CN105399804B - 与水稻粒型和叶夹角相关的蛋白及其编码基因的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与水稻粒型和叶夹角相关的蛋白及其编码基因的应用。本发明将一种与水稻粒型和叶夹角相关的蛋白的编码基因通过重组载体导入正常的植物中，可以得到粒型和叶夹角发生变化的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于谷物粒型和株型的遗传改良。

Description

与水稻粒型和叶夹角相关的蛋白及其编码基因的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及与水稻粒型和叶夹角相关的蛋白及其编码基因的应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球一半以上人口以水稻为主食和热量来源。随着世界人口的不断增长和耕地面积的持续减少，粮食危机日益严重，提高粮食产量已成为水稻育种研究中的一大挑战。水稻产量是一个复杂的性状，主要由单株穗数、穗粒数和粒重等因素决定。水稻粒型主要包括粒长、粒宽和粒厚三个组分，是影响粒重的关键因素之一，在灌浆程度理想的状态下，粒型直接决定着水稻的粒重，一般来说，籽粒长度越长，宽度越宽，厚度越厚，籽粒就越重。另外，粒型还影响着水稻籽粒的外观品质、加工品质和蒸煮食味品质，人们对水稻籽粒形状的要求在世界各地差异很大。在法国、美国及欧洲，人们偏爱细长稻米；印度和亚洲的人们青睐长粒稻米；东南亚地区的人们则喜爱中等长度的稻米；而温带地区的人们更喜欢短粒而圆形稻米。水稻粒型是一个复合的外观品质性状，包括粒长、粒宽以及粒厚，它们分别受到不同主效及一些微效核基因的控制。而且，粒型虽然作为数量性状易受到环境条件的影响，但是具有较大的遗传力。这两个因素为水稻研究者成功分离和克隆不同的粒型基因提供了重要的理论基础。目前，水稻粒型的遗传研究取得了较大的进展，从细胞遗传学水平发展到了分子遗传学水平，研究者们通过构建QTL定位分离群体，进行物理和化学方法诱变获得突变体，以及运用T‐DNA插入技术获得水稻突变体；并进行基因克隆，报道了许多影响水稻粒型的QTL和基因，并且证明了调控水稻粒型的一些主要因素或途径，其中主要包括了植物发育和代谢途径、植物激素途径及表观遗传学途径等。
同时，水稻株型的改良对产量的提高也起着至关重要的作用，并一直被水稻育种家和遗传学家所关注。在影响株型的许多因素中，水稻的叶夹角起着非常重要的作用，研究表明直立叶可以增加光合作用效率和籽粒灌浆过程中氮的储备，有利于植株的密植，从而提高产量；并且已有报道表明水稻直立叶株型能够增加水稻的生物量和籽粒产量。叶枕连接了叶片和叶鞘，叶枕对叶片从主轴的水平弯曲起到了非常显著的影响，并且任何能使叶枕异常生长发育的因素都会导致叶夹角的改变。研究发现大多数已经被鉴定的水稻叶夹角改变的突变体，其叶夹角的增大或减小都是由于叶枕近轴端细胞异常分化和伸展引起的，证明了叶枕的生长发育在叶夹角形成过程中的重要性。大多数被鉴定的水稻叶夹角相关突变体与植物激素的合成和信号密切相关，特别是BR的合成和信号。另外，还存在一些调控叶夹角的非激素相关途径的基因。
因此，发掘和克隆新的调控水稻粒型和叶夹角的基因，研究这些基因的功能，对进一步提高水稻产量具有重要的理论指导意义。
发明内容
本发明的目的是提供与水稻粒型和叶夹角相关的蛋白及其编码基因的应用。
粒型和叶夹角相关的蛋白SLG在改造水稻粒型和株型的育种中的应用，其中，所述的蛋白SLG来自水稻品种日本晴，是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷蛋白分选相关的由序列2衍生的蛋白质。
SEQ ID NO.1所示的序列由445个氨基酸残基组成，自氨基末端第13至439位为酰基转移酶结构域。
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的SLG的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
基因SLG在改造水稻粒型和株型的育种中的应用，其中，基因SLG为上述蛋白SLG的编码基因，可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：
1)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
2)SEQ ID NO.3所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码造粉体发育相关蛋白的DNA分子。
SEQ ID NO.2由1338个核苷酸组成。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有所述的基因SLG的重组表达载体在改造水稻粒型和株型的育种中的应用。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体可为在pCUbi1390载体的多克隆位点KpnI和SpeI之间插入所述基因(SLG)得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为pCUbi1390-SLG；所述pCUbi1390-SLG是将由SLGcDNA片段通过双酶切双连接技术插入到pCUbi1390多克隆位点KpnI和SpeI之间得到的。
将含有SLG的pCUbi1390命名为pCUbi1390-SLG。
本发明的另一个目的是提供一种培育粒型和叶夹角发生变化的转基因植物的方法。
本发明提供的培育粒型和叶夹角发生变化的转基因植物的方法，是将所述基因导入正常的植物中，得到粒型和叶夹角发生变化的转基因植物；所述正常植物为粒型和叶夹角正常的植物；所述粒型和叶夹角发生变化的转基因植物为籽粒长度增加、宽度减小，叶夹角增大的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入正植物中；所述粒型和叶夹角发生变化的植物可为SLG。
所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。
有益效果：
本发明将一种与水稻粒型和叶夹角相关的蛋白的编码基因通过重组载体导入正常的植物中，可以得到粒型和叶夹角发生变化的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于谷物粒型和株型的遗传改良。
附图说明
图1为野生型Dongjin和突变体slg-D的籽粒以及叶夹角形态观察。
A和B，野生型和突变体在营养生长期(A)和收获期(B)的整体植株形态。C，野生型和突变体籽粒形态。D，粒长统计。E，粒宽统计。F，千粒重统计。G，剑叶(1)、第二叶(2)、第三叶(3)及第四叶(4)的叶夹角比较(从剑叶往下数)。H，剑叶夹角统计。D、E、F和H中的数值表示平均值和方差；**表示极显著水平(P<0.01)；比例尺分别为10cm(A、B)、2mm(C)及2cm(G)。
图2为野生型Dongjin和突变体slg-D颖壳和叶枕处细胞水平观察。
A，抽穗前小穗。B和C，野生型(B)和突变体(C)外颖外表皮细胞的扫描电镜观察。D和E，野生型(D)和突变体(E)外颖内表皮细胞的扫描电镜观察。F和G，外颖内表皮细胞的平均细胞长度(F)和宽度(G)H，第二叶叶枕(从剑叶往下数)；ad，近轴端；ab，远轴端。I和J，野生型(I)和突变体(J)的第二叶枕远轴端纵切面。K，(I)和(J)中细胞平均长度。L和M，野生型(L)和突变体(M)的第二叶枕近轴端纵切面。N，(L)和(M)中细胞平均长度。F、G、K和N中的数值表示平均值和方差；*和**分别表示显著水平(P<0.05)和极显著水平(P<0.01)；比例尺分别为2mm(A)、50μm(B、C、D、E)、2cm(H)及100μm(I、J、L、M)。
图3为slg-D的T-DNA插入位点及共分离分析。
A，slg-D突变体的T-DNA插入位点。T-DNA上的四个拷贝的35S增强子用红色箭头表示，白色框表示内含子；P1、P2和P3表示用于基因型分型的引物；RB和LB表示分别表示T-DNA的右边界和左边界。B，T-DNA插入位点的PCR检测。C，F2群体中表型和T-DNA插入基因型的共分离鉴定。1-24是slg-D和其野生型杂交F2代的24个单株；N，正常表型；I，中间表型；M，突变体表型。D，T-DNA插入位点附近基因表达量的实时定量PCR分析。820、830和840分别表示基因Loc_Os08g44820、Loc_Os08g44830和Loc_Os08g44840；数值表示三次生物学重复的平均值和方差，**表示极显著水平(P<0.01)。
图4为转pCUbi1390-SLG的T1籽粒和株型表型。
A，在野生型背景下pCUbi1390-SLG转基因植株的整体表型。OE2、OE6和OE12是三个单独的转基因家系；比例尺为10cm。B，(A)图中植株对应的籽粒表型。比例尺为2mm。C和D，粒长(C)和粒宽(D)统计。E，SLG的表达量水平。C、D和E中的数值表示平均值和方差，**表示极显著水平(P<0.01)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、水稻粒型和叶夹角相关突变体slg-D的表型分析
在一个带有增强子激活标签的T-DNA插入突变体库中筛选出粒型和叶夹角相关的突变体slg-D。
与野生型比较，slg-D的主要特征是在营养生长期和成熟收获期株型松散(图1A,B)、籽粒粒长增加、粒宽减小，千粒重减小(图1C-F)，叶夹角增大(图1G,H)。种子颖壳外颖的内外表皮细胞的扫描电镜观察结果表明slg-D籽粒粒长增加和粒宽减小分别是由于细胞长度增加和宽度减小引起的(图2A-G)；叶枕纵切面的光学显微镜观察结果表明slg-D叶夹角增大是由于叶枕近轴端细胞纵向长度增加造成的(图2H-N)。
综上所述，在突变体slg-D中由于细胞大小的改变，导致籽粒细长和叶夹角增大表型。实施例2、SLG的克隆和转基因验证
1、T-DNA插入位点的鉴定
为了分离slg-D突变体的突变基因，首先搜索了T-DNA插入突变体库中该突变体编号的侧翼序列，并设计了三条引物：P1、P2、和P3(表1)，它们的位置如图3A所示，PCR扩增显示，基因组引物P1+P2在野生型中能扩增出目的条带，而在slg-D突变体中扩不出条带，并且，基因组载体组合引物P2+P3在slg-D突变体中能扩增出目的条带，而在野生型中不能扩增出条带(图3A，B)，证明了该T-DNA插入位置的真实性，进一步对扩增片段测序，并通过在水稻基因组计划数据库(Rice Genome Annotation Project Database，http:// rice.plantbiology.msu.edu/)中对T-DNA插入位点附近基因进行预测，结果表明该T-DNA插在了基因Loc_Os08g44840下游大约距离终止密码子4500bp的位置，该T-DNA插入位点附近存在三个基因：Loc_Os08g44820、Loc_Os08g44830及Loc_Os08g44840(图3A)。
2、T-DNA标签与slg-D突变体表型的共分离验证
利用slg-D与野生型配置的Donjin/slg-DF2代群体进一步验证了slg-D的T-DNA标签与突变表型的共分离情况，结果显示，在所有的F2代正常表型植株中只能扩增出基因组引物P1+P2的条带，且在所有的F2代中间型表型植株中既能扩增出P1+P2的条带也能扩增出基因组载体组合引物P2+P3的条带，以及在所有的F2代突变表型植株中只能扩增出P2+P3的条带(图3C)，由于该突变是半显性遗传，这就证明slg-D的T-DNA标签与突变表型是共分离的，即slg-D突变体的表型是由于T-DNA插入引起的。
3、T-DNA插入位点附近基因的表达量分析
接着，由于该T-DNA载体带有一个4个拷贝的35S增强子标签，很可能会增强T-DNA插入位点附近基因的表达，所以对野生型和slg-D中T-DNA插入位点附近三个基因做了表达水平的定量检测，定量引物见表1，结果表明，相比于野生型，在slg-D突变体中，Loc_Os08g44830和Loc_Os08g44840这两个基因的表达量显著增加，而Loc_Os08g44820的表达量没有变化(图3D)。
4、SLG的转基因验证
为了确定slg-D的突变表型是否是由Loc_Os08g44830或者Loc_Os08g44840在突变体中的过量表达所引起，将这两个基因的全长CDS装载到过表达载体pCUbi1390上而得到这两个基因的过表达载体，构建载体引物见表1，再通过农杆菌介导法将这两个载体转入野生型愈伤中，利用PCR扩增及表达量检测对T1代进行阳性鉴定，我们发现Loc_Os08g44840的过表达植株表现出不同程度的细长籽粒及叶夹角增大表型(图4)，重复出了slg-D突变体的表型，并且表型变化的程度是和Loc_Os08g44840过表达的表达量高低是显著相关的，而Loc_Os08g44830的过表达植株的粒型和叶夹角没有发生改变，这些结果表明slg-D突变体的表型是由于Loc_Os08g44840的过表达导致的，因此我们将Loc_Os08g44840命名为SLG。
表1引物列表
上述涉及的实验方法如下所述：
1、植物总DNA的提取—SDS法
(1)取1-2g新鲜水稻叶片，用剪刀均匀剪入2mL离心管中，加入钢珠，将离心管放入液氮中冷冻后再用震荡粉碎机将叶片打成粉末状，迅速将钢珠倒出，往离心管中加入600μLSDS提取液，摇匀，65℃水浴30min，期间上下混匀1-2次；
(2)加入150μL 5M KAC，摇匀后置于冰上30min；
(3)加入600μL氯仿-异戊醇(24:1)，150rpm摇30min；
(4)12000rpm离心5min，吸取200μL上清液至另一1.5mL离心管中，加入400μL预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃冰箱中30min；
(5)12000rpm离心5min，弃上清，加入500μL 70％乙醇洗涤沉淀，再12000rpm离心5min，弃上清，在超净工作台上风干；
(6)加入200μL ddH2O溶解DNA，电泳检测完整性。
2、鉴定引物的设计和T-DNA插入位点的鉴定
(1)查询T-DNA插入突变体库中登陆的侧翼序列，与gramene网站(http://www.gramene.org/)上日本晴的基因组序列比对，可以初步确定T-DNA在基因组上的插入位点；
(2)利用插入位点两侧的基因组序列及插入载体左右边界的DNA载体序列，用Primer Premier 5.0软件设计一对扩增基因组的基因组引物，和一对其中一条引物在基因组上而另一条引物在载体上的基因组载体组合引物，片段大小均为600至2000bp。
(3)分别提取野生型和slg-D突变体植株的DNA，用上述两对引物分别进行扩增。PCR扩增反应体系(20μL)为：2μL DNA，1.6μL dNTP Mixture(2.5mM each)，10μL 2×PrimeSTAR GC Buffer，1μL Primer F，1μL Primer R，0.2μLPrimeSTAR HS DNAPolymerase(2.5U/μl)，4.2μL ddH2O，反应程序为：94℃4min；98℃12s，60℃5s，72℃2min，34个循环；72℃7min。如果基因组引物在野生型中能扩增出目的条带，而在突变体中不能扩增出目的条带，相反，基因组载体组合引物在野生型中不能扩增出目的条带，而在突变体中能扩增出目的条带，则能最终确定T-DNA的插入位点，并且说明突变体中T-DNA确实是插入到了基因组的该位置上。
3、T-DNA标签与slg-D突变体表型的共分离验证：
(1)分别提取Donjin/slg-DF1和F2代群体植株的DNA；
(2)用野生型和突变体植株的DNA作为对照，用F2代植株的DNA作为模板，用设计的基因组引物和基因组载体组合引物，进行PCR扩增。第一种情况，突变体是一单基因控制的隐性突变体，如果在F2代正常表型植株中有的只能扩增出基因组引物的条带，有的既能扩增出基因组引物的条带也能扩增出基因组载体组合引物的条带，且在所有的F2代突变表型植株中只能扩增出基因组载体组合引物的条带，而不能扩增出基因组引物的条带，则说明T-DNA标签与突变体的表型是共分离的；第二中情况，突变体是一单基因控制的显性突变体，如果在所有的F2代正常表型植株中只能扩增出基因组引物的条带，且在F2代突变表型植株中有的只能扩增出基因组载体组合引物的条带，有的既能扩增出基因组引物的条带也能扩增出基因组载体组合引物的条带，则说明T-DNA标签与突变体的表型是共分离的；第三种情况，突变体是一单基因控制的半显性突变体，如果在所有的F2代正常表型植株中只能扩增出基因组引物的条带，且在所有的F2代中间型表型植株中既能扩增出基因组引物的条带也能扩增出基因组载体组合引物的条带，以及在所有的F2代突变表型植株中只能扩增出基因组载体组合引物的条带，则说明T-DNA标签与突变体的表型是共分离的，即突变体的表型是由于T-DNA插入引起的。
4、RNA提取、RT-PCR和Real-Time PCR
RNA提取：
组织从野生型和slg-D植株上取下后立即放入液氮中速冻，使用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒(天根公司)提取RNA，按照试剂盒提供的RNA提取方法进行提取，具体方法步骤如下：
(1)取200mg左右组织样品用液氮充分研磨后装入2mL RNAase-free离心管中，加入500μL裂解液，加入5μL的β-巯基乙醇，涡旋震荡充分混匀；
(2)12000rpm离心2min，将所有上清溶液转移至过滤柱CS上，12000rpm离心5min，小心吸取收集管中的上清至一新的1.5mL RNase-Free的离心管中；
(3)加入一半上清体积(约230μL)的无水乙醇，充分混匀后转移到吸附柱CR3中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
(4)向CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
(5)DNase I工作液的配制方法：吸10μl DNase I储存液到一新的RNase-Free离心管中，加入70μl RDD，轻柔混匀；
(6)向CR3中央加入上述配置好的80μl DNase I工作液，室温静置15min；
(7)重复步骤(4)；
(8)向CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
(9)重复步骤(8)；
(10)12000rpm离心2min，室温静置6-8min，以晾干漂洗液；
(11)将CR3放入一个新的1.5mL RNase-Free离心管中，向CR3吸附膜中央悬空滴加60μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min，-80℃保存RNA溶液备用；
(12)使用Nanodrop分光光度计检测RNA的浓度及纯度，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
RT-PCR：
选用 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)反转获得cDNA，具体步骤如下(20μL体系)：
(1)PCR小管中加入1μg总RNA，1μL dNTP Mixture(2.5mM each)，1μL 50mΜ OligodT，用RNase Free ddH2O补到10μL；
(2)65℃5min后，迅速置于冰上冷却2min以上；
(3)加入4μL 5× Buffer，1μL 20U RNase Inhibitor(RRI)，1μL200U RTase，用RNase Free ddH2O补到20μL；
(4)42℃1h，70℃15 min，4℃10min即得到cDNA溶液，-20℃保存待用。
Real-time PCR步骤：
使用SYBR premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)试剂盒，在7500HT Real-time PCRsystem仪器((Applied Biosystems)上反应。反应体系为：0.4μL cDNA模板，10μL 2×SYBRPremixEx Taq II，0.6μL 10μM PCR Forward Primer，0.6μL 10μM PCR Reverse Primer，用ddH2O补足20μL。反应程序采用两步法：(1)95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环；(2)溶解曲线步骤，95℃15s，60℃1min，95℃15s。
用2-△△CT法对Real-time PCR实验的结果进行分析，以水稻Actin基因作为内参。
实施例3、转基因过表达载体的构建及农杆菌转化
转基因过表达载体的构建：
用KpnI和SpeI双酶切pCUbi1390过表达载体，电泳、回收线性载体备用。提取水稻品种Dongjin的植物总mRNA，按照NCBI网站上预测的CDS序列设计引物，在前后引物的5‘端分别加上酶切位点及若干保护碱基，用设计好的引物840-1390 F和840-1390 R扩增mRNA，电泳、回收片段，再用KpnI和SpeI双酶切该片段，电泳、回收被切开片段，利用T4连接酶将片段连接到酶切好的pCUbi1390上，转入大肠杆菌中，测序验证序列正确后，提取质粒转入农杆菌。
大肠杆菌感受态细胞的制备：
(1)挑取保存的大肠杆菌DH5α的LB平板上的单菌落于2mLLB液体培养基中，37℃200rpm培养过夜；
(2)转移上述1mL过夜培养菌液于新的100mL液体LB培养基中，37℃200rpm扩大培养2～3h；
(3)将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min后，4000rpm离心10min，倒出培养液(尽量将培养液吸干净)；
(4)用1mL冰上预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮离心管底的大肠杆菌细胞，置于冰上30min；
(5)4℃4000rpm离心10min，吸掉CaCl2溶液，用0.1mL预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞(冰上操作)，即得到大肠杆菌感受态细胞，将大肠杆菌感受态细胞分装成100μL的小量包装，-80℃保存备用(可保存半年)。
大肠杆菌感受态的转化：
(1)取出-80℃保存的感受态细胞，置于冰上解冻；
(2)加入适量质粒DNA，轻轻摇匀，置于冰上30min；
(3)42℃热激5min后迅速置于冰上冷却2min；
(4)向离心管中加入1ml不含抗生素的LB液体培养基，37℃200rpm培养1h；
(5)将上述培养好的菌液均匀涂于含相应抗生素的筛选LB固体培养平板上，在超净台上吹干后倒置培养皿置于37℃培养箱中培养16-24h。
农杆菌感受态细胞的制备：
(1)取EHA105菌株在含有抗生素利福平的YEP平板上划线，28℃培养箱倒置培养2-3天；
(2)挑取单克隆菌落于1mLYEP液体培养基中，200rpm，28℃培养16h以上；
(3)次日上午转移100μL上述过夜培养的菌液于新鲜配置的100mL液体YEP培养液中，28℃200rpm培养至OD600值约为0.5；
(4)4℃4000rpm离心5min，倒掉培养液；
(5)用2mL提前预冷的20mM CaCl2溶液重悬菌体，分装到预冷的1.5mL离心管内50μL每管，液氮速冻后置于-80℃保存备用。
农杆菌冻融转化法(热激法)：
(1)取出农杆菌感受态，置于冰上解冻；
(2)加入1μL质粒，轻弹混匀后放入液氮5min；
(3)37℃水浴5min，取出迅速插入冰上2min；
(4)加入1mL不含抗生素的YEP培养液，28℃150rpm慢摇2-4h；
(5)将上述培养好的菌液均匀涂于含有抗生素卡那霉素和利福平的YEP固体培养基平板上，28℃倒置培养2-3天。
实施例4、转基因阳性植株的鉴定
首先对转基因T0代植株进行潮霉素浸泡方法的鉴定，方法如下：剪1-2cm转基因植株叶片，浸泡在含有0.1％潮霉素(V/V)的水溶液内，28℃光照培养箱培养3天，阴性植株的叶片边缘会褐化坏死，而阳性植株则没有变化；再次，对抗潮霉素的转基因植株进行PCR方法的检测，提取DNA，设计转入目的基因的特异性引物，进行PCR扩增验证，能扩增出目的条带的为阳性植株；最后，对过表达转基因植株进行表达量的检测，提取RNA，检测目的基因的表达水平，表达量显著高于野生型植株的为阳性植株。对阳性植株的抽穗期株型和成熟期粒型进行拍照，并进行粒长粒宽的测量统计，结果见图4，在野生型背景下pCUbi1390-SLG转基因植株的籽粒粒长增加、粒宽减小，叶夹角增大。

Claims (5)

1.粒型和叶夹角相关的蛋白SLG在改造水稻粒型和株型的育种中的应用，其中，所述的蛋白SLG来自水稻品种日本晴，由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成。
2.基因SLG在改造水稻粒型和株型的育种中的应用，其中，基因SLG可为如下1）或2）的DNA分子：
1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
2）SEQ ID NO.3所示的DNA分子。
3.含有权利要求2中所述的基因SLG的重组表达载体在改造水稻粒型和株型的育种中的应用。
4.含有权利要求2中所述的基因SLG的表达盒、转基因细胞系或重组菌在改造水稻粒型和株型的育种中的应用。
5.培育粒型和叶夹角发生变化的转基因植物的方法，其特征在于是将权利要求2所述基因SLG导入正常的植物中，得到粒型和叶夹角发生变化的转基因植物；所述正常植物为粒型和叶夹角正常的植物；所述粒型和叶夹角发生变化的转基因植物为籽粒长度增加、宽度减小，叶夹角增大的转基因植物。
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