacentes aos promotores subgenômicos virais de plantas não nativos de tal forma que as sequências são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle dos promotores subgenômicos para produzir o produto desejado.

[00160] Em uma quarta configuração, um polinucleotídeo viral recombinante da planta é provido como na terceira configuração com exceção de que a sequência de codificação da proteína de revestimento nativa é substituída por uma sequência de codificação da proteína de revestimento não nativa.

[00161] Os vetores virais são encapsidados pelas proteínas de revestimento codificadas pelo polinucleotídeo viral recombinante da planta para produzir um vírus de planta recombinante. O polinucleotídeo viral recombinante da planta ou o vírus de planta recombinante é usado para infectar plantas hospedeiras apropriadas. O polinucleotídeo viral recombinante da planta é capaz de replicação no hospedeiro, dispersão sistêmica no hospedeiro e transcrição ou expressão de gene(s) estranho(s) (polinucleotídeo exógeno) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.

[00162] Técnicas para inoculação de vírus em plantas podem ser encontradas em Foster and Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Vírus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Human Press, 1998; Maramorosh and Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, New York, 1985; e Kado and Agrawa, eds. "Principles and Techniques in Plant Virology", Van NostrandReinhold, New York.

[00163] Além do que foi mencionado anteriormente, o polinucleotídeo da presente invenção também pode ser introduzido em um genoma de cloroplasto com isso possibilitando a expressão do cloroplasto.

[00164] Uma técnica para introduzir sequências de polinucleotídeo exógeno no genoma dos cloroplastos é conhecida. Essa técnica envolve os seguintes procedimentos: primeiro, células vegetais são tratadas quimicamente de maneira a reduzir o número de cloroplastos por célula a aproximadamente um. Depois, o polinucleotídeo exógeno é introduzido através de bombardeio de partículas nas células com o objetivo de introduzir pelo menos uma molécula de polinucleotídeo exógeno nos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos foram selecionados de tal maneira que possam ser integrados no genoma do cloroplasto por meio da recombinação homóloga que é imediatamente realizada por enzimas inerentes ao cloroplasto. Para essa finalidade, o polinucleotídeo exógeno inclui, além de um gene de interesse, pelo menos uma extensão de polinucleotídeo que é derivada do genoma do cloroplasto. Além disso, o polinucleotídeo exógeno inclui um marcador selecionável, que atua por procedimentos de seleção sequencial para verificar se todas ou substancialmente todas as cópias dos genomas de cloroplasto que seguem tal seleção irão incluir o polinucleotídeo exógeno. Maiores detalhes com relação a essa técnica são encontrados na patente americana N°. 4.945.050; e 5.693.507 que são incorporadas por referência ao presente documento. Um polipeptídeo pode assim ser produzido pelo sistema de expressão de proteínas do cloroplasto e se tornar integrado à membrana interna do cloroplasto.

[00165] Uma vez que processos que aumentam o teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou tolerância ao estresse abiótico de uma planta podem envolver múltiplos gene atuando de maneira cumulativa ou em sinergia (ver, por exemplo, em Quesda et al, Plant Physiol. 130:951-063, 2002), a presente invenção também contempla a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira para com isso obter um efeito superior no teor de óleo, produção, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou tolerância ao estresse abiótico.

[00166] A expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser realizada cointroduzindo múltiplas combinações de ácido nucléico, cada uma incluindo um polinucleotídeo exógeno diferente, em uma única célula vegetal. A célula transformada pode então ser regenerada e se tornar uma planta madura utilizando os métodos descritos anteriormente no presente documento.

[00167] De maneira alternativa, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser realizada cointroduzindo em uma única célula vegetal uma única combinação de ácido nucléico incluindo uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos diferentes. Tal combinação pode ser concebida com uma única sequência de promotor que pode transcrever um RNA mensageiro policistrônico incluindo todas as sequências de polinucleotídeo exógeno diferentes. Para permitir a cotradução dos diferentes polipeptídeos codificados pelo RNA mensageiro policistrônico, as sequências de polinucleotídeo podem ser interligadas através de uma sequência de local de entrada interno do ribossomo (IRES) que facilita a tradução das sequências de polinucleotídeo posicionadas a jusante da sequência de IRES. Nesse caso, uma molécula de RNA policistrônica transcrita que codifica os diferentes polipeptídeos descritos acima será traduzida da extremidade 5' do cap e as duas sequências internas IRES da molécula de RNA policistrônica para com isso produzir na célula todos os polipeptídeos diferentes. De maneira alternativa, a combinação pode incluir várias sequências de promotor cada uma a uma sequência de polinucleotídeo exógeno diferente.

[00168] A célula vegetal transformada com a combinação incluindo uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos pode ser regenerada tornando- se uma planta madura, utilizando os métodos descritos anteriormente no presente documento.

[00169] De maneira alternativa, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser realizada introduzindo diferentes combinações de ácido nucléico, incluindo diferentes polinucleotídeos exógenos, em uma pluralidade de plantas. As plantas transformadas regeneradas podem então ser cruzadas e a progênie resultante selecionada para alcançar uma tolerância superior ao estresse abiótico, eficiência de uso de água, eficiência de uso de fertilizantes, crescimento, biomassa, produção e/ou traços de vigor, utilizando técnicas convencionais de cultura de plantas.

[00170] De acordo com algumas configurações da invenção, o método ainda compreende o cultivo da planta expressando o polinucleotídeo exógeno sob o estresse abiótico.

[00171] Exemplos não limitadores de condições de estresse abiótico incluem salinidade, seca, privação de água, excesso de água (ex. inundação, alagamento), estiolamento, baixa temperatura, alta temperatura, toxicidade de metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, poluição atmosférica e irradiação UV.

[00172] Dessa forma, a invenção abrange plantas que expressam exogenamente o(s) polinucleotídeo(s), as combinações de ácido nucléico e/ou polipeptídeo(s) da invenção. Uma vez expresso dentro da célula da planta ou da planta inteira, o nível do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo exógeno pode ser determinado por métodos bastante conhecidos na técnica tais como, ensaios de atividade, Western blots utilizando anticorpos capazes de ligar especificamente o polipeptídeo, Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzima (ELISA), ensaios radioimunológicos (RIA), imunohistoquímica, imunocitoquímica, imunofluorescência e similares.

[00173] Métodos para determinar, na planta, o nível do RNA transcrito a partir do polinucleotídeo exógeno são bastante conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, análise de Northern blot, análise de reação em cadeia da polimerase via transcrição reversa (RT-PCR) (incluindo RT-PCR quantitativa, semiquantitativa ou em tempo real) e hibridização de RNA in situ.

[00174] Além disso, o homólogo endógeno do polinucleotídeo exógeno ou polipeptídeo da invenção, ou um fragmento do homólogo endógeno (ex. íntrons ou regiões não traduzidas) na planta podem ser usadas como um marcador para uma seleção auxiliada por marcador (MAS), na qual é usado um marcador para seleção indireta de um determinante ou determinantes genéticos de um traço de interesse (ex., biomassa, taxa de crescimento, teor de óleo, produção, tolerância ao estresse abiótico). Esses genes (sequência de DNA ou RNA) podem conter locais polimórficos ou marcadores genéticos no genoma tais como polimorfismo do tamanho do fragmento de restrição (RFLP), microsatélites e polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), impressão digital do DNA (DFP), polimorfismo do tamanho de fragmentos amplificados (AFLP), polimorfismo do nível de expressão, polimorfismo do polipeptídeo codificado ou podem ser ligados a estes e a qualquer outro polimorfismo na sequência de DNA ou RNA.

[00175] Exemplos de seleções auxiliadas por marcadores incluem, entre outros, a seleção de um traço morfológico (ex., um gene que afeta a forma, coloração, esterilidade masculina ou resistência tais como a presença ou ausência de estrepes, coloração do revestimento das folhas, altura, cor dos grãos, aroma do arroz); a seleção de um traço bioquímico (ex., um gene que codifica uma proteína que pode ser extraída e observada; por exemplo, isozimas e proteínas de armazenamento); a seleção de um traço biológico (ex., raças patogênicas ou biótipos de insetos com base em patógeno hospedeiro ou relação entre parasita e hospedeiro podem ser usados como marcador uma vez que a constituição genética de um organismo pode afetar sua susceptibilidade a patógenos ou parasitas).

[00176] Os polinucleotídeos e polipeptídeos descritos anteriormente no presente documento podem ser usados em uma ampla variedade de plantas econômicas, de maneira segura e de boa relação custo-benefício.

[00177] Linhas de plantas que expressam exogenamente o polinucleotídeo ou o polipeptídeo da invenção são filtradas para identificar aquelas que apresentam o maior aumento do traço desejado da planta.

[00178] Abaixo segue uma descrição não limitadora de ensaios que podem ser usados para determinar o efeito do transgene (o polinucleotídeo exógeno de algumas configurações da invenção) ou que é um polipeptídeo no traço de interesse em uma planta.

[00179] Os parâmetros principais de eficiência utilizados para definir o metabolismo de Nitrogênio (N) da planta incluem eficiência de absorção do nitrogênio, eficiência de utilização do nitrogênio e eficiência de uso do nitrogênio.

[00180] A eficiência de absorção do nitrogênio [a quantia de N em biomassa acima do solo (gramas de nitrogênio) / N aplicada (gramas/hectare)] é a quantia total de nitrogênio incorporada pela planta e é uma função da "absorção" (a capacidade de transporte da planta), a eficiência metabólica do processo de assimilação e a taxa de desenvolvimento do tamanho da planta, uma vez que a massa do caule e das folhas criada durante o crescimento são os reais órgãos de armazenamento de nitrogênio. A fração do nitrogênio assimilado encontrada em um broto que é por fim transferida ao grão (produção) é controlada enzimaticamente, e, dessa forma, pode ser afetada por manipulação transgênica. Esse parâmetro é, na prática, igual à eficiência de uso do nitrogênio (EUN). Um melhor particionamento N entre grão e broto muito provavelmente irá melhorar a produção e o teor de proteína do grão.

[00181] De forma similar, os mesmos cálculos de eficiências de uso e utilização podem ser feitos para outros macronutrientes tais como Fósforo (P) e Potássio (K), que têm uma correlação direta com a produção e a tolerância geral da planta.

[00182] Eficiência de uso de fertilizantes - Para verificar se as plantas transgênicas são mais responsivas aos fertilizantes, as plantas são cultivadas em placas de ágar ou potes com uma quantidade limitada de fertilizante, conforme descrito, por exemplo, nos Exemplos 5-7 da seção de Exemplo a seguir e em Yanagisawa et al (Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101:7833-8). As plantas são analisadas quanto ao seu tamanho total, tempo de florescência, produção, teor de proteína do broto e/ou grão. Os parâmetros verificados são o tamanho total da planta madura, sua umidade e peso seco, o peso das sementes produzidas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status de nitrogênio da planta e o grau de verdor da folha são altamente co-relacionados), aminoácido e o teor total de proteína das sementes ou de outras partes da planta tais como as folhas ou brotos, teor de óleo, etc.. De forma similar, ao invés de fornecer nitrogênio em quantidades limite, o fosfato ou o potássio podem ser adicionados em concentrações cada vez maiores. Novamente, os mesmos parâmetros medidos são os mesmos listados acima. Desta forma, a eficiência de uso de nitrogênio (EUN), a eficiência de uso de fosfato (EUF) e a eficiência de uso de potássio (EUP) são avaliadas, verificando a capacidade das plantas transgênicas de florescer sob as condições de restrição dos nutrientes.

[00183] Eficiência de uso do nitrogênio - Para verificar se as plantas transgênicas Arabidopsis são mais responsivas ao nitrogênio, as plantas são cultivadas em 0,75-1,5 mM (condições de deficiência de nitrogênio) ou 6-15 mM (condições ideais de nitrogênio). É permitido que as plantas cresçam por mais 20 a 40 dias ou até da produção de sementes. As plantas são então analisadas por seu tamanho total, tempo de florescência, produção, teor de proteína do broto e/ou grão/ produção de semente. Os parâmetros verificados podem ser o tamanho total da planta, umidade e peso seco, o peso das sementes produzidas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status de nitrogênio da planta e o grau de verdor da folha são altamente co-relacionados), aminoácido e o teor total de proteína das sementes ou de outras partes da planta tais como as folhas ou brotos e o teor de óleo. Plantas transformadas não apresentam efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou apresentam níveis maiores de parâmetros medidos do que de plantas silvestres, são identificadas como plantas de eficiência de uso do nitrogênio.

[00184] Determinação de nitrogênio - O procedimento para determinação de concentração de N (nitrogênio) nas partes estruturais das plantas envolvem o método de digestão de persulfato de potássio para converter N orgânico para NO3 (Purcell and King 1996 Argon. J. 10 88:111113, a redução mediada de Cd” modificada de NO3 para NO2 (Vodovotz 1996 Biotechniques 20:390-394) e a medição de nitrito através do ensaio de Griess (Vodovotz 1996, supra). Os valores e absorção são medidos em 550nm em relação a uma curva padrão de NaNO2. O procedimento é descrito em detalhes em Samonte et.al. 2006 Agron. J. 98:168-176.

[00185] Testes de germinação - Os testes de germinação comparam a porcentagem de sementes de plantas transgênicas que poderiam completar o processo de germinação à porcentagem de sementes do controle de plantas que são tratadas da mesma forma. Condições normais são consideradas, por exemplo, incubação a 22 °C sob ciclos diários de 22 horas com luz e 2 horas no escuro. A avaliação de germinação e vigor da muda é conduzida entre 4 e 14 dias após o plantio. A média basal é meio MS de 50% (Murashige and Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473-497).

[00186] A germinação é verificada também em condições não favoráveis tais como frio (incubação em temperaturas menores que 10 °C ao invés de 22 °C) ou usando soluções de inibição de sementes que contem altas concentrações de um osmolito tal como sorbitol (em concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM, e até 1000 mM) ou aplicando concentrações crescentes de sal (de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM de NaCl).

[00187] O efeito da transgene no vigor, taxa de crescimento, biomassa, produção e/ou teor de óleo pode ser determinada usando métodos conhecidos.

[00188] Vigor da planta - O vigor da planta pode ser calculado pelo aumento nos parâmetros de crescimentos tais como a área da folha, comprimento da fibra, diâmetro de roseta, peso fresco da planta e similares por tempo.

[00189] Taxa de crescimento - A taxa de crescimento pode ser medida usando a análise digital de cultivo de plantas. Por exemplo, imagens de cultivo de plantas em estufas com base em diagramas podem ser capturadas a cada 3 dias e a área de roseta pode ser calculada por análise digital. O crescimento da área de roseta é calculado usando a diferença da área de roseta entre dias de amostragem dividido pela diferença em dias entre amostras.

[00190] A avaliação da taxa de crescimento pode ser feita medindo a biomassa da planta produzida, a área da roseta, o tamanho da folha ou o comprimento da raiz por tempo (pode ser medido em cm2 por dia de área de folha).

[00191] A área de crescimento relativo pode ser calculada usando a Fórmula I. Fórmula I: Taxa de área de crescimento relativo = (Δ Área / Δt) * (1/ Área t0) Δt é o dia da imagem atual analisada subtraído do dia inicial (t- tO). Dessa forma, taxa de área de crescimento relativo é em unidades de 1/dia e a taxa de crescimento de comprimento é em unidades de 1/dia.

[00192] De maneira alternativa, a taxa de crescimento relativo da área pode ser calculada como o coeficiente de regressão no decorrer do curso de tempo.

[00193] Produção de sementes - A avaliação da produção de sementes por planta pode ser feita medindo a quantia (peso ou tamanho) ou quantidade (i.e., número) de sementes secas produzidas e colhidas de 8 a 16 plantas e divido pelo número de plantas.

[00194] Por exemplo, as sementes totais de 8 a 16 plantas podem ser colhidas, pesadas usando ex., um balanço analítico e o peso total pode ser dividido pelo número de plantas. A produção de sementes por área de cultivo pode ser calculada da mesma forma ao levar em conta uma determinada área de cultivo para uma única planta. O aumento da produção de semente por área de cultivo seria obtido pelo aumento da produção de semente por planta, e/ou pelo aumento do número de plantas capazes de produzir em uma determinada área.

[00195] Além disso, a produção de sementes pode ser determinada via peso of 1000 sementes. O peso de 1000 sementes pode ser determinado conforme segue: as sementes são espalhadas em uma bandeja de vidro e é uma foto tirada. Cada amostra é pesada e então usando a análise digital, é calculado o número de sementes.

[00196] O peso de 1000 sementes pode ser calculado usando a fórmula II: Fórmula II: Peso de 1000 Sementes = número de sementes em amostra/ peso da amostra X 1000

[00197] O Índice de Colheita pode ser calculado usando a Fórmula III Fórmula III: Índice de colheita = Produção média de sementes por planta/ Peso seco médio

[00198] Concentração de proteína dos grãos - O conteúdo de proteína dos grãos (gramas de proteína dos grãos m-2) é estimado como o produto da massa de grão N (nitrogênio) [gramas de Nitrogênio dos grãos m-2] multiplicado pela taxa de conversão de proteína/N de k-5,13 (Mosse 1990, supra). A concentração de proteína dos grãos é estimada como a taxa de teor de proteína dos grãos por massa de unidade do grão (gramas de proteína dos grãos kg-1 de grão).

[00199] Comprimento das fibras - O comprimento das fibras pode ser medido usando um fibrógrafo. O sistema fibrógrafo foi usado para computar o comprimento em termos de comprimento “Médio da Metade Superior”. A média da metade superior (UHM) é o comprimento médio da metade mais longa da distribuição da fibra. O comprimento das medidas do fibrógrafo em comprimentos de vão de um determinado ponto de porcentagem (http://www.cottonine.com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length).

[00200] Teor de óleo - O teor de óleo de uma planta pode ser determinada pela extração do óleo da semente ou da porção vegetativa da planta. Em resumo, os lipídios (óleo) pode ser removido da planta (ex., semente) triturando o tecido da planta na presença de solventes específicos (ex., hexano ou éter de petróleo) e extraindo o óleo em um extrator contínuo. A análise do teor de óleo indireto pode ser realizado usando vários métodos de conhecimento tais como Espectroscópio de Ressonância Magnética Nuclear (NMR), que mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Ver por exemplo, Conway TF. and Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin / Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Print) 1558-9331 (Online)]; o Espectroscópio de Quase Infravermelho (NI), que usa a absorção de energia quase infravermelha (1100-2500 nm) pela amostra; e o método descrito em WO/2001/023884, que é baseado em extrair óleo um solvente, evaporar o solvente em um fluxo de gás que forma partículas de óleo, e direcionam luz no fluxo de gás e nas partículas de óleo que formam uma luz refletida detectável.

[00201] O efeito da transgene ou seu polipeptídeo codificado em tolerância ao estresse abiótico pode ser determinado usando métodos conhecidos.

[00202] Tolerância ao estresse abiótico - Plantas transformadas (i.e., expressando a transgenese) e não transformadas (tipo silvestre) são expostas a condições de estresse abiótico, tais como privação de água, temperatura abaixo do ideal, (temperatura baixa, alta temperatura), deficiência de nutrientes, excesso de nutrientes, condição se estresse salino, estresse osmótico, toxicidade de metais pesados, anaerobiose, poluição atmosférica e irradiação UV.

[00203] Ensaio de tolerância de salinidade - Espera-se que as plantas transgênicas com tolerância a altas concentrações de sal demonstrem melhor germinação, vigor da muda ou crescimento em alta salinidade. O estresse salino pode ser efetuado de várias formas tais como, por exemplo, irrigando as plantas com uma solução hiperosmótica, cultivando as plantas de forma hidropônica em uma solução de crescimento hiperosmótico (ex., solução de Hoagland), ou cultivando as plantas em um meio de crescimento hiperosmótico [ex., 50 % do meio Murashige-Skoog (meio MS)]. Desde que plantas diferentes variam consideravelmente em sua tolerância à salinidade, a concentração de sal na irrigação de água, solução de crescimento, ou meio de crescimento podem ser ajustadas de acordo com as características específicas ou cultivo de planta específico ou variedade, de modo a infligir um efeito suave ou moderado na fisiologia e/ou morfologia das plantas (para diretrizes referentes a concentração apropriada ver, Bernstein and Kafkafi, Root Crescimento Under Salinidade Stress In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A and Kafkafi U. (editores) Marcel Dekker Inc., New York, 2002, e suas referências).

[00204] Por exemplo, o teste de tolerância de salinidade pode ser executado irrigando as plantas em estágios de desenvolvimento com aumento de concentrações de cloreto de sódio (por exemplo, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM de NaCl) aplicado no fundo e por cima para garantir a dispersão uniforme do sal. Seguindo a exposição à condição de estresse as plantas são monitoradas frequentemente até que os efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais apareçam em plantas tipo silvestre. Dessa forma, a aparência fenotipica externa, o grau de secagem e o sucesso total para alcançar a maturidade e a progênie de produção são comparados entre plantas transgênicas e de controle. Os parâmetros quantitativos de tolerância medidos incluem, entre outros, o peso molhado e seco médios, o peso das sementes produzidas, o tamanho médio das sementes e o número de sementes produzidas por planta. As plantas transformadas não apresentam efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou apresentam maior biomassa que as plantas tipo silvestre, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.

[00205] Teste de tolerância osmótica - Os ensaios de estresse osmótico (incluindo ensaios de cloreto de sódio e manitol) são conduzidos para determinar se um fenótipo de estresse osmótico foi específico de cloreto de sódio ou se este foi um fenótipo relacionado ao estresse osmótico geral. Plantas que são tolerantes ao estresse osmótico podem ter mais tolerância ao seco e/ou congelamento. Para experimentos de germinação por estresse de salino e osmótico, o meio suplementado, por exemplo, com 50 mM, 100 mM, 200 mM de NaCl ou 100 mM, 200 mM de NaCl, 400 mM de manitol, 500 mM de sorbitol ou 15 g (gramas) de PEG [Polietileno glicol 8000].

[00206] Ensaios de tolerância seca/ Ensaio de osmoticum - A tolerância ao seco é apresentada para identificar os genes que concedem melhor sobrevivência da planta após privação de água aguda. Para analisar se as plantas transgênicas são mais tolerantes à seca, um estresse osmótico produzido pelo sorbitol osmólito não iônico no meio pode ser realizado. As plantas transgênicas e de controle são germinadas e cultivadas em placas de ágar de plantas por 4 dias, depois de serem transferidas para placas contendo 500 mM de sorbitol. O tratamento causa retardamento no crescimento, então ambas as plantas trangênicas e de controle são comparadas, pelo peso da planta (molhada e seca), produção e pela taxa de crescimentos medidos como tempo para florescência.

[00207] De modo oposto, as classificações de seca por solo são realizadas com plantas que expressam excessivamente os detalhes de polinucleotídeos acima. As sementes de controle das plantas Arabidopsis, ou outras plantas transgênicas que expressam excessivamente o polipeptídeo da invenção são germinadas e transferidas para potes. O estresse por seca é obtido após a irrigação ser cessada, acompanhada por colocar os potes em papel absorvente para aumentar a taxa de secagem do solo. As plantas transgênicas e de controlesão comparadas umas as outras quando a maioria das plantas de controle desenvolvem secagem severa. As plantas são regadas novamente após obter uma fração significante das plantas de controle mostrando uma secagem severa. As plantas são classificadas comparando controles para cada um dos dois critérios: tolerância às condições de seca e recuperação (sobrevivência) após serem regadas novamente.

[00208] Tolerância de estresse por frio - Para analisar o estresse por frio, as plantas maduras (25 dias de vida) são transferidas para câmaras a 4 °C por 1 ou 2 semanas, com luz constitutiva. Mais tarde as plantas são movidas de volta para a estufa. Duas semanas mais tarde os danos do período de resfriamento, resultando em retardamento do crescimento e outros fenótipos, são comparados entre ambas as plantas transgênicas e de controle, pelo peso da planta (molhada e seca) e comparando a taxa de crescimentos medidos como tempo para florescência, tamanho da planta, produção e similares.

[00209] Tolerância de estresse por calor - A tolerância de estresse por calor alcançada pela exposição das plantas a temperaturas acima de 34 °C por um determinado período. A tolerância da planta é examinada após a transferência das plantas de volta aos 22 °C para recuperação e avaliação após 5 dias relativo aos controles internos (plantas não transgênicas) ou plantas não expostas nem ao estresse por frio nem por calor.

[00210] Eficiência do uso de água - pode ser determinada como a biomassa produzida por transpiração de unidade. Para analisar EUA, o teor de água relativo da folha pode ser medido nas plantas transgênicas e de controle. O peso fresco (PF) é registrado imediatamente; então as folhas são enxarcadas por 8 horas em água destilada em temperatura ambiente no escuro, e o peso túrgido (PT) é registrado. O peso seco total (PS) é registrado após a secagem das folhas a 60 °C para um peso constante. O teor de água relativo (TAR) é calculado de acordo com a Fórmula IV a seguir: Fórmula IV TAR = [(PF - PS) / (PT - PS)] x 100

[00211] Dessa forma, a invenção é de alto valor para agricultura para promover a produção das safras desejadas pelo comércio (ex., biomassa de órgão vegetativo tais como madeira de álamo, ou órgãos reprodutivos tais como número de sementes ou biomassa de sementes) sob condições normais ou de limitação de crescimento (ex., condições de deficiência de nitrogênio, estresse abiótico).

[00212] Quaisquer das plantas transgênicas descritas acima ou partes destas podem ser processadas para produzirem preparação de alimento, proteína ou óleo, tais como para animais ruminantes.

[00213] As plantas transgênicas descritas acima, que exibem um teor de óleo aumentado podem ser usadas para produzir óleo vegetal (pela extração de óleo da planta).

[00214] O óleo vegetal (incluindo o óleo de semente e/ou óleo da parte vegetativa) produzido, de acordo com o método da invenção, pode ser combinado com uma variedade de outros ingredientes. Os ingredientes específicos incluídos em uma produção são determinados de acordo com o uso pretendido. Os produtos exemplares incluem alimentação animal, matéria prima para modificações químicas, plástico biodegradável, produto de comida misturada, óleo comestível, biocombustível, óleo de cozinha, lubrificante, biodiesel, lanches, cosméticos e matéria prima de processo de fermentação. Produtos exemplares a serem incorporados ao óleo vegetal incluem alimentos de animais, produtos de alimentação humana tais como lanches extrusados, pães, como um agente obrigatório do alimento, alimentação de aquicultura, misturas fermentáveis, suplementos alimentares, bebidas energéticas, barras nutricionais, suplementos multi-vitamínicos, bebidas dietéticas e cereais. De acordo com algumas configurações da invenção, o óleo compreende óleo de semente oil e/ou óleo de parte vegetativa.

[00215] De acordo com algumas configurações da invenção, a célula da planta forma uma parte de uma planta.

[00216] Conforme utilizado no presente documento o termo "aproximadamente" refere-se ± 10 %.

[00217] O termos "compreende", "compreendendo", "incluir", "incluindo", "contendo" e suas conjugações significam "incluindo entre outros".

[00218] O termo "consistindo de meios" incluindo e limitado a".

[00219] O termo "consistindo essencialmente de” meios que a composição, método ou estrutura podem incluir ingredientes adicionais, etapas e/ou partes, mas somente se os ingredientes adicionais, etapas e/ou partes não alterarem de forma material as características básicas e originais da composição reivindicada, método ou estrutura.

[00220] Conforme utilizada no presente documento a forma única "um/uma" e "o/a" incluem referencias de plural a menos que o contexto ditar claramente de outra forma. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas.

[00221] Durante este pedido, várias configurações desta invenção podem apresentar em um formato de faixa. Isso pode ser entendido que a descrição em formato de faixa é meramente por conveniência e brevidade e não pode ser construída como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Conseqüentemente, a descrição da faixa não pode ser considerada por ter revelado especificamente todas as subfaixas possíveis assim como valores numéricos individuais dentro desta faixa. Por exemplo, a descrição da faixa tal como de 1 a 6 deve ser considerada por ter revelado especificamente todas as subfaixas tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., assim como números individuais dentro da faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isto se aplica no que diz respeito a largura da faixa.

[00222] Sempre que uma faixa numérica é indicada no presente documento, cujo propósito é incluir qualquer número citado (fracional ou inteiro) dentro da faixa indicada. As frases “variando/varia entre” um primeiro número indicado e um segundo número indicado e “variando/varia de” um primeiro número indicado “até” um segundo número indicado são usados no presente documento alternadamente e cujo propósito é incluir o primeiro e o segundo números indicados e todos os números fracionais ou inteiros entre eles.

[00223] Conforme usado no presente documento o termo “método” refere-se a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para cumprir uma determinada tarefa incluindo, entre outros, essas maneiras, meios, técnicas e procedimentos sejam de conhecimento de praticantes das técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas ou imediatamente desenvolvidos a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos.

[00224] É reconhecido que determinadas características da invenção, as quais são, para fins de esclarecimento, descritas no contexto de configurações separadas, também podem ser providas em conjunto em uma única configuração. Por outro lado, diversas características da invenção, que são, por brevidade, descritas no contexto de uma única configuração, também podem ser providas separadamente ou em qualquer subconbinação adequada ou como adequada em qualquer outra configuração da invenção descrita. Determinadas caraterísticas descritas no contexto de várias configurações não são consideradas características essenciais dessas configurações, a menos que a configuração seja inoperante sem esses elementos.

[00225] Várias configurações e aspectos da presente invenção conforme descritas acima e conforme reivindicado na seção de reivindicações abaixo encontram suporte experimental nos exemplos a seguir.

EXEMPLOS

[00226] Agora é feita referência aos exemplos a seguir, que juntos com as descrições acima ilustram algumas configurações da invenção de maneira não limitadora.

[00227] Geralmente, a nomenclatura utilizada no presente documento e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Tais técnicas são detalhadamente explicadas na documentação. Veja, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 25 Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Frio Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias conforme estabelecidas nas patentes americanas N° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes IIII Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); imunoensaios disponíveis são amplamente descritos na patente e na documentação científica, veja, por exemplo, as patentes americanas N° 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al, "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos os quais são incorporados por referência como se plenamente estabelecidos no presente documento. Outras referências gerais são fornecidas ao longo do presente documento. Acredita-se que os procedimentos nelas contidos sejam bastante conhecidos na técnica e sejam fornecidos para maior comodidade do leitor. Todas as informações nelas contidas são incorporadas por referência ao presente documento.

EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE GENES QUE AUMENTAM A EFICIÊNCIA DE USO DO NITROGÊNIO, A EFICIÊNCIA DE USO DE FERTILIZANTES, PRODUÇÃO, TEOR DE ÓLEO, BIOMASSA E/OU TOLERÂNCIA AO ESTRESSE ABIÓTICO

[00228] Genes que podem aumentar a eficiência de uso do nitrogênio (EUN), a eficiência de uso de fertilizantes (EUF), produção, teor de óleo, biomassa e/ou tolerância ao estresse abiótico (ABST) foram identificados utilizando várias ferramentas de bioinformática e mineração de dados.

[00229] Todos os conjuntos de dados de sequências de nucleotídeo aqui utilizados foram originados de bancos de dados disponíveis para o público em geral. Dados de sequências de 76 diferentes espécies de plantas foram introduzidos em um único e amplo banco de dados. Outras informações acerca de expressão de genes, observações sobre proteínas, enzimas e vias também foram incorporados. Os principais bancos de dados utilizados incluem: • Genomas o Genoma de Arabidopsis [TAIR genome version 6 (http://www.arabidopsis.org/)] o Genoma do Arroz [IRGSP build 4.0 (http://rgp.dna.affix.go.jp/IRGSP/)]. o Álamo [Populus trichocarpa release 1.1 from JGI (assembly vl.0) (http://www.genome.jgi-psf.org/)] o Brachypodium [JGI 4x assembly, http://www.brachpodium.org)] o Soja [DOE-JGI SCP, version Glyma0 (http://www.phytozome.net/)] o Uva [French-Italian Public Consortium for Grapevine Genome Characterization grapevine genome (http://www.genoscope.ens.fr/)] o Mamona [TIGR/J Craig Venter Institute 4x assembly [(http://msc.jevi.org/rcommunis] o Sorgo [DOE-JGI SCP, version Sbil [http://www.phytozome.net/)], o Genoma do milho parcialmente montado [http://maizesequence.org/] • As sequências expressadas de EST e mRNA foram extraídas dos seguintes bancos de dados: o GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/). o RefSeq (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/). o TAIR (http://www.arabidopsis.org/). • Bancos de dados de vias e proteínas o Uniprot (http://www.expasy.uniprot.org/). o AraCyc (http://www.arabidopsis.org/biocyc/index.jsp). o ENZYME (http://expasy.org/enzyme/). • Conjuntos de dados de microarranjo foram baixados de: o GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) o TAIR (http://www.arabidopsis.org/). o Dados exclusivos de microarranjos de fibra de algodão (Publicação PCT N° WO2008/075364) o Dados exclusivos de microarranjos sobre ecotipos de Arabidopsis (Publicação PCT N° WO2008/122980). • Informações de OTL (quantitative trailt Locus) o Gramene (http://www.gramene.org/qtl/).

[00230] A montagem do banco de dados foi realizada para permitir a construção de um banco de dados amplo, rico, com observações confiáveis e fácil de analisar composto de sequências genômicas de DNA mRNA e ESTs disponíveis para o público em geral, dados de diversas safras bem como expressão de genes, observações de proteínas e QTLs de dados de vias e outras informações relevantes.

[00231] A montagem do banco de dados é composta de uma caixa de ferramentas de refinamento, estruturação e observação de genes e ferramentas de análise que permitem combinar um banco de dados adaptado para cada projeto de descoberta de genes. As ferramentas de refinamento e estruturação de genes permitem detectar de maneira confiável variantes de recomposição e transcrições antissentido, gerando a compreensão de diversos resultados fenotípicos potenciais de um único gene. As capacidades da plataforma "LEADS" da Compugen LTD para analisar o genoma humano foram confirmadas e aceitas pela comunidade científica [ver por ex., "Widespread Antisense Transcription", Yelin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21, 37985; "Splicing of Alu Sequences", Lev-Maor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1288-91; "Computational analysis of alternative splicing using EST tissue information", Xie H et al. Genomics 2002], e foi comprovado que têm maior eficiência na genômica de plantas também.

[00232] Agrupamento (Clustering) EST e montagem de genes - Para agrupamento e montagem de genes de Arabidopsis, arroz, uva, sorgo, brachypodium e soja os presentes inventores utilizaram a versão "genomic LEADS". Essa ferramenta permite o mais preciso agrupamento de sequências de ESTs e mPvNA no genoma e prevê a estrutura do gene e eventos de recomposição alternativos e transcrição antissentido.

[00233] Observação de genes - Genes e proteínas previstos foram observados conforme segue: Foi realizada busca de sequências por blast [http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/ Blast.cgi] em relação a todas as plantas UniProt [http://www.uniprot.org/]. Quadros de leitura aberta de cada suposta transcrição foram analisados e o mais longo ORF com o maior número de homólogos foi selecionado como a proteína prevista da transcrição. As proteínas previstas foram analisadas pelo InterPro [http://www.ebi.ac.uk/interpro/].

[00234] A comparação por Blast de proteínas dos bancos de dados AraCyc e ENZYME foi usada para mapear as transcrições previstas para vias do AraCyc.

[00235] Proteínas previstas de diferentes espécies foram comparadas utilizando o algoritmo blast [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi] para validar a precisão da sequência da proteína prevista e para a detecção eficiente de orthologs.

[00236] Definição do perfil de expressão dos genes - Poucas fontes de dados foram exploradas em busca de definição do perfil de expressão dos genes, a saber, dados de microarranjo e perfil de expressão digital (conforme mencionado acima). De acordo com o perfil de expressão do gene, foi realizada uma análise de correlação para identificar genes que são corregulados em etapas de desenvolvimento e condições ambientais diferentes.

[00237] Conjuntos de dados de microarranjos disponíveis para o público em geral nos sites NCBI GEO foram baixados, renormalizados e integrados ao banco de dados. O perfil de expressão foi um dos mais importantes dados de recursos para identificar genes importantes para a EUN, ABST, produção, aumento de biomassa e/ou EUF. Além do mais, quando foi descoberto que genes homólogos de diferentes safras estavam associados ao aumento de EUN, ABST, EUF, biomassa, produção or teor de óleo, os genes foram marcados como "altamente previsíveis" para aperfeiçoar o traço.

[00238] Um resumo do perfil de expressão digital foi compilado para cada cluster de acordo com todas as palavras-chave incluídas nos registros de sequências que compreendem o cluster. A expressão digital, também conhecida como Northern Blot eletrônico, é uma ferramenta que exibe o perfil de expressão virtual baseado nas sequências de EST que formam o cluster do gene. A ferramenta pode fornecer o perfil de expressão de um cluster em termos de anatomia da planta (ex. tecidos/órgãos nos quais o gene é expresso), etapa de desenvolvimento (as etapas de desenvolvimento nas quais um gene pode ser encontrado) e perfil de tratamento (provê as condições fisiológicas nas quais um gene é expresso tais como seca, frio, infecção patogênica, etc). Dada uma distribuição aleatória de ESTs nos diferentes clusters, a expressão digital fornece um valor de probabilidade que descreve a probabilidade de um cluster ter um total de N ESTs para conter X ESTs de uma determinada coleção de bibliotecas. Para os cálculos de probabilidade foram levados em consideração os parâmetros a seguir: a) o número de ESTs no cluster; b) o número de ESTs das bibliotecas implicadas e relacionadas; e c) o número total de ESTs disponíveis, que representam as espécies. Com isso clusters com valores de baixa probabilidade são altamente enriquecidos com ESTs do grupo de bibliotecas de interesse que indicam uma expressão especializada.

[00239] Os resultados dos dados de expressão digital e de microarranjo dos genes são fornecidos nas Tabelas 1-19 abaixo no presente documento.

[00240] São resumidos abaixo os critérios fundamentais utilizados para selecionar os genes cuja expressão em uma planta pode ser usada para aumentar a EUN, a EUF, biomassa, produção, teor de óleo e ABST. A prega de excesso de expressão ("Prega") é calculada como a razão entre o número de ESTs encontradas em um gene ou um grupo ortólogo para uma determinada categoria ("Palavra-chave") e o número de ESTs esperado de acordo com a distribuição normal. Um valor probalístico (P-value) foi estimado para as pregas de excesso de expressão calculadas. Genes foram selecionados com base nos resultados apresentados nas Tabelas 1-19 abaixo e outros filtros computacionais combinados com curação manual conforme detalhado abaixo.

[00241] NUE242, NUE244, NUE234, NUE239, NUE240, NUE514, NUE523, NUE533, NUE538, NUE548, NUE549, NUE241, NUE235, NUE251, NUE587 e NUE582 foram selecionados já que são altamente expressos em raízes e em condições de deficiência de nutrientes (conforme mostrado nas Tabelas 1 e 2, abaixo no presente documento). Tabela 1 Expressão digital de NUE242, NUE244, NUE234, NUE239, NUE240, NUE514, NUE523, NUE533, NUE538, NUE548, NUE549, NUE241, NUE235, NUE251, NUE587 e NUE582 em diferentes tecidos.

[00242] Tabela 1. Expressão digital dos genes indicados da semente em germinação, raíz, muda e brotos. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis. Tabela 2 Expressão digital de NUE242, NUE244, NUE234, NUE239, NUE240, NUE514, NUE523, NUE533, NUE538, NUE548, NUE549, NUE241, NUE235, NUE251, NUE587 e NUE582 em diferentes condições de crescimento

[00243] Tabela 2. Expressão digital dos genes indicados sob seca, estiolamento estresse por calor, deficiências de nutrientes e alagamento. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis.

[00244] NUE229, NUE248, NUE254, NUE542, NUE562, NUE237, NUE221, NUE585 and NUE588 foram selecionados por causa de sua alta expressão nas raízes e em condições de estresse por seca (conforme mostrado nas tabelas 3 e 4 abaixo). Tabela 3 Expressão digital ofNUE229, NUE248, NUE254, NUE542, NUE562, NUE237, NUE221,NUE585 e NUE588 em diferentes tecidos.

[00245] Tabela 3. Expressão digital dos genes indicados na folha, semente, raíz, muda e brotos. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis. Tabela 4 Expressão digital de NUE252, MAB106, NUE265, NUE553, NUE513, NUE579, NUE580, NUE256, NUE227 e NUE223 em diferentes condições de crescimento.

[00246] Tabela 4. Expressão digital dos genes indicados sob resfriamento, aridez, estiolamento e salinidade. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis.

[00247] NUE252 e MAB106, NUE265, NUE553, NUE513, NUE579, NUE580, NUE256, NUE227 and NUE223 foram selecionados por causa de sua alta expressão sob condições de crescimento de estiolamento (como mostra a Tabela 5). Tabela 5 Expressão digital de NUE252, MAB106, NUE265, NUE553, NUE513, NUE579, NUE580, NUE256, NUE227 e NUE223 em diferentes condições de crescimento.

[00248] Tabela 5. Expressão digital dos genes indicados sob aridez, estiolamento, calor e metais pesados. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis. Tabela 6 Expressão digital de NUE252, MAB106, NUE265, NUE553, NUE513, NUE579, NUE580, NUE256, NUE227 e NUE223 em diferentes condições de crescimento.

[00249] Tabela 6. Expressão digital dos genes indicados sob salinidade, estresse oxidativo e inundações. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis.

[00250] NUE224, NUE230, NUE255, NUE245, NUE237, NUE233, NUE231, NUE228, NUE225 e NUE249 foram selecionados devido a sua alta expressão em raízes e expressão quando foram tratados com hormônios intrinsecamente relacionados ao crescimento e desenvolvimento de plantas (como mostra as Tabelas7, 8 e 9). Tabela 7 Expressão digital de NUE224, NUE230, NUE255, NUE245, NUE237, NUE233, NUE231, NUE228, NUE225 e NUE249 em diferentes tecidos.

[00251] Tabela 7. Expressão digital dos genes indicados na folha, calo, raíz, muda e brotos. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis. Tabela 8 Expressão digital de NUE224, NUE230, NUE255, NUE245, NUE237, NUE233, NUE231, NUE228, NUE225 and NUE249 em diferentes condições de crescimento e tratamento.

[00252] Tabela 8. Expressão digital dos genes indicados hormônios de crescimento de plantas, aridez e estiolamento. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis. Tabela 9 Expressão digital de NUE224, NUE230, NUE255, NUE245, NUE237, NUE233, NUE231, NUE228, NUE225 e NUE249 em diferentes tratamentos de crescimento.

[00253] Tabela 9. Expressão digital dos genes indicados sob alagamento, resposta ao fotoperíodo e salinidade. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis.

[00254] NUE268, NUE574 e NUE575 foram selecionados devido a sua alta expressão em calos (um tecido com grande taxa de divisão cellular) e induzidos, quando tratados com hormônios relacionados ao desenvolvimento e ao crescimento de plantas (como mostra a tabela 10, abaixo). Tabela 10 Expressão digital de NUE268, NUE574 e NUE575 em diversos tecidos e sob diferentes condições e tratamentos.

[00255] Tabela 10. Expressão digital dos genes indicados em diversos tecidos (folha, calo, raiz, muda e brotos) e sob diversos tratamentos ou condições (hormônios de desenvolvimento de plantas, aridez, estiolamento, inundações, resposta ao fotoperíodo e salinidade). São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Nota-se uma expressão de pregas significante no calo e sob hormônios de desenvolvimento de plantas.

[00256] CT75, CT7, CT76, CT71, CT74, CT11, CT20, CT81, CT22, CT82, CT3, CT40, CT1, CT6, CT27, CT2, NUE269, NUE545 e NUE544,foram selecionados devido ao sua alta expressão em fibras de algodão, em que a formação é fortemente relacionada a alongamento de células (Tabelas 11 e 12 abaixo) e, portanto, deverão ter um efeito positivo no desenvolvimento da raiz em condições normais, condições em que há deficiência de nitrogênio, escassez de fertilizantes e/ou deficiências hídricas, bem como para o aumento do teor de óleo. Tabela 11 Expressão digital de CT75, CT7, CT76, CT71, CT74, CT11, CT20, CT81, CT22, CT82, CT3, CT40, CT1, CT6, CT27, CT2, NUE269, NUE545 e NUE544 em diferentes tecidos.

[00257] Tabela 11. Expressão digital dos genes indicados em fibras de algodão, frutas, sementes e raízes. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Nota-se uma expressão de pregas significante nas fibras de algodão. Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis. Tabela 12 Expressão digital de CT75, CT7, CT76, CT71, CT74, CT11, CT20, CT81, CT22, CT82, CT3, CT40, CT1, CT6, CT27, CT2, NUE269, NUE545 e NUE544

[00258] Tabela 12. Expressão digital dos genes indicados em mudas, caule e folha. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis.

[00259] Plantas crescendo sob condições baixas de nitrogênio ou condições de aridez severa sofrem de senescência foliar severa. NUE525, NUE535, NUE565, NUE578, NUE515 e NUE591 foram selecionados como genes fortemente induzidos em folhas e sob deficiências de nutrientes em condições de estresse hídrico (como mostras as Tabelas 13 e 14 abaixo). Além disso, NUE578 demonstra uma forte indução em plantas afetadas pelo estresse calórico. Tabela 13 Expressão digital de NUE525, NUE535, NUE565, NUE578, NUE515 e NUE591 em diferentes tecidos

[00260] Tabela 13. Expressão digital dos genes indicados em folha, raíz, flor e calo. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Nota-se expressão de pregas na folha. Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis. Tabela 14 Expressão digital de NUE525, NUE535, NUE565, NUE578, NUE515 e NUE591 em diferentes condições

[00261] Tabela 14. Expressão digital dos genes indicados sob deficiência nutricional, aridez, salinidade e calor. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Nota-se expressão de pregas sob deficiência nutricional e aridez. Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis.

[00262] NUE520, NUE521, NUE560, NUE563 e NUE573 foram selecionados como genes que podem aprimorar o vigor de mudas sob condições de estresse de nitrogênio. NUE520, NUE521, NUE560 foram selecionados como genes que são fortemente expressados em plantas inteiras e são fortemente duzidos sob estresse hídrico. NUE563 foi selecionado como um gene que é fortemente induzido em folhas de mudas e é induzido sob estresse salino. NUE573 é induzido em raízes de mudas e sob estresse salino. Tabela 15 Expressão digital de NUE520, NUE521, NUE560, NUE563 e NUE573 em diferentes tecidos

[00263] Tabela 15. Expressão digital dos genes indicados em folha, raíz, flor e muda. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Nota-se expressão de pregas em folha (NUE563), raíz (NUE573) e muda (NUE520, NUE521, NUE560, NUE563 and NUE573). Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis. Tabela 16 Expressão digital de NUE520, NUE521, NUE560, NUE563 e NUE573 em diferentes condições.

[00264] Tabela 16. Expressão digital dos genes indicados sob deficiência nutricional, aridez e salinidade. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Nota-se expressão de pregas em aridez (NUE520, NUE521, NUE560) e salinidade (NUE563 e NUE573). Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis.

[00265] Mudas e culturas de células são tecidos de crescimento rápido. Além disso, raízes de mudas emergentes alongam-se muito rápido para alcançar a água disponível e o nitrogênio em solos mais profundos. NUE520, NUE211, NUE564 e NUE567 foram selecionados devido a sua forte expressão em raízes de mudas e/ou mudas inteiras, enquanto NUE519 foi selecionado por sua alta expressão em raízes de mudas e culturas de células (ver Tabela 17). Tabela 17 Expressão digital de NUE520, NUE211, NUE564, NUE567, e NUE519 em diferentes tecidos.

[00266] Tabela 17. Expressão digital dos genes indicados em folha, suspensão celular, raiz, muda e broto. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Nota-se expressão de pregas em raiz (NUE211, NUE564, NUE567 e NUE519) e mudas (NUE211 e NUE564). Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis.

[00267] NUE528, NUE571, NUE531 e NUE590 são induzidos a estresse por resfriamento. O estresse por resfriamento reduz a fotossíntese da planta e produz efeitos similares aos observados em plantas crescendo sob deficiência de nitrogênio (ver Tabela 18). Tabela 18 Expressão digital de NUE528, NUE571, NUE531 e NUE590 em diferentes condições.

[00268] Tabela 18. Expressão digital dos genes indicados sob deficiências nutricionais, resfriamento, aquecimento, salinidade e aridez. São fornecidos o aumento de pregas e os valores p calculados. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos se o valor p tiver sido inferior a 0,05. Nota-se expressão de pregas sob deficiências nutricionais (NUE528) e resfriamento (NUE528, 571, 531 e 590). Células em branco indicam que o gene não está expresso ou que não há dados disponíveis.

[00269] NUE206 foi selecionado com base em sua análise de expressão digital. Ela demonstrou que NUE206 é altamente expressada em raízes (2,4 pregas p < 0,05) e há indicações de ser incluída pelo resfriamento (2,2 pregas p < 0,08). NUE208 e NUE210 são genes do tomate que são expressos em frutas e durante o amadurecimento de frutas, respectivamente. Estes estágios são considerados importantes para a manutenção de intenso turgor celular. NUE209 é uma proteína homeodomíno HB2 putativa fortemente expressada em botões de flores. Foi selecionado como um gene que pertence a um grupo ortólogo de genes que são altamente induzidos pelos hormônios de desenvolvimento das plantas como as auxinas (5 pregas p < 0,002), e em tecidos que mantém intenso turgor celular como a polpa das frutas (3 pregas p < 0,00098) e calo (2 pregas p < 0,0003). NUE246 foi selecionado devido a sua forte expressão no pericarpo dos frutos (3,7 pregas p < 0,01) e por ser fortemente induzido sob aridez (4 pregas, p < 0,0013). NUE516 é uma Pto kinase interactor putativa selecionada para sua indução sob condições de aridez (3,2 pregas, p < 0,03) e primeiramente para o estágio de inundação (2,0 pregas p < 0,02). NUE527 foi escolhido devido a sua expressão em diferentes deficiências nutricionais (3,7 pregas p < 0,002) sendo expressa principalmente sob deficiência de fosfato (4 pregas, p< 0,006). NUE547, a qual é uma nucleasse dependente de Ca(2+)- Putativo, foi selecionada como um gene induzido em flores durante a fase de pré-antese (2,0 pregas p< 0,04). NUE551 é uma proteína não caracterizada que foi classificada e escolhida como um gene que é induzido em flores (2,6 pregas p < 0,007) e é envolvido no metabolismo do carbono das plantas (G0:0005975 metabolismo de carboidratos). NUE554 foi caracterizada como uma proteína de ligação TBT que é induzida em brotos (1,8 pregas p < 8e-09) durante a bolha e/ou extração na fase de enchimento dos grãos (3,4 pregas p < le-08). NUE583 é uma proteína não caracterizada foretemente expressada em flores (2,5 pregas p <0,006) e induzida de forma significante por citocininas (4,0 pregas p < 2e-05). NUE584 é uma proteína fortemente induzida em brotos e raízes (6,0 pregas p < 8e-07) e super-representada sob condições de deficiência de nutrientes (6,0 pregas p < le-08) e aridez (3,0 pregas p<0,03). NUE592 é uma proteína induzida por deficiência de fosfato (2,0 pregas p< 0,05) e por estresse por hormônios relacionados (6,1 pregas p< 2E-05).

[00270] Outros genes NUE e MAB foram selecionados com base em suas expressões em diferentes experimentos de Microarrays. Os experimentos selecionados do Gene Expression Omnibus (Protocolo de Transferência de Hipertexto://World Wide Web (dot) ncbi (dot) nlm (dot) nih (dot) gov/geo/) foram estresse abiótico (arides, salinidade) GSE6901, deficiência de nitrogenio GSE4409, resfriamento GSE3326, rice atlas GSE6893, e auxin GSE3350. Foram escolhidos de TAIR (Protocolo de Transferência de Hipertexto: //World Wide Web (dot) arabidopsis (dot) org/servlets/Search?type=expr&search_action=new_search) os experimentos em salinidade 1007966888, osmoticum 1007966835, resfriamento 1007966553 e aplicação ABA 1007964750, e de Nascarrays (Protocolo de Transferência de Hipertexto://affymetrix (dot) arabidopsis (dot) info/narrays/experimentbrowse (dot) pi) foi escolhido um experimento em deficiência de nitrogênio NASCARRAYS-136. Além destes, dados microarray sobre Propriedades da fibra de algodão foram utilizados para detector a expressão dos genes em fibras de algodão ou raízes especificamente (PCT Publication No: WO 2008/075364).

[00271] Baseando-se na analise dos experimentos microarray descritos assima, NUE222 foi selecionada devido a sua forte expressão sob deficiência de nitrogênio, salinidade e por sua forte indução por ABA( ver Tabela 19, logo abaixo). NUE267 e NUE206 foram selecionados como os genes que são fortemente induzidos pela salinidade, resfriamento e ABA. NUE212 é um gene do algodão expressado especificamente em raízes. MAB52 foi selecionado devido a sua indução pela aridez. MAB53 foi selecionado devido a sua indução por deficiência de nitrogênio e seu ortólogo funcional de MAB 106. NUE566 e NUE568 foram selecionados devido a sua alta expressão em folhas, quando comparadas com expressões em raízes. NUE570 foi selecionado devido a sua super-representação na literatura sobre folhas da EST (5 pregas p< 0,001) e sua indução por salinidade em experimentos microarray. NUE540 é expressado em raízes e é relacionado a diferenciação das células das raízes capilares (G0:0048765). NUE539, NUE543, NUE576 e NUE577 foram selecionados por serem fortemente induzidos sob deficiência de nitrogênio. NUE577 também foi selecionado por estar incluído em salinidade e estresse por resfriamento. NUE569 foi selecionado por estar induzido a condições de salinidade e osmoticum. NUE586 foi selecionado por estar induzido quando tratado com o hormônio de crescimento auxina. NUE253 foi selecionada como um gene fortemente expressado sob deficiência de nitrogênio e salinidade e NUE593 foi selecionado como um gene fortemente expressado sob condições de salinidade. Tabela 19 Análise de expressão por Microarray de NUE222, NUE267, NUE206, NUE212, MAB52, MAB53, NUE539, NUE543, NUE576, NUE566, NUE568, NUE569, NUE570, NUE572, NUE581, NUE540, NUE586, NUE577, NUE253 e NUE593

[00272] Tabela 19: Análise de expressão por Microarray de genes indicados sob condições de salinidade, aridez, osmoticum, deficiência de nitrogênio, resfriamento, ABA(ácido abscísico) e raízes, brotos e auxina. Células em branco indicam que o gene não está expresso.

[00273] NUE49, NUE50 e NUE102 são variants de genes previamente descritos que foram selecionados originalmente para produtividade e melhora no NUE (PCT Publication No. W02007/049275).

[00274] No geral, 137 genes foram identificados como tendo um maior impacto na eficiência do uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produtividade (ex: produção de sementes, produção de óleo, quantidade e/ou qualidade de grãos), taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor do óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água quando sua expressão é, então, aumentada em plantas. Os genes identificados, suas sequências expostas de polinucleotídeo e polipeptídeo, bem como suas sequencias atualizadas de acordo com o banco de dados BenBank estão sumarizadas na Tabela 20, logo abaixo. Tabela 20 Genes que afetam a eficiência do uso do nitrogênio, eficiência do uso de fertilizantes, produtividade, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água.

[00275] Tabela 20. São fornecidos polinucleotídeo (polyn.) e polipeptídeo (polyp.) que afetam a eficiência do uso de nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produtividade, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor do óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água de uma planta.

EXEMPLO 2 IDENTIFICAÇÃO DE HOMÓLOGOS QUE AFETAM NUE, FUE, PRODUTIVIDADE, TAXA DE CRESCIMENTO, VIGOR, BIOMASSA, TEOR DE ÓLEO, ABST E WUE.

[00276] Os conceitos de ortologia e paralogia foram aplicados a caracterizações e classificações funcionais na escala de comparações de todo o genoma. Ortólogos e parálogos constituem dois tipos principais de homólogos: O primeiro evoluiu de um ancestral comum por meio de especialização, sendo o último está relacionado a eventos de duplicação. Supõe-se que parálogos decorrentes de antigos eventos de duplicação são susceptíveis de ter divergências na função, enquanto ortólogos verdadeiros são mais propensos a reter a função idêntica ao longo do tempo evolutivo.

[00277] Para investigar profundamente o ortólogo purativo do gene e identifica-lo genes que afetam a eficiência do uso do nitrogênio, eficiência no uso de fertilizantes, produtividade (ex: produção de sementes, produção de óleo, quantidade e/ou qualidade de grãos), taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor do óleo, tolerância ao estresse abiótico e/ou eficiência no uso da água (presentes acima, na Tabela 20) todas as sequencias foram alinhadas utilizando-se o the BLAST (/Basic Local Alignment Search Tool/). Sequências suficientemente semelhantes foram tentativamente agrupadas. Estes ortólogos putativos foram posteriormente organizados em um Filograma, um diagrama de ramificações (árvore) que representaria as relações evolutivas entre os táxons biológicos. Grupos de ortólogos putativos foram analisados de acordo com o filograma e em casos de desentendimentos, estes ortólogos foram adequadamente fracionados. Dados de expressão foram analisados e a literatura de EST foram classificadas usando um vocabulário fixo de termos personalizados, de acordo com seu estágio de desenvolvimento (ex: genes demostrando perfil de expressão similar através do desenvolvimento com aumento da regulação em fase específica, como na fase de enchimento de grãos) e/ou órgãos da planta (ex: genes demonstrando perfil de expressão similar através de seus órgãos com aumento da regulação em órgãos específicos com a raíz). As anotações feitas de EST foram agrupadas a um gene o qual foi analisado estatisticamente, comparando sua frequência no conjunto versus sua abundância no banco de dados, possibilitando a construção de um perfil de expressão numérico e gráfico do gene, que é chamado de “expressão digital”. A razão de se utilizar estes dois tipos de métodos complementares, com métodos de estudos de associação fenotípica de QTLs, e correlação de expressão fenotípica está baseada na suposição de que ortólogos verdadeiros devem manter a função idêntica durante o tempo evolucionário. Esses métodos fornecem diferentes conjuntos de indicações sobre as semelhanças de função entre dois genes homólogos, semelhanças no nível de sequência - aminoácidos idênticos nos domínios da proteína e similaridade nos perfis de expressão.

[00278] A pesquisa e identificação de genes homólogos envolve a análise da sequencia de informações envolvidas, por exemplo, em banco de dados públicos que incluem, mas não são limitados ao Banco de Dados de DNA do Japão (DDBJ), Genbank, e o banco de dados sobre a sequência do ácido nucleico do Laboratório Europeu de Biologia Molecular (EMBL) ou versões do mesmo ou o banco de dados do MIPS. Um número de diferentes algoritmos de pesquisa está sendo desenvolvido, incluindo, mas não limitados ao suíte de programas relacionados aos programas BLAST.

[00279] Existem cinco implementações do BLAST, três desenvolvidas para questões de sequência de nucleotídeos (BLASTN, BLASTX, e TBLASTX) e duas desenvolvidas para questões sobre a sequência de proteínas (BLASTP e TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., Genome Analysis, I: 543, 1997).Tais métodos envolvem o alinhamento e a comparação das sequências. O algoritmo BLAST calcula a porcentagem de identidade da sequência e realiza uma análise estatística de semelhança entre as duas sequências. O programa para realização da análise BLAST está disponível para o público através do Centro Nacional de Informação em Biotecnologia. Outros programas ou algoritmos são GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA. GAP que utilizam os algoritmos de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para determiner o alinhamento de duas sequências completes que maximize o número de equivalentes e minimize o número de lacunas. Os genes homólogos podem pertencer à família de um mesmo gene. A análise de uma família de genes pode ser realizada através de análise de similaridade de sequência. Para executar esta análise pode-se usar os programas padrão para alinhamentos múltiplos, por exemplo Clustal W. Uma árvore de junção de proteínas homólogas semelhantes aos genes de algumas modalidades da invenção pode ser usada para fornecer uma visão geral das relações estruturais e ancestrais. A sequência de identidade pode ser calculada utilizando um programa de alinhamento como descrito acima. Espera-se que outras plantas irão carregar um gene funcional semelhante (ortólogo) ou uma família de genes similares e os genes fornecerão o mesmo fenótipo preferencial como os genes aqui apresentados.

[00280] Vantajosamente, estes membros da família podem ser úteis nos métodos de algumas modalidades da invenção. Exemplos de outras plantas incluem, mas não se limitam a, cevada (Hordeum vulgare), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), milho (Zea mays), algodão (Gossypium), óleo de colza (Brassica napus), arroz (Oryza sativa), cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), sorgo (Sorgo bicolor), soja (Glycine max), girassol (Helianthus annuus), tomate (Lycopersicon esculentum) e trigo (Triticum aestivum).

[00281] As análises acima mencionadas para sequencia de homólogos é realizada preferencialmente em uma sequência inteira, mas também pode ser baseada em uma comparação de determinadas regiões, tais como domínios conservados. A identificação de tais domínios seria boa também dentro do domínio de pessoas hábeis neste tipo de área e que envolveria, por exemplo, um formato legível em computador dos ácidos nucléicos de algumas modalidades da invenção, o uso de programas de alinhamento e a utilização disponíveis a acesso público sobre os domínios da proteína, motivo conservado e caixas. Esta informação está disponível nos bancos de dados PRODOM (Protocolo de Transferência de Hipertexto:// World Wide Web (dot) biochem (dot) ucl (dot) ac (dot) uk/bsm/dbbrowser/protocol/prodomqry (dot) html), PIR (Protocolo de Transferência de Hipertexto:// pir (dot) Georgetown (dot) edu/) ou Pfam (Protocolo de Transferência de Hipertexto://World Wide Web (dot) Sanger (dot) ac (dot) uk/Software/Pfam/) database. Programas de análise de sequência projetados para pesquisar o motivo podem ser usados para identificação de fragmentos, regiões e domínios conservados como mencionado acima. Programas de computador apresentados incluem, mas não limitado a, MEME, SIGNALSCAN e GENESCAN.

[00282] Uma pessoa hábil na área pode utilizar as sequências de homólogos aqui fornecidas para encontrar sequências similares em outras espécies e outros organismos. Homólogos de uma proteína englobam peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas com substituições de aminoácidos, exclusões e / ou inserções em relação à proteína inalterada em questão, possuindo atividade biológica e funcional semelhantes à proteína não modificada a partir das quais são derivadas. Para produzir tais homólogos, aminoácidos da proteína podem ser substituídos por outro aminoácido com propriedades semelhantes (mudanças moderadas, como a hidrofobicidade semelhante, hidrofilicidade, antigenicidade propensão para formar ou quebrar estruturas a-helicoidais ou estruturas de 3 sheets). Tabelas de substituição moderada são bem conhecidas na área [ver, por exemplo, Proteínas Creighton (1984). W.H. Freeman and Company], Homólogos de um ácido nucleico abrangem ácidos nucléicos com substituições de nucleotídeos, exclusões e/ou inserções em relação ao ácido nucleico não modificado em questão e com atividade biológicas e funcionais semelhantes, como o ácido nucléico não modificado a partir dos quais são derivados.

[00283] A Tabela 21, logo abaixo, lista um índice de sequências ortólogas e homólogas das sequências de polinucleotídeos (SEQ ID NOs: 1137) e as sequências de polipeptídeos (SEQ ID NOs: 138-269) apresentados na Tabela 20, que foram identificados utilizando BLAST (programas TBLASTN e BlastP) obtendo pelo menos 80% de identidade aos polipeptídeos selecionados e que devem possuir o mesmo papel em NUE, ABST, FUE, QUE, incremento da biomassa, incremento na taxa de crescimento, produtividade, vigor e/ou teor de óleo de plantas Tabela 21

[00284] Tabela 21: São fornecidos os polipeptídeos (polypep.) e polinucleotídeos (polynucl.) dos genes e polipeptídeos identificados na Tabela 20, que são capazes de aumentar a eficiência do uso de nitrogênio, eficiência de uso de fertilizantes, produtividade, taxa de crescimento, vigor, biomassa, teor de óleo, a tolerância a estresse abiótico e / ou eficiência do uso da água de uma planta. A homologia foi calculada como % de identidade sobre as sequências alinhadas. As sequências de consulta foram sequências de polipeptídeo SEQ ID NOs: 138-269 e as sequências sujeitas são sequências de polipeptídicas ou sequências de nucleotídeos, que foram traduzidos de forma dinâmica em todos os seis quadros de leitura identificados no banco de dados baseado em mais de 80% de identidade com as sequências de consulta de polipeptídeos.

EXEMPLO 3 GERAÇÃO E CLONAGEM DE GENES DE VETORES BINÁRIOS PARA EXPRESSÃO EM PLANTAS Estratégia de clonagem

[00285] Os genes apresentados nos exemplos 1 e 2 acima foram clonados em vetores binários para a geração de plantas transgênicas. Para a clonagem, a fase de leitura aberta inteira (ORF) foi identificada pela primeira vez. Grupos de ESTs, e em alguns casos, sequências de mRNA foram analisados para identificar a fase de leitura aberta toda de cada gene, comparando os resultados dos diversos algoritmos de tradução para proteínas conhecidas de outras espécies de plantas.

[00286] A fim de clonar a totalidade de cDNA’s, uma Transcrição Reversa seguida de PCR (RT-PCR) foi realizada no total de RNA extraído de folhas, fibras ou outros tecidos da planta, crescendo em condições normais, com deficiência de nutrientes ou outras condições de estresse abiótico. A extração total de RNA, produção de cDNA e amplificação de PCR foram realizados utilizando protocolos padrões descritos em outros lugares (Sambrook J., E.F. Fritsch, e T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.), que são bem conhecidos por aqueles especialistas na arte. Os produtos PCR foram purificados utilizando um kit de purificação PCR (Qiagen) e o sequenciamento dos produtos PCR amplificados foi realizado, utilizando o sequenciador ABI 377 (Applied Biosystems). Em caso em que nenhuma faixa ou faixas de produtos PCR fracas foram visíveis no Brometo de Etídio - gel de agarose 1% corados, 0,1 - 1 |u,L do produto PCR foi utilizado como uma amostra de DNA e a amplificação de PCR foi efetuada utilizando o mesmo ou novos conjuntos de iniciadores, projetados internamente para o primeiro conjuntos de iniciadores. Em tais casos, o conjunto de iniciadores do qual se espera produzir os produtos PCR mais longos é designado Conjunto de iniciadores externos (EF e ER para Externo-Avançado e Externo-Reverso, respectivamente) e o conjunto de iniciadores do qual se espera produzir os produtos PCR mais curtos é designado Conjunto de iniciadores agrupados (NF e NR para Agrupado-Avançado e Agruapado-Reverso, respectivamente, conforme ilustrado na Tabela 22 abaixo. A clonagem de genes de algodão CT75, CT7, CT76, CT71, CT74, CT11, CT20, CT81, CT22, CT82, CT3, CT40, CT1, CT6, CT27 e CT2 foi realizada utilizando apenas um conjunto de iniciadores, conforme detalhado na Publicação WO N°: W02005/121364.

[00287] Para facilitar a clonagem de cDNA’s, uma extensão bp 7-12 foi adicionada aos 5’ primeiros finais da maioria dos iniciadores. A extensão do iniciador inclui um local de restrição de endonuclease (Tabela 22). Os locais de restrição foram selecionados utilizando dois parâmetros: (a). O local não existe na sequência de cDNA; e (b). Os locais de restrição nos iniciadores avançados e reversos são projetados de tal modo que o cDNA digerido é inserido na formação de sentido no vetor binário utilizado na transformação. A tabela 22, abaixo, fornece a designação dos iniciadores, os locais de restrição da endonuclease adicionados à clonagem subsequente e as sequências de cada iniciador utilizado na amplificação dos genes das mesmas configurações da invenção. Tabela 22 Iniciadores PCR utilizados na clonagem e na seleção dos clones positivos

[00288] Tabela 22. São fornecidas as sequências dos iniciadores utilizados na clonagem dos genes indicados e na seleção de plasmídeos binários clonados. Iniciadores são fornecidos de 5’ —> 3’. “EF” = iniciador avançado externo; “ER” = iniciador reverso externo; “NF” = iniciador avançado agrupado; “NR” = iniciador reverso agrupado. A menos que de outra forma indicado, todos os genes foram clonados de moléculas de RNA. “GA” = GeneArt, genes preparados sinteticamente; “Enz.” = Enzima; “Plas.” = Plasmídeo.

[00289] Cada produto PCR digerido foi inserido em um vetor de cópia elevada originado do vetor de plasmídeo pBlue-script KS (vetor de plasmídeo pBlue-script KS, Protocolo de Transferência de Hipertexto://www (ponto) stratagene (ponto) com/manuals/212205 (ponto) pdf). No caso do vetor de cópia elevada originado do vetor de plasmídeo pBlue-script KS (pGN), o produto PCR foi inserido no plasmídeo de cópia elevada anterior ao terminador NOS (SEQ ID N0:3064) originado do vetor binário pBI 101,3 (GenBank Acesso N°. U12640, nucleotídeos 4417 a 4693). Em outros casos, o produto PCR foi inserido no vetor de cópia elevada pCR®-BluntII-TOPO® (ZeroBlunt® TOPO ® PCR Kit de clonagem, Invitrogene). Alguns destes genes foram encomendados sinteticamente sintetizados de um fornecedor comercial (GeneArt, GmbH), estes genes foram postos nos vetores de cópia elevada pQXYN, pGXN, obtidos dos fornecedores.

[00290] O sequenciamento dos genes inseridos foi realizado utilizando o sequenciador ABI 377 (Applied Biosystems). Em alguns casos, após a confirmação das sequências dos genes clonados, o cDNA clonado acompanhado com o terminador NOS foi introduzido nos vetores binários pGI, contendo o promotor 35S via digestão com restrição de endonucleases adequadas. Em outros casos, o cDNA clonado acompanhado com o promotor 35S foi introduzido no vetor pGI. Em nenhum caso, a inserção foi seguida por cópia única do terminador NOS (SEQ ID NO: 3064). Os produtos digeridos e o vetor plasmídeo linearizado foram ligados utilizando a enzima ligase T4 DNA (Roche, Suíça).

[00291] Para alguns dos polinucleotídeos clonados, ao invés de amplificar a sequência a partir do cDNA, as sequências sintéticas foram encomendadas de um fornecedor comercial GeneArt, GmbH). Dessa forma, nenhum iniciador foi utilizado para a amplificação dos genes sintéticos. Para otimizar as sequências de codificação dos genes sintéticos, Tabelas de uso de códon, calculadas a partir dos transcritores de plantas, foram utilizadas (exemplos de tais Tabelas podem ser encontrados no Banco de Dados de Uso de Códon, disponível on-line em Protocolo de Transferência de Hipertexto://www (ponto) kazusa (ponto) or (ponto) jp/codon/). A sequência de codificação otimizada é projetada de tal forma que mudanças não são introduzidas na sequência do ácido amino codificado, enquanto se utiliza códons selecionados para expressão em plantas dicotiledôneas, principlamente tomates e Arabidopsis; e plantas monocotiledôneas, tais como o milho. Estas sequências otilizada promovem uma melhor taxa de tradução e, portanto, níveis de expressão de proteínas mais elevados. Para as sequências otimizadas, divisões adicionais de locais de enzimas de restrição únicas foram adicionadas - para facilitar a clonagem dos genes nos vetores binários.

[00292] Os vetores binários de plasmídeos pPI e pGI foram utilizados para introduzir as construções de gene em plantas. O plasmídeo pPI foi construído inserindo uma sequência de sinal poli-(A) sintético, originado a partir do vetor de plamídeo básico pGL3 (Promega, Ac. No. U47295; bp 4658-4811) no local de restrição Hindlll do vetor binário pBI101.3 (Clontech, Acc. No. U12640). Em alguns casos, o plasmídeo binário da espinha dorsal utilizado foi pGI que é similar ao pPI, mas o gene GUS foi substituído pelo gene GUS-Intron (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 1990). O plasmídeo pPI ou pGI foi utilizado para clonar as sequeAcnias de polinucleotídeos, inicialmente sob o controle do promotor 35S [Odell, JT, et al. Nature 313, 810 - 812 (28 February 1985); SEQ ID NO: 3063] ou o promotor Arabidopsis thaliana At6669 (SEQ ID N0:3064, PCT Publicação No. W02004/104162).

[00293] A sequência do promotor At6669 ou CaMV 35S (estabelecido em SEQ ID NO: 3063) é inserido no vetor binário pPI ou pGI anterior aos genes clonados utilizando as enzimas de restrição Hindlll e Sail ou BamRl (Roche, Suíça). Os produtos PCR digeridos e o vetor de plasmídeo linearizado foram ligados utilizando a enzima ligase de DNA T4 (Roche, Suíça), conforme descrito acima.

[00294] 60 |uL de E. coli, da linhagem de células competentes DH5-a (cerca de 109 células/mL) foram transformadas utilizando 1 jllI de mistura de reação de ligação por eletroporação, utilizando um eletroporador MicroPulser (Biorad), 0,2 cm cadinho (Biorad) e programa de eletroporação EC-2 (Biorad). As células de E. coli foram cultivadas em 0,8 mL de líquido médio a 37°C por 1 hora e 0,2 mL de suspensão de células foram colocadas em placas de LB-agar suplementadas com 50 mg/L de antibiótico canamicina (Sigma). As placas foram, então, incubadas a 37°C por 16 horas. Colônias de bactérias foram cultivadas e a expressão foi confirmada por amplificação de PCR utilizando os conjuntos de iniciadores detalhados na Tabela 22, acima, que foram projetados para espalhar a sequência no vetor binário.

[00295] Os produtos PCR foram separados em gel agarose 1,5% e os tamanhos dos produtos foram estimados por comparação por escala de DNA (MBI Fermentas). Tabela 23 Sequências clonadas Tabela 23. São fornecidos os genes produzidos sinteticamente ou clonados e seus polipeptídeos codificados, justamente com os identificadores de sequências, organismos a partir dos quais os genes foram clonados.

EXEMPLO 4 GERAÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS EXPRESSANDO OS POLINUCLEOTÍDEOS DE ALGUMAS CONFIGURAÇÕES DA INVENÇÃO

[00296] A transformação do Arabidopsis foi realizada conforme Clough SJ, Bent AF. (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16(6): 735-43; e Desfeux C, Clough SJ, Bent AF. (20000 Female reproductive tissues are the primary targets of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method. Plant Physiol. 123(3): 895-904.). Briefly- As Arabidopsis thaliana var Columbia (T0 plants) foram transformadas utilizando o procedimento Floral Dip descrito por Clough SJ e Bent AF (10) e por Desfeux C et al. (11), com pequenas modificações. A Arabidopsis thaliana Columbia (Col0) T0 Plants foram semeadas em vasos de 250 ml preenchido com uma mistura de crescimento com base em material fóssil umedecido. Os vasos foram cobertos com folha de alumínio e cúpula de plástico, mantidos à temperatura de 4°C por 3-4 dias, então descobertas e incubadas em uma câmara de crescimento à temperatura de 18-24°C sob 16/8 ciclos de luz/escuridão. As plantas T0 estavam prontas para transformação seis dias antes da florescência. Colônias individuais de Agrobacterium contendo vetores binários hospedagem de poli nucleotídeos de algumas configurações da invenção foram cultivadas em LB médio suplementado com kanamicina (50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L). As culturas foram incubadas à 28°C por 48 horas sob agitação vigorosa e centrifugadas a 4000 rpm por 5 minutos. Os paletes compreendendo células de Agrobacterium foram resuspendidos em uma transformação média que continha meia potência (2,15 g/L) Murashige-Skoog (MS) médio (Duchefa); 0,044 μM de benzilamino purina (Sigma); 112 μg/L B5 de vitaminas Gambourg (Sigma); 5% de sacarose e 0,2 ml/L Silwet L-77 (OSI Specialists, CT) em água duplamente destilada, a pH of 5,7.

[00297] A transformação de plantas T0 foi realizada invertendo-se cada planta em uma suspensão de Agrobacterium de forma que o talo de floração seja submergido por 3-5 segundos. Cada planta T0 foi imediatamente colocada em uma bandeja de plástico, então coberta com domo de plástico transparente para manter a umidade e mantida no escuro em temperatura ambiente por 18 horas para facilitar a infecção e transformação. Plantas transformadas (transgênica) foram então descobertas e transferidas para uma estufa para plantas para recuperação e maturação. As plantas T0 transgênicas se desenvolverem em uma estufa para plantas por 3-5 semanas até a maturação síliqua, e então as sementes foram colhidas e mantidas em temperatura ambiente até a semeadura.

[00298] Para gerar florações de plantas transgênicas T1 e T2, os poli nucleotídeos de algumas configurações das invenções, sementes coletadas das plantas transgênicas T0 foram esterilizadas por superfície por encharcamento em 70 % de etanol por 1 minuto, seguido por encharcamento em 5 % de hipoclorito de sódio e 0,05 % de Triton X-100 por 5 minutos. As sementes de superfície esterilizada foram completamente molhadas em água destilada estéril e então colocadas em placas de cultura contendo meia potência de Murashige-Skoog (Duchefa); 2 % de sacarose; 0,8 % de ágar para planta; 50 mM de kanamicina e 200 mM de carbenicilina (Duchefa). As placas de cultura foram incubadas a 4°C por 48 horas e então transferidas para incubadora a 25°C por uma semana adicional de incubação. Plantas Arabidopsis Vital T1 foram transferidas para placas de cultura novas para um outro período de incubação. Após a incubação, as plantas T1 foram removidas para placas de cultura e plantadas em uma mistura para crescimento contido em vasos de 250 ml. As plantas transgênicas foram então deixadas para crescimento em uma estufa para plantas para amadurecerem. Sementes colhidas das plantas T1 foram cultivadas e até o crescimento para amadurecimento, assim como as plantas T2 sob as mesmas condições utilizadas para cultura e crescimento das plantas T1. Pelo menos 10 transformações independentes foram criadas a partir de cada construção para as quais os lotes de sementes T2 foram coletadas.

[00299] Os genes NUE584 (SEQ ID N°: 2514), NUE253 (SEQ ID N°: 2448), NUE533 (SEQ ID N°: 2473), NUE577 (SEQ ID N°: 2507), NUE590 (SEQ ID N°: 2519) e NUE562 (SEQ ID N°: 2492) foram clonados, introduzidos na Arabidopsis e sementes T2 foram produzidas.

[00300] NUE540 (SEQ ID N°: 2479), NUE549 (SEQ ID N°: 2486), e NUE533 (SEQ ID N°: 2473) desenvolveram plantas saudáveis de coloração púrpura, sugerindo o vigor aumentado das plantas transgênicas.

[00301] NUE591 (SEQ ID N°: 2520) produziu plantas de coloração verde clara. Este fenótipo está relacionado ao gene da capacidade fotossintética da planta em diferentes níveis de fertilização de nitrogênio.

EXEMPLO 5 ENSAIO 1: EFICIÊNCIA MELHORADA DO USO DE NITROGÊNIO IN VITRO (ENSAIO DE CULTURA DE TECIDO)

[00302] Sementes de superfície esterilizada foram semeadas em média basal [50% de Murashige-Skoog médio (MS) suplementado com 0,8 % de ágar de planta como agente solidificante] na presença de Kanamicina (utilizado como um agente de seleção). Após a semeadura, as placas foram transferidas por 2-3 dias para estratificação a 4°C e então germinadas a 25°C sob ciclos diários de 12 horas na luz e 12 horas no escuro, por 7 a 10 dias. Neste ponto de tempo, mudas escolhidas randomicamente foram cuidadosamente transferidas para placas contendo ^ de MS médio (15 mM N) para o tratamento normal de concentração de nitrogênio e 0,75 mM de nitrogênio para os tratamento de baixa concentração de nitrogênio. Cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transgênico e 3-4 placas diferentes (replicatas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo da invenção pelo menos quatro eventos independentes de transformações foram analisados para cada construção. Plantas expressando os poli nucleotídeos da invenção foram comparadas às medições médias das plantas de controle (vetor vazio ou gene de relato GUS sob o mesmo promotor) utilizados no mesmo experimento.

[00303] Imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem laboratorial, que consiste de uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) acoplada com uma lente de comprimento focal de 55 mm (série Canon EF-S), montada sobre um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (lâmpadas de 4 x 150 Watts) e localizadas em um quarto escuro, foi utilizado para capturar imagens das plantinhas semeadas nas placas de ágar.

[00304] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 3-4 dias, iniciando no dia 1 até o dia 10 (vide, por exemplo, as imagens nas Figuras 3 A-B). Um sistema de análise de imagem foi utilizado, o qual consiste de um computador desktop pessoal (Intel P4 processador de 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.39 [programa de processamento baseado em Java que foi desenvolvido no U.S. National Institutes of Health e disponibilizado para uso livre na internet no protocolo de transferência de hipertexto://rsbweb (dot) nih (dot) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 Mega Pixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em formato JPEG (Joint Photographic Experts Group standard) de baixa compressão. A seguir, dados analisados foram salvos em arquivos texto e processados utilizando-se um software de análise estatística JMP (SAS institute).

[00305] Análise da muda - Utilizando a análise digital, os dados da muda foram calculados, incluindo a área de folhagem, cobertura da raiz e comprimento da raiz.

[00306] A área de crescimento relativo para os diversos parâmetros da muda foi calculada de acordo com a fórmulas V, VI e VII, a seguir. Fórmula V: Taxa de crescimento relativo da área de folhagem = Coeficiente de regressão da área de folhagem ao longo do tempo de curso. Fórmula VI: Taxa de crescimento relativo da cobertura da raiz = Coeficiente de regressão da cobertura da raiz ao longo do tempo de curso. Fórmula VII: Taxa de crescimento relativo do comprimento da raiz = Coeficiente de regressão da cobertura da raiz ao longo do tempo de curso.

[00307] Ao final do experimento, plantinhas foram removidas do meio e pesadas para a determinação do peso da planta nova. Plantinhas foram então secadas por 24 horas a 60°C, e pesadas novamente para medir o peso da planta seca para análises estatísticas posteriores. A taxa de crescimento foi determinada comparando-se a cobertura da área de folhagem, cobertura da raiz e comprimento da raiz, entre cada par de fotografias sequenciais, e os resultados foram utilizados para resolver o efeito do gene introduzido no vigor da planta sob condições ideais. Similarmente, o efeito do gene introduzido no acúmulo de biomassa, sob condições ideais, foi determinado comparando-se as plantas novas e peso seco àqueles das plantas de controle (contendo um vetor vazio e um gene de relato GUS sob o mesmo promotor). A partir de cada construção criada, 3-5 eventos independentes de transformação foram examinados em replicatas.

[00308] Análises estatísticas - Para identificar genes conferindo vigor de planta significativamente melhorado ou arquitetura de raiz enlarguecida, os resultados obtidos das plantas transgênicas foram comparados com aqueles obtidos das plantas de controle. Para identificar genes e construções de melhor qualidade, resultados dos eventos independentes de transformação testados foram analisados separadamente. Para avalizar o efeito de um evento de gene sobre um controle, o dado foi analisado por teste T de Estudante e o valor p foi calculado. Os resultados foram considerados significativos se p < 0,1. O pacote de software estatístico JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA). Resultados experimentais

[00309] Os genes apresentados nas Tabela 24-25, abaixo, mostraram melhoria na eficiência de uso do nitrogênio (NUE), produzindo biomassa de plantas maiores quando germinadas sob condições limitadoras de germinação de nitrogênio, comparados a plantas de controle.

[00310] A Tabelas 24 e 25 representam análises de biomassa das plantas planta fresca e peso seco e área de folhagem) quando germinadas sob condições limitadoras de nitrogênio [condições de baixo nitrogênio ou deficiência de nitrogênio (0,75 mM N)] em plantas sobre-expressando os poli nucleotídeos de algumas configurações da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi realizada testando- se o desempenho de diversos eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais que um ensaio de cultura de tecido e o segundo experimento confirmou o aumento significativo na biomassa das plantas. Evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 24 Plantas transgênicas exógenas expressando os poli nucleotídeos de algumas configurações da invenção, exibindo biomassa de planta melhorada (fresca e peso seco) sob condições deficientes de nitrogênio

[00311] Tabela 24: Análises de biomassa da planta (planta fresco e peso seco) de plantas transgênicas sobre-expressando o poli nucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (utilizando genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob condições de regulação de um promotor constitutivo (35S) quando germinadas sob condições limitadoras de nitrogênio [condições de baixo nitrogênio ou deficiência de nitrogênio (0,75 mM N)], como comparado à plantas de controle. "Aum." = aumento. Tabela 25 Plantas transgênicas exógenas expressando os poli nucleotídeos de algumas configurações da invenção, exibindo biomassa de planta melhorada (área de folhagem) sob condições deficientes de nitrogênio

[00312] Tabela 25: Análises de biomassa da planta (área de folhagem) de plantas transgênicas sobre-expressando o poli nucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (utilizando genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob condições de regulação de um promotor constitutivo (35S) quando germinadas sob condições limitadoras de nitrogênio [condições de baixo nitrogênio ou deficiência de nitrogênio (0,75 mM N)], como comparado à plantas de controle. "Aum." = aumento.

[00313] Os genes apresentados na Tabela 26, abaixo, melhoraram o NUE da plante, uma vez que eles produziram biomassa de raiz maiores quando germinadas sob condições limitadoras de germinação de nitrogênio, comparado à plantas de controle. Plantas produzindo biomassa de raiz maiores têm mais possibilidades de absorver quantidades maiores de nitrogênio a partir do solo.

[00314] A Tabela 26 representa análises de biomassa da raiz (comprimento e cobertura da raiz) quando germinadas sob condições limitadores de nitrogênio [condições de baixo nitrogênio ou deficiência de nitrogênio (0,75 mM N)] em plantas sobre-expressando os poli nucleotídeos de algumas configurações da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi realizada pelo teste de desempenho de diversos eventos. Alguns dos genes foram avalizados em mais de um ensaio de cultura de tecido e o segundo experimento confirmou o aumento significativo no desempenho da raiz. Evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 26 Plantas transgênicas exógenas expressando os poli nucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem desempenho melhorado da raiz sob condições de deficiência de nitrogênio

[00315] Tabela 26: Análises do desempenho da raiz (comprimento e cobertura da raiz) de plantas transgênicas sobre-expressando o poli nucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (utilizando genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob regulação de um promotor constitutivo (35S) quando o germinada sob condições limitadoras de nitrogênio [condições de baixo nitrogênio ou deficiência de nitrogênio (0,75 mM N)] como comparado às plantas de controle. "Méd." = Média; "Aum." = aumento.

[00316] Os genes apresentados nas Tabelas 27 e 28, abaixo, melhoraram a taxa de crescimento das plantas quando germinadas sob condições de germinação de nitrogênio, comparadas às plantas de controle. Plantas mostrando taxa de crescimento rápido confirma um melhor estabelecimento da planta no solo sob condições de deficiência de nitrogênio. Crescimento mais rápido foi observado quando a taxa de crescimento da área de folhagem, bem como o comprimento e cobertura da raiz foram medidos.

[00317] As Tabelas 27 e 28 representam análises da taxa de crescimento da planta da área de folhagem, cobertura da raiz e comprimento da raiz quando germinadas sob condições limitadoras de nitrogênio [condições de baixo nitrogênio ou deficiência de nitrogênio (0,75 mM N)] em plantas transgênicas sobre-expressando o poli nucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção sob regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi realizada pelo teste de desempenho de diversos eventos. Alguns dos genes foram avalizados em mais de um ensaio de cultura de tecido e o segundo experimento confirmou o aumento significativo na taxa de crescimento. Eventos com valor p <0.1 foram considerados estatisticamente significativos. Tabela 27 Plantas transgênicas exógenas expressando os poli nucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem taxa de crescimento da planta melhorada (taxa de crescimento relativo da área de folhagem e cobertura da raiz) sob condições de deficiência de nitrogênio

[00318] Tabela 27: Análises da taxa de crescimento da planta (crescimento relativo da área de folhagem e cobertura da raiz) de plantas transgênicas sobre-expressando o poli nucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (utilizando genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob regulação de um promotor constitutivo (35S) quando o germinada sob condições limitadoras de nitrogênio [condições de baixo nitrogênio ou deficiência de nitrogênio (0,75 mM N)] como comparado às plantas de controle. "Aum." = Aumento; "RGR" = taxa de crescimento relativo. Tabela 28 Plantas transgênicas exógenas expressando os poli nucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem taxa de crescimento da planta melhorada (taxa de crescimento relativo da área de folhagem e comprimento da raiz)sob condições de deficiência de nitrogênio

[00319] Tabela 28: Análises da taxa de crescimento da planta (crescimento relativo da área de folhagem e comprimento da raiz) de plantas transgênicas sobre-expressando o poli nucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (utilizando genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob regulação de um promotor constitutivo (35S) quando o germinada sob condições limitadoras de nitrogênio [condições de baixo nitrogênio ou deficiência de nitrogênio (0,75 mM N)] como comparado às plantas de controle. "Aum." = Aumento; "RGR" = taxa de crescimento relativo. Tabela 29 Plantas transgênicas exógenas expressando os poli nucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem biomassa da planta melhorada (planta fresca e seca) sob condições padrões de nitrogênio Nome do Gene Evento # Peso da Planta fresca Nome do Gene Evento # Peso da Planta seca

[00320] Tabela 29: Análises da taxa de biomassa das plantas (planta fresca e seca) de plantas transgênicas sobre-expressando o poli nucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (utilizando genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob regulação de um promotor constitutivo (35S) quando o germinada sob condições limitadoras de nitrogênio [condições de baixo nitrogênio ou deficiência de nitrogênio (15 mM N)] como comparado às plantas de controle. "Aum." = Aumento; "RGR" = taxa de crescimento relativo. Tabela 30 Plantas transgênicas exógenas expressando os poli nucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem biomassa da planta melhorada (área de folhagem) sob condições padrões de nitrogênio

[00321] Tabela 30: Análises da taxa de biomassa das plantas (área de folhagem) de plantas transgênicas sobre-expressando o poli nucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (utilizando genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob regulação de um promotor constitutivo (35S) quando o germinada sob condições limitadoras de nitrogênio [condições de baixo nitrogênio ou deficiência de nitrogênio (15 mM N)] como comparado às plantas de controle. "Aum." = Aumento; "RGR" = taxa de crescimento relativo.

[00322] Os genes apresentados na Tabela 31, abaixo, tem NUE da planta melhorado uma vez que elas produziram biomassa da raiz maiores quando germinadas sob condições padrões de germinação de nitrogênio, comparadas às plantas de controle. Plantas produzindo biomassa de raiz maiores tem melhores possibilidades de absorver quantidades maiores de nitrogênio do solo.

[00323] A Tabela 31 representa análises de desempenho da raiz (comprimento e cobertura da raiz) quando germinadas sob condições padrões de nitrogênio [condições de germinação normal ou regular (15 mM N)] em plantas sobre-expressando os poli nucleotídeos de algumas configurações da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi realizada pelo teste de desempenho de diversos eventos. Alguns do gentes foram avalizados em mais de um ensaio de cultura de tecido e os resultados obtidos foram repetidos. Eventos com valor p <0.1 foram considerados estatisticamente significativos. Tabela 31 Plantas transgênicas expressando exogenamente polinucleotídeos de algumas modalidades da invenção apresentam melhor desempenho da raiz (comprimento de raízes e cobertura) em condições de nitrogênio padrão

[00324] Tabela 31: Análises de desempenho da raiz (comprimento e cobertura) de plantas transgênicas superexpressaram os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção (utilizando genes clonados ou sintéticos, listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S), quando desenvolvidas sob condições padrão de nitrogênio [condições regulares ou normais de crescimento (15 mM N)] conforme comparação para controlar plantas. "Incr." = aumento; "RGR" = taxa de Crescimento Relativo.

[00325] Os genes apresentados na Tabela 32, neste documento adiante, melhoraram o ca taxa de crescimento da planta quando esta se desenvolve sobre condições padrão de nitrogênio, comparadas com o controle de plantas. Um crescimento mais rápido foi observado quando a taxa de crescimento da área da folha, do comprimento e da cobertura da raiz foram mensurados.

[00326] Tabela 32 detalha análises das taxas de crescimento da área de folha, comprimento e cobertura da raiz quando sob condições padrão de nitrogênio [condições regulares ou normais de crescimento (15 mM N)] em plantas superexpressaram os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi realizada testando o desempenho em uma série de eventos. Algumas A avaliação de cada gene foi realizada por testes de desempenho de vários eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecidos e os resultados obtidos foram repetidos. Evento com valor de p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 32 Plantas transgênicas expressando exogenamente polinucleotídeos de algumas modalidades da invenção apresentam melhor taxa de crescimento em condições de nitrogênio padrão Nome do Gene Evento # RGR da Area da Folha RGR da Cobertura da Raiz RGR do Comprimento da Raiz

[00327] Análise da taxa de crescimento da planta (área foliar, a cobertura da raiz e comprimento de raízes) de plantas transgênicas que superexpressam a polinucleotídeos exógenos de algumas modalidades da invenção (usando os genes clonados ou sintéticas listadas na Tabela 23 acima), sob a regulação de um constituinte promotor (35S), quando cultivadas sob condições padrão de nitrogênio [condições normais de crescimento ou regular (15 mM N)] em relação ao controle de plantas. "Incr." = Acréscimo; "RGR" = taxa de crescimento relativo, "Ave". = Média.

EXEMPLO 6 ENSAIO 2: USO EFICIENTE DO NITROGÊNIO: PRODUÇÃO E TAXA DE CRESCIMENTO DE PLANTAS EM CONCENTRAÇÃO ÓTIMA DE NITROGÊNIO E EM ESTUFAS

[00328] Este ensaio segue a produção constitutiva de sementes, formação de biomassa e crescimento da área roseta de plantas cultivadas em estufa, nitrogênio deficiente de nitrogênio condições padrão de fertilização. As sementes foram semeadas em ágar suplementado com meio Vi MS e um agente de seleção (canamicina). As mudas T2 transgênicas foram transplantadas para bandejas 1,7 cheias de turfa e perlite. As bandejas foram irrigadas com uma solução contendo nitrogênio constante condições limitantes, que foram atingidos por irrigar as plantas com uma solução contendo 1,5 mM de nitrogênio inorgânico em forma de KNO3, suplementado com 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 3,6 mM K2SO4, 2 mM CaCl2 e microelementos, enquanto os níveis normais de nitrogênio foram obtidos com a aplicação de uma solução de 6 mM de nitrogênio inorgânico também na forma de KNO3 com 1 mM de KH2PO4, 1 mM MgSC> 4,2 mm CaCl2 e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas em estufa até as sementes maduras. As sementes foram colhidas separadamente acima da linha do solo, extraídas e pesadas. A biomassa (a cobertura acima do solo) também foi recolhida e seca durante uma semana a 30°C.

[00329] Cada constructo foi validado na sua geração T2. Plantas transgênicas transformadas com uma construção em conformidade com um vetor vazio carregando o promotor 35S e o marcador de seleção foram usadas como controle.

[00330] As plantas foram analisadas quanto à sua dimensão global, a taxa de crescimento, rendimento de grãos, 1.000 - peso de grãos, matéria seca e índice de colheita (HI-semente de produção / matéria seca). O desempenho das plantas transgênicas foi comparado com o controle de plantas cultivadas em paralelo, nas mesmas condições.

[00331] O experimento foi planejado em distribuição de lotes aleatórios agrupados. Para cada gene da invenção 3-5 eventos de transformação independentes foram analisados a partir de cada construto.

[00332] Imagem digital - Um laboratório de sistema de aquisição de imagem, que consiste de um reflexo da câmera digital (Canon EOS 300D) acoplada a uma lente focal de espessura de 55 mm (Canon série EF-S), montados em um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que inclui 4 unidades de luz (4 x 150 Watts lâmpada) foi usado para capturar imagens de amostras de plantas.

[00333] O processo de captação de imagem foi repetido a cada dois dias a partir do dia 1 após o transplantio e até o dia 15. A mesma câmera, colocada em um suporte de ferro feito especialmente para ela, utilizado para capturar imagens em corte de plantas maiores em vasos brancos em uma estufa de ambiente controlado. Durante o processo de captura, as bandejas foram colocadas abaixo do suporte de ferro, evitando a luz direta do sol e o aparecimento de sombras.

[00334] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, o qual consiste de um computador tipo PC (Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - Imagem J 1.39 [programa Java de processamento de imagem que foi desenvolvido no National Institutes of Health dos EUA e estão disponíveis gratuitamente na Internet em Hypertext Transfer Protocol:// rsbweb (ponto) nih (ponto) gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 megapixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em uma baixa compressão JPEG (padrão Joint Photographic Experts Group) de formato. Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística JMP (SAS Institute).

[00335] Análise de Crescimento Foliar - Por meio da análise digital dos dados das folhas foi calculado, incluindo o número de folhas, área roseta, diâmetro da roseta, área de lâmina foliar, cobertura de parcela, comprimento do pecíolo da folha.

[00336] Taxa de crescimento vegetativo: é a taxa de crescimento da planta, tal como definido por fórmulas VIII, IX, X e XI Fórmula VIII: Taxa de crescimento relativo da área de lâmina foliar = coeficiente de regressão da área foliar ao longo do curso do tempo. Fórmula IX: Taxa de crescimento relativo da área roseta = coeficiente de regressão da área de roseta ao longo do curso do tempo. Fórmula X Taxa de crescimento relativo do diâmetro da roseta de regressão = coeficiente de diâmetro da roseta ao longo do curso do tempo. Fórmula XI Taxa de crescimento relativo da cobertura da parcela de regressão: coeficiente de cobertura de parcelas ao longo do curso do tempo.

[00337] Sementes de peso médio (peso de sementes ou peso de 1.000 sementes) - No final do experimento, as sementes foram coletadas.As sementes foram espalhadas em uma bandeja de vidro e uma foto foi tirada. Por meio da análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculada.

[00338] Peso seco da planta e produção de sementes - Em cerca de 80 dias da semeadura, as plantas foram colhidas e deixadas para secar a 30 ° C em uma câmara de secagem.O peso da biomassa e de sementes de cada parcela, foram medidos e divididos pelo número de plantas em cada parcela.

[00339] Peso seco = peso total da parte vegetativa acima do solo (raízes exclusive), após secagem a 30°C em uma câmara de secagem;

[00340] Produção de grãos por planta = peso total de sementes por planta (g).

[00341] O índice de colheita pode ser calculado pela fórmula III (como descrito acima, índice de colheita = rendimento médio em sementes por planta / peso seco).

[00342] Análises estatísticas - Para identificar os genes que conferem eficiência ao uso de nitrogênio e melhorar significativamente o rendimento da produção, os resultados obtidos com as plantas transgênicas foram comparados com aqueles obtidos a partir de plantas de controle. Para identificar genes de alto desempenho e construções, os resultados dos eventos de transformação independentes testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados utilizando t-teste de estudante e os resultados foram considerados significativos se o valor p foi inferior a 0,1. O pacote de software estatístico JMP foi utilizado (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA). Os resultados da experiência:

[00343] Os genes apresentados nas Tabelas 33, 34 e 35, neste documento adiante, melhoraram o NUE da planta, quando cultivada em condições limites de concentração de nitrogênio. Estes genes proporcionam maior produtividade de sementes, índice de colheita, peso das sementes (expresso em peso de 1000 sementes) e usina de biomassa [(expressos como planta de massa seca (DW)], quando cultivada em condições de limitantes de nitrogênio para crescimento, em relação ao controle.

[00344] Tabelas 33, 34 e 35 detalham análises da produção das sementes, índice de colheita, tamanho da semente (expresso em peso de 1000 sementes), quando cultivadas sob condições limitantes de nitrogênio em plantas com superexpressão de polinucleotídeos de algumas modalidades da invenção no âmbito da regulamentação de um constitutiva (35S ). A avaliação de cada gene foi realizada por meio de testes o desempenho de vários eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecidos e os resultados obtidos foram repetidos. Evento com valor de p<0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 33 Plantas transgênicas expressando exogenamente polinucleotídeos de algumas modalidades da invenção apresentam a produção de sementes melhoradas e peso (expresso em peso de 1000 sementes) em condições de nitrogênio deficiente de crescimento.

[00345] Tabela 33: Análise da produção de sementes e peso de plantas transgênicas que superexpressam a polinucleotídeos exógenos de algumas modalidades da invenção (usando os genes clonados ou sintéticas listadas na Tabela 23 acima), sob a regulação de um promotor constitutivo (35S), quando cultivadas sob deficiência de nitrogênio condições (1,5 mM KNO3, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4. 3.6 mM K2SO4, 2 mM CaCl2 e microelementos) em relação ao controle de plantas."Incr." = Acréscimo, "Ave". = Média. Tabela 34 Plantas transgênicas expressando exogenamente polinucleotídeos de algumas modalidades da invenção apresentam melhor índice de colheita em condições de nitrogênio deficiente de crescimento. Nome do Gene Evento # Indice de Colheita

[00346] Tabela 34: Análise de índice de colheita de plantas transgênicas que superexpressam a polinucleotídeos exógenos de algumas modalidades da invenção (usando os genes clonados ou sintéticas listadas na Tabela 23 acima), sob a regulação de um promotor constitutivo (35S), quando cultivadas sob condições de deficiência de nitrogênio (1,5 mM, KNO3 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4. 3,6 mM K2SO4, 2 mM CaCl2 e microelementos) em relação ao controle de plantas. Tabela 35 Plantas transgênicas expressando exogenamente polinucleotídeos de algumas modalidades da invenção apresentam melhorou o peso seco sob nitrogênio condições de crescimento deficiente

[00347] Tabela 35: Análise do peso seco de plantas transgênicas que superexpressam a polinucleotídeos exógenos de algumas modalidades da invenção (usando os genes clonados ou sintéticas listadas na Tabela 23 acima), sob a regulação de um promotor constitutivo (35S), quando cultivadas sob condições de deficiência de nitrogênio (1,5 mM KNO3, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4. 3,6 mM K2SO4, 2 mM CaCl2 e microelementos) em relação ao controle de plantas.

[00348] Os genes apresentadas nos Quadros 36 e 37, neste documento adiante, melhoraram o NUE das plantas, pois proporcionaram maior produção de sementes, índice de colheita, peso de grãos (expresso em peso de 1000 sementes) e biomassa vegetal [(expressos como peso da planta seca (DW)] quando cultivadas em condições de nitrogênio padrão para o crescimento, comparado ao controle de plantas indicando a alta capacidade da planta para melhor metabolização do nitrogênio presente no meio.

[00349] As Tabelas 36 e 37 mostram as análises de peso seco, rendimento de grãos, índice de colheita, tamanho da semente (expresso em peso de 1000 sementes), quando cultivadas sob condições padrão de nitrogênio (6 mM de KNO3, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 2 MM CaCl2 e microelementos) nas plantas com superexpressão da polinucleotídeos de algumas modalidades da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi realizada por testes de desempenho de vários eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecidos e os resultados obtidos foram repetidos. Evento com valor de p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 36 Plantas transgênicas expressando exogenamente polinucleotídeos de algumas modalidades da invenção apresentam biomassa vegetal melhorado (peso seco) e produção de sementes em condições de nitrogênio padrão

[00350] Tabela 36: Análise da biomassa vegetal (peso seco) e ver o rendimento de plantas transgênicas que superexpressam polinucleotídeos exógenos de algumas modalidades da invenção (usando os genes clonados ou sintéticas listadas na Tabela 23 acima), sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivadas sob condições padrão de nitrogênio (6 mM de KNO3, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 2. mM CaCl2 e microelementos) em relação ao controle de plantas. "Incr." = Acréscimo; "RGR" = taxa de crescimento relativo, "Ave". = Média. Tabela 37 Plantas transgênicas expressando exogenamente polinucleotídeos de algumas modalidades da invenção apresentam melhor índice de colheita e peso de sementes em condições de nitrogênio padrão

[00351] Tabela 37: Análise de índice de colheita e peso de sementes de plantas transgênicas que superexpressam a polinucleotídeos exógenos de algumas modalidades da invenção (usando os genes clonados ou sintéticas listadas na Tabela 23 acima), sob a regulação de um promotor constitutivo (35S), quando cultivada sob o padrão condições de nitrogênio (6 mM de KNO3, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 e microelementos) em relação ao controle de plantas. "Incr." = Acréscimo; "RGR" = taxa de crescimento relativo, "Ave". = Média.

[00352] Melhoria da área de roseta, assim como a taxa de crescimento roseta suporta o fato de que plantas podem produzir maior quantidade de biomassa vegetal por meio de um melhor aproveitamento do nitrogênio disponível no solo. Além disso, uma produção de um maior número de folhas, bem como uma parcela maior cobertura quando cultivada em condições de baixo teor de azoto indicar uma maior capacidade fotossintética da planta, quando cultivada em condições de crescimento de nitrogênio

[00353] Os genes apresentadas nos Quadros 38 e 39, neste documento adiante, melhoraram o NUE da planta e produziram maior quantidade de biomassa de plantas quando cultivadas sob condições de limitar o crescimento de nitrogênio, em comparação com plantas controle. Além disso, uma produção de um maior número de folhas, bem como uma maior cobertura de plano, quando cultivada em condições de baixo teor de azoto indicar uma maior capacidade fotossintética da planta, quando cultivada em condições de nitrogênio para baixo crescimento

[00354] Tabelas 38 e 39 mostram as análises da área de roseta e número de folhas (diâmetro da roseta, área de roseta, número de folhas, área de lâmina foliar e cobertura do terreno), quando cultivadas sob condições limitantes de nitrogênio (1,5 mM KNO3, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 3,6 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 e microelementos) em plantas com superexpressão de polinucleotídeos de algumas modalidades da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi realizada por testes de desempenho de vários eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cul-tura de tecidos e os resultados obtidos foram repetidos. Evento com valor de p<0,1 foi considerado estatisticamente significatitivo. Tabela 38 Plantas transgênicas que expressem de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem performance de crescimento de rosácea aprimorada (diâmetro e área da rosácea e cobertura da planta) sob condições de deficiência de nitrogênio

[00355] Tabela 38: Análises de diâmetro de rosácea e cobertura da planta de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob condições de deficiência de nitrogênio (1,5 mM KN03, 1 mM KH2P04, 1 mM MgS04. 3,6 mM K2S04, 2 mM CaCl2 e microelementos) em comparação com as plantas de controle. "Incr." = incremento; "Ave." = média. Tabela 39 Plantas transgênicas que expressem de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem performance de crescimento de rosácea aprimorada (número de folhas e lâmina da folha) sob condições de deficiência de nitrogênio.

[00356] Tabela 39: As análises de número de folhas e lâmina da folha de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo 35S quando cultivada sob condições de deficiência de nitrogênio (1,5 mM KN03, 1 mM KH2P04, 1 mM MgS04. 3.6 mM K2SO4, 2 mM CaCl2 e microelementos) em comparação com as plantas de controle. "Incr." = incremento; “Ave.” = média.

[00357] Os genes apresentados nas Tabelas 40 e 41, mostrados abaixo, aprimoraram a taxa de crescimento da planta quando cultivada em níveis limitados de fertilização com nitrogênio. Esses genes aprimoraram a taxa de crescimento da rosácea e cobriram mais rapidamente o solo quando cultivada em condições limitadas de crescimento de nitrogênio.

[00358] Tabelas 40 e 41 descrevem as análises de taxa de crescimento de diâmetro da rosácea, área da rosácea, área da lâmina da folha, número de folhas e cobertura da planta quando cultivada sob condições limitadas de nitrogênio (1,5 mM KN03, 1 mM KH2P04, 1 mM MgS04, 3,6 mM K2S04, 2 mM CaCl2 e microelementos) em plantas que superexpressam os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi feita testando- se a performance de vários eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido e os resultados obtidos foram repetidos. Evento com valor p < 0,1 foi considerado estatisticamente significante. Tabela 40 Plantas transgênicas que superexpressam de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem taxa de crescimento aprimorada (taxa de crescimento relativo da área da lâmina da folha e taxa de crescimento da rosácea do número de folhas) sob condições de deficiência de nitrogênio

[00359] Tabela 40: As análises de taxa de crescimento (taxa de crescimento relativo da área da lâmina da folha e taxa de crescimento da rosácea do número de folhas) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob condições de deficiência de nitrogênio (1,5 mM KNO3, 1 mM KH2P04, 1 mM MgS04. 3,6 mM K2S04, 2 mM CaCl2 e microelementos) em comparação com as plantas de controle. Tabela 41 Plantas transgênicas que superexpressam de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem taxa de crescimento aprimorada (taxa de crescimento relativo da área e diâmetro da rosácea e da cobertura da planta) sob condições de deficiência de nitrogênio

[00360] Tabela 41: As análises de taxa de crescimento (taxa de crescimento relativo da área e diâmetro da rosácea e taxa de crescimento relativo da cobertura da planta) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob condições de deficiência de nitrogênio (1,5 mM KN03, 1 mM KH2P04, 1 mM MgS04, 3,6 mM K2S04, 2 mM CaCl2 e microelementos) em comparação com as plantas de controle.

[00361] Os genes apresentados nas Tabelas 42 e 43, mostrados abaixo, aprimoram o uso eficiente de nitrogênio da planta e produziram biomassa de planta maior quando cultivada sob condições de fertilização com nitrogênio padrão em comparação com as plantas de controle. Além disso, uma produção de um número maior de folhas, assim como uma maior cobertura da planta quando cultivada em condições de pouco nitrogênio indica uma capacidade fotossintética maior da planta quando cultivada em condições de crescimento com altos níveis de nitrogênio. As Tabelas 42 e 43 descrevem as análises da área da rosácea e número de folhas (diâmetro de rosácea, área de rosácea, número de folhas, área de lâmina da folha e cobertura da planta) quando cultivada sob condições padrão de fertilização com nitrogênio (6 mM KNO3, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgS04. 2 mM CaCh e microelementos) em plantas que superexpressam os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi feita testando-se a performance de vários eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido e os resultados obtidos foram repetidos. O evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 42 Plantas transgênicas que expressem de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem performance de crescimento de rosácea aprimorada (área e diâmetro da rosácea e cobertura da planta) sob condições padrão de nitrogênio

[00362] Tabela 42: As análises de performance de crescimento de rosácea (área e diâmetro da rosácea e cobertura da planta) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob nitrogênio padrão (6 mM KN03, 1 mM KH2P04, 1 mM MgS04. 2 mM CaCl2 e microelementos) em comparação com as plantas de controle. Tabela 43 Plantas transgênicas que expressem de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem performance de crescimento de rosácea aprimorada (número de folhas e área da lâmina da folha) sob condições pad rão de nil trogênio

[00363] Tabela 43: As análises de performance de crescimento de rosácea (número de folhas e área da lâmina da folha) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob nitrogênio padrão (6 mM KN03, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSCU. 2 mM CaCA e microelementos) em comparação com as plantas de controle.

[00364] Os genes apresentados nas Tabelas 44 e 45, mostrados abaixo, aprimoraram a taxa de crescimento da planta quando cultivada em níveis limitados de fertilização com nitrogênio. Esses genes aprimoraram a taxa de crescimento da rosácea e cobriram o solo mais rápido quando cultivada sob níveis padrão de fertilização com nitrogênio. Esses genes produziram crescimento mais rápido nas plantas, mostrando uma melhor utilização do nitrogênio presente.

[00365] Tabelas 44 e 45 descrevem as análises de taxa de crescimento de diâmetro da rosácea, área da rosácea, área da lâmina da folha, número de folhas e cobertura da planta quando cultivada sob condições padrão de nitrogênio (6 mM KN03, 1 mM KH2P04, 1 mM MgS04, 2 mM CaCl2 e microelementos) em plantas que superexpressam os polinucleotídeos de performance de vários eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido e os resultados obtidos foram repetidos. O evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 44 Plantas transgênicas que superexpressam de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem taxa de crescimento aprimorada (taxa de crescimento relativo da área da lâmina da folha, número de folhas e área da rosácea) sob condições padrão de nitrogênio

[00366] Tabela 44: As análises de taxa de crescimento (taxa de crescimento relativo da área da lâmina da folha, número de folhas e área da rosácea) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob nitrogênio padrão (6 mM KNO3, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSCU. 2 mM CaCl2 e microelementos) em comparação com as plantas de controle. Tabela 45 Plantas transgênicas que superexpressam de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem taxa de crescimento aprimorada (taxa de crescimento relativo do diâmetro da rosácea e cobertura da planta) sob condições padrão de nitrogênio

[00367] Tabela 45: As análises de taxa de crescimento (taxa de crescimento relativo do diâmetro da rosácea e cobertura da planta) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob nitrogênio padrão (6 mM KN03, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSCU. 2 mM CaCl2 e microelementos) em comparação com as plantas de controle.

EXEMPLO 7 ENSAIO 3: EFICIÊNCIA DE USO DO NITROGÊNIO MEDIDA ATÉ O ESTÁGIO DE PENEIRAMENTO: BIOMASSA DA PLANTA E TAXA DE CRESCIMENTO DA PLANTA EM ESTUFA SOB CONCENTRAÇÕES LIMITADAS E PADRÃO DE NITROGÊNIO

[00368] Este ensaio segue a produção de sementes, a formação de biomassa e o crescimento da área da rosácea das plantas cultivadas na estufa em condições limitadas e não limitadas de crescimento com nitrogênio. Sementes transgênicas de Arabidopsis foram cultivadas em meio de ágar suplementado com meio '/2 MS e agente de seleção (canamicina). As mudas T2 transgênicas foram então transplantadas para bandejas 1.7 preenchidas com turfa e perlita a uma razão de 1:1. As bandejas foram irrigadas com uma solução em condições limitadas de nitrogênio, obtida irrigando-se as plantas com uma solução contendo 1,5 mM de nitrogênio inorgânico na forma de KNO3, suplementada com 1 mM KH2PO4, 1 mM MgS04. 3,6 mM KC1, 2 mM CaCh e microelementos, enquanto os níveis normais de nitrogênio foram obtidos aplicando-se uma solução de 6 mM de nitrogênio inorgânico também na forma de KNO3 com 1 mM KH2PO4, 1 mM MgS04, 2 mM CaCl2 e microelementos. Todas as plantas foram cultivadas na estufa até o amadurecimento das sementes. A biomassa da planta (tecido acima do solo) foi pesada imediatamente após colheita da rosácea (peso da planta fresca ou PF). Em seguida, as plantas foram secas em forno a 50°C por 48 horas e pesadas (peso da planta seca ou PS).

[00369] Cada conjunto foi validado em sua geração T2. As plantas transgênicas transformadas com conjunto conformado por um vetor vazio portando o promotor 35S e o marcador selecionável foi usado como controle.

[00370] As plantas foram analisadas em seu tamanho geral, taxa de crescimento, peso fresco e matéria seca. A performance das plantas transgênicas em comparação com as plantas de controle cultivadas em paralelo sob as mesmas condições.

[00371] O experimento foi planejado com distribuição aleatória de plantas. Para cada gene da invenção, três a cinco eventos independentes de transformação foram analisados de cada conjunto.

[00372] Imagem digital - Um sistema de aquisição de imagens laboratoriais consistindo de uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) com uma lente de distância focal de 55 mm (Canon série EF-S), montada sobre dispositivo de reprodução (Kaiser RS) que inclui 4 lâmpadas (4 lâmpadas de 150 Watts cada) foi usada para capturar imagens das amostras das plantas.

[00373] O processo de captura de imagem foi repetido a cada dois dias a partir do dia 1 após o transplante até o dia 15. A mesma câmera, colocada em uma estrutura de ferro feita sob medida, foi usada para capturar imagens de plantas maiores cultivadas em tubos brancos em uma estufa com controle ambiental. Durante o processo de captura, os tubos foram colocados abaixo da estrutura de ferro, ao mesmo tempo em que evitam a luz solar direta e projeção de sombras.

[00374] Foi usado um sistema de análise de imagens que consiste de um computador de mesa (processador Intel P4 3,0 GHz) e um programa gratuito - Imagem J 1.39 [programa de processamento de imagens em Java desenvolvido no National Institutes of Health dos EUA e disponível gratuitamente na internet em http://rsbweb.nih.gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 megapixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em formato JPEG (Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados com uso do pacote de software de análise estatística JMP (SAS institute).

[00375] Análise das folhas - Com uso da análise digital, os dados das folhas foram calculados, incluindo o número das folhas, área da rosácea, diâmetro da rosácea, área da lâmina da folha, cobertura da planta e área do pecíolo da folha.

[00376] Taxa de crescimento vegetativo: é a taxa de crescimento da planta conforme definido pelas fórmulas VIII, IX, X e XI conforme descrito a seguir: Fórmula VIII: Taxa de crescimento relativo da área da lâmina da folha = Coeficiente de regressão da área da folha no decorrer do tempo. Fórmula IX: Taxa de crescimento relativo da área da rosácea = Coeficiente de regressão da área da rosácea no decorrer do tempo. Fórmula X Taxa de crescimento relativo do diâmetro da rosácea = Coeficiente de regressão do diâmetro da rosácea no decorrer do tempo. Fórmula XI Taxa de crescimento relativo da cobertura da planta = Coeficiente de regressão da cobertura da planta no decorrer do tempo.

[00377] Peso da planta fresca e seca - Por volta do dia 40 desde o cultivo, as plantas foram colhidas e pesadas diretamente para determinação do peso da planta fresca (PF) e deixada secando a 50°C em câmera de secagem por cerca de 48 horas antes da pesagem para determinação do peso da planta seca (PS).

[00378] Análises estatísticas - Para identificar genes que conferem melhoria significativa do eficiente de nitrogênio, os resultados obtidos das plantas transgênicas foram comparados com os resultados das plantas de controle. Para identificar genes e conjuntos com melhor performance, os resultados dos eventos independentes de transformação testados foram analisados separadamente. Os dados foram analisados com o teste t Student e os resultados foram considerados significativos se o valor p for menor do que 0,1. Foi usado o software de estatística JMP (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, Carolina do Norte, EUA). Resultados experimentais:

[00379] Os genes apresentados nas Tabelas 46 e 47, mostrados abaixo, aprimoraram o eficiente de nitrogênio da planta quando cultivada sob condições limitadas de crescimento de nitrogênio em comparação com as plantas de controle. Esses genes produziram plantas maiores com capacidade fotossintética maior quando cultivadas sob condições limitadas de nitrogênio.

[00380] Tabelas 46 e 47 descrevem as análises de biomassa da planta e área fotossintética (peso fresco, peso seco, diâmetro da rosácea, área da rosácea e cobertura da planta) quando cultivada sob condições limitadas de nitrogênio (1,5 mM KN03, 1 mM KH2P04, 1 mM MgS04, 3,6 mM KC1, 2 mM CaCb e microelementos) em plantas que superexpressam os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi feita testando- se a performance de vários eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido e os resultados obtidos foram repetidos. O evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 46 Plantas transgênicas que expressem de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem biomassa de planta aprimorada (peso fresco e peso seco) sob condições limitadas de nitrogênio

[00381] Tabela 46: As análises da biomassa da planta (peso seco e peso fresco) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob nitrogênio limitado (1,5 mM KNO3, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSCU. 3,6 mM KC1, 2 mM CaCl2 e microelementos) em comparação com as plantas de controle. Tabela 47 Plantas transgênicas que expressem de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem biomassa de planta aprimorada (área e diâmetro da rosácea e cobertura da planta) sob condições limitadas de

[00382] Tabela 47: As análises da biomassa da planta (área e diâmetro da rosácea e cobertura da planta) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob nitrogênio limitado (1,5 mM KN03, 1 mM 5 KH2P04, 1 mM MgS04. 3,6 mM KC1, 2 mM CaCl2 e microelementos) em comparação com as plantas de controle.

[00383] Os genes apresentados na Tabela 48, mostrados abaixo, aprimoraram o eficiente de nitrogênio da planta quando cultivada sob condições limitadas de crescimento de nitrogênio em comparação com as plantas de controle. Esses genes produziram áreas fotossintéticas maiores como pode ser observado pelo número de folhas maior, área da lâmina da folha e área do pecíolo.

[00384] Tabela 48 descreve as análises da área fotossintética da planta (número de folhas, área da lâmina da folha e área do pecíolo) quando cultivada sob condições limitadas de nitrogênio (1,5 mM KNO3, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgS04. 3,6 mM KC1, 2 mM CaCl2 e microelementos) em plantas que superexpressam os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi feita testando-se a performance de vários eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido e os resultados obtidos foram repetidos. O evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 48 Plantas transgênicas que expressem de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem área fotossintética aprimorada (número de folhas, área da lâmina da folha e área do pecíolo) sob condições limitadas de nitrogênio

[00385] Tabela 48: As análises da área fotossintética (número de folhas, área da lâmina da folha e área do pecíolo) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob nitrogênio limitado (1,5 mM KNO3, 1 mM KH2P04, 1 mM MgS04. 3,6 mM KC1, 2 mM CaCl2 e microelementos) em comparação com as plantas de controle.

[00386] Os genes apresentados na Tabela 49, mostrados abaixo, aprimoraram a taxa de crescimento da planta quando cultivada em níveis limitados de fertilização com nitrogênio. Esses genes aprimoraram a taxa de crescimento da rosácea e cobriram mais rapidamente o solo quando cultivada sob condições limitadas de crescimento de nitrogênio em comparação com as plantas de controle. Esses genes produziram um crescimento mais rápido mostrando uma utilização melhor do nitrogênio presente.

[00387] A Tabela 49 descreve análises da taxa de crescimento do diâmetro da rosácea, área da rosácea, área da lâmina da folha, número de folhas e cobertura da planta quando cultivada sob condições padrão de nitrogênio quando cultivada sob condições limitadas de nitrogênio (1,5 mM KNO3, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgS04, 3,6 mM KC1, 2 mM CaCl2 e microelementos) em plantas que superexpressam os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi feita testando-se a performance de vários eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido e os resultados obtidos foram repetidos. O evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 49 Plantas transgênicas que expressem de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem performance de crescimento de rosácea aprimorada (taxa de crescimento relativo da área e diâmetro da rosácea e cobertura da planta) sob condições limitadas de nitrogênio

[00388] Tabela 49: As análises de performance de crescimento de rosácea (taxa de crescimento relativo da área e diâmetro da rosácea e cobertura da planta) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob nitrogênio limitado (1,5 mM KN03, 1 mM KH2P04, 1 mM MgS04. 3,6 mM KC1, 2 mM CaCl2 e microelementos) em comparação com as plantas de controle.

[00389] Os genes apresentados nas Tabelas 50 e 51, mostrados abaixo, aprimoraram o eficiente de nitrogênio da planta quando cultivada sob condições padrão de crescimento de nitrogênio em comparação com as plantas de controle. Esses genes produziram plantas grandes com maior área fotossintética quando cultivada sob condições padrão de crescimento de nitrogênio em comparação com as plantas de controle.

[00390] As Tabelas 50 e 51 descrevem as análises de biomassa da planta (peso fresco, peso seco, diâmetro da rosácea, área da rosácea e cobertura da planta) quando cultivada sob condições padrão de nitrogênio (6 mM KN03, 1 mM KH2P04, 1 mM MgS04, 2 mM CaCl2 e microelementos) em plantas que superexpressam os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi feita testando-se a performance de vários eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido e os resultados obtidos foram repetidos. O evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 50 Plantas transgênicas que expressem de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem biomassa de planta aprimorada (peso seco e peso fresco) sob condições padrão de nitrogênio

[00391] Tabela 50: Aa análises de biomassa da planta (peso seco e peso fresco) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob nitrogênio padrão (6 mM KN03, 1 mM KH2P04, 1 mM MgS04. 2 mM CaCl2 e microelementos) em comparação com as plantas de controle. "Ave." = média. Tabela 51 Plantas transgênicas que expressem de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem biomassa de planta aprimorada (área e diâmetro da rosácea e cobertura da planta) sob condições padrão de nitrogênio

[00392] Tabela 51: As análises de biomassa da planta (área e diâmetro da rosácea e cobertura da planta) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivadas sob nitrogênio padrão (6 mM KNO3, 1 mM KH2P04, 1 mM MgS04; 2 mM CaCl2 e microelementos) em comparação com as plantas de controle. "Incr." = incremento; “Ave.” = média.

[00393] Os genes apresentados na Tabela 52, mostrados abaixo, aprimoraram o eficiente de nitrogênio da planta quando cultivada sob condições padrão de crescimento de nitrogênio em comparação com as plantas de controle. Esses genes produziram plantas grandes com maior área fotossintética como pode ser observado pelo número maior de folhas, área da lâmina da folha e área do pecíolo em comparação com as plantas de controle.

[00394] Tabela 52 descreve as análises da área fotossintética da planta (número de folhas e área do pecíolo) quando cultivada sob condições padrão de nitrogênio (6 mM KNO3, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSÚ4. 2 mM CaCh e microelementos) em plantas que superexpressam os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi feita testando-se a performance de vários eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido e os resultados obtidos foram repetidos. O evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 52 Plantas transgênicas que expressem de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem áreas fotossintéticas aprimoradas (área da lâmina da folha e comprimento do pecíolo) sob condições padrão de crescimento de nitrogênio

[00395] Tabela 52: As análises da área fotossintéticas (área da lâmina da folha e comprimento do pecíolo) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob nitrogênio padrão (6 mM KNO3, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSCU. 2 mM CaCl2 e microelementos) em comparação com as plantas de controle. "Ave." = média.

EXEMPLO 8 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS SOB CONDIÇÕES DE ESTRESSE ABIÓTICO

[00396] Uma das consequências da estiagem é a indução de estresse osmótico na área ao redor das raízes; portanto, em muitos estudos científicos, o PEG (por exemplo, 1,5 % PEG8000) é usado para simular as condições de estresse osmótico semelhantes à alta osmolaridade encontrada durante o estresse da estiagem.

[00397] Ensaio 1: Ensaio de tolerância a estresse abiótico sob condições de cultura - O crescimento da planta foi avaliado sob salinidade (150 mM NaCl) ou estresse osmótico [poli (etileno glicol) (PEG)] em condições de cultura de tecido.

[00398] As sementes com superfície esterilizada foram cultivadas em meio basal [50% de meio Murashige-Skoog (MS) suplementado com 0,8 % de ágar de planta como agente solidificante] na presença de canamicina (somente para seleção de plantas transgênicas). Após o cultivo, as placas foram transferidas por 2 a 3 dias para estratificação a 4°C e então cultivadas a 25°C sob ciclos de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão durante 7 a 10 dias. Nesse momento, mudas escolhidas aleatoriamente foram cuidadosamente transferidas para pratos contendo 150 mM ou 1,5 % de PEG: 0,5 de meio MS ou condições normais de crescimento (0,5 de meio MS). Cada placa continha 5 mudas do mesmo evento transgênico e 3 a 4 placas diferentes (réplicas) para cada evento. Para cada polinucleotídeo da invenção, no mínimo quatro eventos independentes de transformação foram analisados de cada conjunto. As plantas expressando os polinucleotídeos da invenção foram comparadas com a medição da média das plantas de controle (vetor vazio ou gene de repórter do GUS sob o mesmo promotor) usadas no mesmo experimento.

[00399] Imagem digital - Um sistema de aquisição de imagens laboratoriais que consiste de uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300D) com uma lente de distância focal de 55 mm (Canon série EF-S), montada sobre dispositivo de reprodução (Kaiser RS) que inclui 4 lâmpadas (4 lâmpadas de 150 Watts cada) e localizada em um quarto escuro, foi usada para capturar imagens das pequenas plantas cultivadas em pratos com ágar.

[00400] Foi usado um sistema de análise de imagens que consiste de um computador de mesa (processador Intel P4 3,0 GHz) e um programa gratuito - Imagem J 1.39 [programa de processamento de imagens em Java desenvolvido no National Institutes of Health dos EUA e disponível gratuitamente na internet em http://rsbweb.nih.gov/]. As imagens foram capturadas em resolução de 10 megapixels (3888 x 2592 pixels) e armazenadas em formato JPEG (Joint Photographic Experts Group). Em seguida, os dados analisados foram salvos em arquivos de texto e processados usando o software de análise estatística JMP (SAS institute).

[00401] Análise de mudas - Com uso da análise digital, os dados foram calculados, inclusive a área da folha, a cobertura da raiz e a comprimento da raiz.

[00402] A taxa de crescimento relativo dos vários parâmetros de muda foi calculada de acordo com as seguintes fórmulas V, VI e VII conforme descrito a seguir. Fórmula V: Taxa de crescimento relativo da área da folha = Coeficiente de regressão da área da folha no decorrer do tempo. Fórmula VI: Taxa de crescimento relativo da cobertura da raiz = Coeficiente de regressão da cobertura da raiz no decorrer do tempo. Fórmula VII: Taxa de crescimento relativo do comprimento da raiz = Coeficiente de regressão do comprimento da raiz no decorrer do tempo.

[00403] Ao final do experimento, as pequenas plantas foram removidas do meio e pesadas para a determinação do peso da planta fresca. As plantinhas foram então secas por 24 horas a 60°C e pesadas novamente para medição do seu peso seco para análise estatística posterior. A taxa de crescimento foi determinada comparando-se a cobertura da área da folha, a cobertura da raiz e o comprimento da raiz, entre cada par de fotografias sequenciais e os resultados foram usados para resolver o efeito do gene introduzido no vigor da planta, sob estresse osmótico e também sob condições ideais. De forma semelhante, o efeito do gene introduzido no acúmulo de biomassa, sob estresse osmótico e também sob condições ideais, foi determinado comparando-se o peso da planta fresca e da planta seca com o das plantas de controle (que continham o gene do repórter do GUS sob o mesmo promotor). De cada conjunto criado, foram examinados 3 a 5 eventos independentes de transformação nas réplicas.

[00404] Análises estatísticas - Para identificar genes que conferem tolerância significativamente aprimorada a estresses abióticos ou arquitetura de raiz maior, os resultados obtidos das plantas transgênicas foram comparados com os obtidos de plantas de controle. Para identificar genes e conjuntos com melhor performance, os resultados dos eventos independentes de transformação foram analisados separadamente. Para avaliar o efeito de um evento de gene sobre o controle, os dados foram analisados pelo teste t Student e o valor p foi calculado. Os resultados foram considerados significativos se p < 0,1. Foi usado o pacote de software de estatística JMP (Versão 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, Carolina do Norte, EUA). Resultados experimentais:

[00405] Os genes apresentados nas Tabelas 53, 54 e 55, mostrados abaixo, aprimoraram a ABST (tolerância a estresse abiótico) da planta quando cultivada sob altos níveis de concentração de salinidade em comparação com as plantas de controle. Os resultados mostraram que os genes também aprimoraram a performance da planta sob condições de sem salinidade.

[00406] As Tabelas 53, 54 e 55 descrevem as análises de performance da planta (área de folhas e raiz) sob condições normais (0 mM NaCl) ou de alta salinidade (150 mM NaCl) em plantas que superexpressam os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S). A avaliação de cada gene foi feita testando- se a performance de vários eventos. Alguns dos genes foram avaliados em mais de um ensaio de cultura de tecido e os resultados obtidos foram repetidos. O evento com valor p <0,1 foi considerado estatisticamente significativo. Tabela 53 Plantas transgênicas que expressem de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem performance aprimorada (área de folhas e raízes da planta) sob condições normais (padrão)

[00407] Tabela 53: As análises de performance da planta (área de folhas e razies) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob condições padrão (0 mM NaCl) em comparação com as plantas de controle. Tabela 54 Plantas transgênicas que expressem de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem performance aprimorada (área das folhas) sob estresse de salinidade

[00408] Tabela 54: As análises de performance da planta (área das folhas) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob condições de salinidade (150 mM NaCl) em comparação com as plantas de controle. Tabela 55 Plantas transgênicas que expressem de forma exógena os polinucleotídeos de algumas configurações da invenção exibem performance aprimorada (área da raiz) sob condições de salinidade

[00409] Tabela 55: As análises de performance da planta (roots área) de plantas transgênicas que superexpressam os polinucleotídeos exógenos de algumas configurações da invenção (usando os genes clonados ou sintéticos listados na Tabela 23 acima) sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) quando cultivada sob condições de salinidade (150 mM NaCl) em comparação com as plantas de controle.

[00410] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com configurações específicas da mesma, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações possíveis serão evidentes àqueles que possuem perícia na técnica. Da mesma forma, pretende-se aqui abarcar todas as alternativas, modificações e variações que estejam dentro do princípio e do amplo escopo das reivindicações anexadas.

[00411] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesta especificação são a este incorporados em sua totalidade por meio de referência à especificação, como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse indicado específica e individualmente para ser a este incorporada por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência neste pedido não deve ser interpretada como uma admissão de que tal referência esteja disponível como técnica anterior à presente invenção. Os cabeçalhos das seções que foram utilizados não devem ser interpretados como delimitação do escopo.

Claims (8)

1. Método para aumentar a eficiência de uso do nitrogênio, eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa e/ou tolerância ao estresse por deficiência de nutriente de uma planta, o método sendo caracterizado pelo fato de superexpressar dentro da planta um polinucleotídeo tendo uma sequência de ácidos nucleicos como estabelecida pelas: (i) SEQ ID NO: 2469 ou 74, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 211, ou suas sequências degeneradas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 211, ou (ii) SEQ ID NO: 739, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 1803, ou suas sequências degeneradas que codificam o referido polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 1803, aumentando, por meio disto, a eficiência de uso do nitrogênio, eficiência de uso de fertilizantes, produção, taxa de crescimento, vigor, biomassa e/ou tolerância ao estresse por deficiência de nutriente da planta.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado ainda pela seleção da referida planta que superexpressa o referido polinucleotídeo para uma maior eficiência de uso de nitrogênio, eficiência de uso de fertilizantes, rendimento, taxa de crescimento, vigor, biomassa e/ou tolerância ao estresse por deficiência de nutrientes em comparação com uma planta controle da mesma espécie que é cultivada nas mesmas condições de crescimento.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico é estabelecida pela SEQ ID NO: 2469, 74 ou 739.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico é conforme estabelecida pela SEQ ID NO: 2469 ou 74, que codifica o polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 211, ou sequências degeneradas das mesmas que codificam o dito polipeptídeo estabelecido pela SEQ ID NO: 211.

5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de a sequência de ácido nucleico é conforme estabelecida pela SEQ ID NO: 2469 ou 74.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 5, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo está operacionalmente ligado a um promotor de planta heterólogo para direcionar a transcrição da referida sequência de ácido nucleico na referida planta.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, sendo caracterizado ainda por crescer a planta que superexpressa o dito polinucleotídeo sob estresse por deficiência de nutriente.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a referida deficiência de nutrientes é deficiência de nitrogênio.

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