CN103554238A - 一种植物淀粉合成相关蛋白flo6及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物淀粉合成相关蛋白FLO6及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸学列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。本发明的植物淀粉合成相关蛋白影响植物的淀粉合成。该蛋白缺失的突变体材料产生新型特性的淀粉，可用于酿酒等食品工业。将所述蛋白的编码基因导入外观品质差植株中，可以培育外观品质好的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种植物淀粉合成相关蛋白FLO6及其编码基因与应用。
背景技术
淀粉是植物重要的光合产物对人类文明有着举足轻重的作用。平均来说，我们每天所吃的食物有一半含有淀粉，这些食物资源大部分来自水稻和玉米等谷类作物。另外，淀粉还可以从植物体内提取出来用作工业原料。近年来，人们开始利用淀粉生产生物乙醇，这使得含有淀粉的谷类作物有了更重要的用途。
水稻（Oryza sativa L.）是我国最重要的粮食作物之一，淀粉占水稻种子的60-80%，是决定稻米产量和品质的重要因素。因此，对淀粉结构以及影响淀粉合成相关基因的深入研究将为水稻增产、品质改良提供重要的理论基础。长期以来，淀粉合成突变体一直被认为是研究淀粉合成的理想材料。目前，已经报道的淀粉突变体大致分为两类：一类是直接参与淀粉合成的酶类基因突变造成的，另一类是其它功能的基因突变，比如OsPPDKP(磷酸丙酮酸双激酶)，Flo2（编码一个TRP基序）等。这类基因具体处于怎样的调控网络中，如何影响淀粉的合成还有待进一步的研究。
我们实验室通过长期筛选水稻胚乳粉质突变体，希望进一步解释水稻胚乳淀粉合成这一重要的生物学过程。我们从突变体库中找到的一个新的淀粉突变体，命名为flo6（flouryendosperm6），该蛋白定位于质体中，具有结合淀粉的能力，其编码529个氨基酸，该蛋白缺失的突变体将会导致水稻胚乳淀粉合成受阻，产生粉质胚乳的表型。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物淀粉合成相关蛋白及其编码基因与应用。
本发明所提供的植物淀粉合成相关蛋白，来源于稻属水稻（Oryza sativa L.），名称为FLO6，是如下（a）或（b）的蛋白质：
（a）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
（b）将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物淀粉合成相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。
SEQ ID NO.1由529个氨基酸残基组成。
所述一个或数几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
为了使（a）中的FLO6便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6（通常为5个） | RRRRR |
| Poly-His | 2-10（通常为6个） | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述（b）中的FLO6可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的FLO6编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述植物淀粉合成相关蛋白（FLO6）的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述植物淀粉合成相关蛋白（FLO6）的编码基因为如下1）或2）或3）的DNA分子：
1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码所述植物淀粉合成相关蛋白的DNA分子；
3）与SEQ ID NO.2的核苷酸序列具有85％以上的同源性的且编码蛋白具有与淀粉合成相关功能的核苷酸序列。
SEQ ID NO.2由1590个核苷酸组成。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1%SDS的溶液中，在65oC下杂交并洗膜。
含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
含有以上任一所述基因（FLO6）的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。
扩增所述基因（FLO6）全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明所述蛋白FLO6，其编码基因，或含有蛋白FLO6编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物品种改良中的应用，优选在对种子胚乳粉质和/或淀粉含量异常的品种进行改良使其种子胚乳恢复透明和/或淀粉含量恢复正常中的应用。
本发明提供的培育良好外观品质转基因植物的方法，是将所述基因导入外观品质极差植物中，得到透明外观品质好的转基因植物；所述外观品质差的植物为具有粉质不透明籽粒的水稻；所述外观品质好的转基因植物为具有透明籽粒的水稻。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入粉质不透明植物；所述粉质不透明植物可为T643。
所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。
有益效果：
本发明的植物淀粉合成相关蛋白影响植物的淀粉合成过程。将编码该蛋白的基因导入粉质籽粒的水稻可使水稻的籽粒转为透明。该蛋白缺失突变体可导致植物籽粒淀粉含量降低，并影响淀粉的精细结构以及物理化学性质。该突变植物产生特殊物化性质的新型淀粉，因此可以培育含有新型淀粉的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物特别是水稻的遗传改良。
附图说明
图1为突变基因在第3染色体上的精细定位。
图2为野生型日本晴和突变体T643的植株和胚乳外观比较。
其中，a为野生型与突变体植株的表型，b和c分别为野生型日本晴和突变体T643的胚乳外观比较，d和e分别为野生型日本晴和突变体T643的扫描电镜分析比较，d,e中标尺为1mm。
图3为野生型日本晴和突变体T643成熟胚乳扫描电镜分析。
其中，a、c显示为野生型日本晴的电镜观察结果，日本晴中淀粉颗粒排列均一致密。b、d为突变体的淀粉结构，排列松散，淀粉颗粒大小不一。a,b标尺为1mm；c,d为50μm。
图4为野生型日本晴和突变体T643物化性质分析。
其中a为突变体T643和野生型日本晴的支链淀粉链长分布，结果显示突变体籽粒中的淀粉链长分布发生了改变，短链含量变少，中长链含量有所增加。b为突变体T643和野生型日本晴的RVA曲线分析，结果显示突变体的粘稠度几乎不随温度的增加而改变。
图5为野生型日本晴和突变体T643灌浆过程分析。
a图显示水稻开花后灌浆过程中野生型日本晴和突变体T643的籽粒外观对比，DAF（DaysAfter Fertilization）代表水稻种子开花后的灌浆天数，b图显示野生型和突变体的干物质积累，c图显示野生型和突变体的淀粉合成速率。
图6为转基因植株进行PCR分子检测结果。
泳道1为flo6突变体的扩增结果，2-6为转入野生型FLO6基因的转基因家系。
图7为转基因的T1代种子的胚乳观察。
其中，a图为野生型、突变体以及转基因的T1代去壳后种子（S1～S3）胚乳外观表型，b图为突变体和转基因的T1代种子的胚乳电镜观察分析，b中标尺为50μm，S1-S3分别代表了独立的3个转基因家系。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、植物淀粉合成相关蛋白及其编码基因的发现
一、水稻粉质胚乳突变体T643表型分析及其遗传分析
在粳稻品种日本晴（购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库）的突变体库中筛选出粉质胚乳籽粒的水稻植株，经过连续自交纯合后，将其命名为稳定遗传的株系T643（T643水稻）。
与日本晴比较，T643的主要特征是：植株稍显矮小，胚乳呈不透明粉质表型(见图2)。
扫描电镜观察野生型和突变体籽粒，见图3。图3中，a、c显示为野生型日本晴的电镜观察结果，日本晴中淀粉颗粒排列均一致密。b、d为突变体的淀粉结构，排列松散，淀粉颗粒大小不一。
进一步对籽粒物化性质进行测定见图4。图4中，a图显示突变体籽粒中的淀粉链长分布发生了改变，短链含量变少，中长链含量有所增加。同时突变体的食味品质也发生了改变，RVA谱分析结果显示突变体的粘稠度几乎不随温度的增加而改变（图4b）
图5显示野生型和突变体的籽粒灌浆的动态过程，无论从表型和数据来看，突变体的灌浆进程都较野生型迟缓，并且突变体淀粉合成受阻。
用突变体T643与其野生型日本晴杂交，得到T643/日本晴的F2群体种子进行遗传分析，对F2群体中652个个体的遗传分析表明，T643的胚乳粉质表型受1对隐性核基因控制。
二、突变基因定位
1、突变基因初步定位
用日本晴突变体T643与籼稻品种9311杂交，在T643/9311的F2分离群体中随机选取具有粉质胚乳极端个体10粒，将这10粒种子在培养基中发苗，提取DNA。用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物对这10个极端隐形个体及T643和9311进行多态性分析，将粉质胚乳基因FLO6（Floury Endosperm6）定位在第3染色体上标记pc14和RM426之间。
上述SSR标记分析的方法如下所述：
（1）提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：
①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。
②加入660μL提取液（含100mM Tris-Hcl（pH8.0），20mM EDTA（pH8.0），1.4M NaCl,0.2g/mL CTAB的溶液），漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。
③加入40μL20%SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。
④加入100μL5M NaCl，温和混匀。
⑤加入100μL10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。
⑥加入900μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。
⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μL异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。
⑧弃上清液，沉淀用70%（体积百分含量）乙醇漂洗一次，室温凉干。
⑨加入100μL1×TE（121克Tris溶于1升水中，用盐酸调pH值至8.0得到的溶液）溶解DNA。
⑩取2μL电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度（Bechman Instrument Inc.U.S.A）。
（2）将上述提取的DNA稀释成约20ng/μL，作为模板进行PCR扩增；
PCR反应体系(10μL)：DNA(20ng/μL)1μL，上游引物(2pmol/μL)1μL，下游引物(2pmol/μL)1μL，10×Buffer(MgCl2free)1μL，dNTPs(10mM)0.2μL，MgCl2(25mM)0.6μL，rTaq(5u/μL)0.1μL，ddH2O5.1μL，共10μL。
PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在BiometroT热循环仪中进行。
（3）SSR标记的PCR产物检测
扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。
2、突变基因精细定位
根据初步定位的结果，在突变基因所在区域附近进一步自行开发SSR标记。用F2群体中的粉质胚乳单株验证，在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变体基因。从T643/9311衍生的F2分离群体中挑出确认为粉质胚乳单株317株（F2群体中的突变体表型的水稻植株）用于突变基因精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR分子标记对突变基因进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变基因，具体方法如下：
（1）SSR标记开发
将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter（李强等，遗传，2005，27(5):808-810）或SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列（重复次数≥6）；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier5.0软件设计SSR引物,并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在T643和9311之间的多态性，表现多态者用作精细定位FLO6基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表1。
表1用于精细定位的分子标记
通过扩大群体增加标记最终把FLO6基因精细定位在标记pc18和pc11之间，这两个标记位于同一BAC克隆OSJNBb0024N19上，物理距离约为23kb（图1）。
(3）突变基因的获得
根据定位的位点设计引物，序列如下所述：
引物1(下划线所示的序列为attB1重组位点)：
5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCAAGTGCAAAGTTACCGGC-3'（SEQ ID NO.4）；
引物2(下划线所示的序列为attB2重组位点)：
5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGCCCAACCCATCGCGTTTC-3'（SEQ ID NO.5）。
以引物1和引物2为引物，提取日本晴胚乳RNA，并反转录，以反转录产物为模版，进行PCR扩增获得目的基因。扩增产物包含了该基因的全长cDNA，但不包含序列启动子部分。
扩增反应在Biometro T PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃10min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后经过一次BP重组克隆到载体pDONR-207(购自美国Invitrogen公司)中构建成一个GatewayTM入门载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（北京Tiangen公司CB101），挑选阳性克隆后，进行测序。
序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，编码529个氨基酸残基组成的蛋白质（见SEQ ID NO.1）。将SEQ ID NO.1所示的蛋白命名为FLO6（即为基因定位中所述的FLO6基因），将SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因命名FLO6。FLO6的编码序列如序列表的SEQ ID NO.2所示。
实施例2、转基因植物的获得和鉴定
一、含有FLO6编码区cDNA表达载体构建
用BamHI和SpeI双酶切潮霉素抗性表达载体pCUbi1390(中国农科院生物所路铁钢研究员提供；中国农科院博士论文，彭昊，2005)，回收载体片段，备用；以PCR介导，以日本晴（购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库）的cDNA为模板，进行PCR扩增获得FLO6基因cDNA序列，并在FLO6基因cDNA序列两端分别加入酶切位点接头酶切接入pCUbi1390载体，测序确认。
PCR引物序列如下：
引物3(下划线所示的序列为BamHI酶切位点)：
5'-CGGGATCCATGCTCCCCCTCCTCCTC-3'（SEQ ID NO.6）；
引物4(下划线所示的序列为SpeI酶切位点)：
5'-GGACTAGTTCAAGTGACAGTCAGAA-3'（SEQ ID NO.7）。
二、农杆菌介导转化
以农杆菌菌株EHA105（购自美国Invitrogen公司）为介导，将上述构建的FLO6基因载体导入粉质突变体T643中。
（1）28℃培养含FLO6质粒的农杆菌16hr，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L的N6液体培养基中至浓度为OD600≈0.5，获得菌液；
（2）将培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与上述菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基（N6固体共培养培养基，Sigma公司购买）中，24℃共培养3天；
（3）将上述愈伤接种在含有150mg/L潮霉素B（Sigma公司购买）的N6固体筛选培养基上第一次筛选16天；
（4）挑取健康愈伤转入200mg/L潮霉素B的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；
（5）挑取抗性愈伤转入含有150mg/L潮霉素B的分化培养基上分化；
（6）分化成苗的再生水稻植株即为所获得的FLO6基因的转基因植株。
三、转基因植株的鉴定
分别将T0代转FLO6植株，flo6突变体和日本晴种植在南京农业大学转基因作物试验网室内。水稻植株灌浆结束后，取叶片，提取基因组DNA,以基因组DNA为模板，利用引物5和引物6为引物对进行扩增（引物5：GGTTGGACGGGATGCT（SEQ ID NO.8）和引物6：TGTATGAAGAGCGGCAGTAAG（SEQ ID NO.9））。PCR反应体系：DNA(20ng/μL)2μL，引物5(10pmol/μl)2μL，引物6(10pmol/μl)2μL，10xBuffer(MgCl2free)2μL，dNTP(10mM)0.4μL，MgCl2(25mM)1.2μL，rTaq(5u/μL)0.4μL，ddH2O10μL，总体积20μL。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。
用试剂盒（北京Tiangen公司）纯化回收PCR产物。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测。结果表明获得5株PCR检测阳性的植株。见图6，图6中泳道1为未转入野生型FLO6基因的突变体，泳道2-6为转化获得的5株转入野生型FLO6基因植株。
待水稻灌浆结束后，分单株收取各植株籽粒，去壳后观察各植株种子胚乳外观表型。
结果表明，所有PCR鉴定阳性的转基因水稻植株其表型由转基因前的纯和粉质胚乳外观表型恢复成T1代（T0代获得的种子）出现正常透明外观品质种子的杂合表型（图7a），对T1代中透明种子进行潮霉素发芽实验，发现全部抗潮霉素并能正常生长，而对T1代种子中粉质胚乳种子进行潮霉素发芽实验，发现均不抗潮霉素不能萌发，进一步对T1代阳性透明种子进行电镜观察发现，转基因后淀粉颗粒排列结构恢复成与野生型一致的质密结构。验证了转基因前的粉质胚乳表型是由FLO6基因控制的，即该FLO6基因为淀粉合成相关基因（图7）。
Claims (10)
1.一种植物淀粉合成相关蛋白FLO6，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在pCUbi1390载体的酶切位点BamHI和SpeI之间插入权利要求2或3所述基因得到的重组质粒。
6.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其编码区的引物对。
7.权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因，权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物品种遗传改良中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因，权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在对种子胚乳粉质和/或淀粉含量异常的品种进行改良使其种子胚乳恢复透明和/或淀粉含量恢复正常中的应用。
9.一种培育提高外观品质转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入外观品质差的植物中，得到外观品质好的转基因植物；所述外观品质差的植物为产生籽粒不透明的植物；所述外观品质好的转基因植物为籽粒透明的转基因植物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述外观品质差植物中；所述外观品质差的植物为权利要求2或3所述基因发生突变的植物。
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