CN114149999B

CN114149999B - 一种玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1及其应用

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Publication number: CN114149999B
Application number: CN202111540381.9A
Authority: CN
Inventors: 武健东; 于伟; 陈逸蓉; 陈龙; 杜明; 王龙
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2021-12-16
Filing date: 2021-12-16
Publication date: 2023-11-17
Anticipated expiration: 2041-12-16
Also published as: CN114149999A

Abstract

本发明公开了一种玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1及其应用，涉及基因工程技术领域，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。ZmSSP1是一个定位于质体的新基因，过量表达该基因可以提高玉米籽粒淀粉的含量和籽粒的千粒重，而敲除该基因可以降低玉米籽粒淀粉的含量和籽粒的千粒重，说明ZmSSP1基因对淀粉表达起正调控作用。该基因的发现为玉米籽粒品质和产量的交叉代谢调控提供了一个新的功能基因，为解析玉米籽粒淀粉调控途径提供了一种新理论，对作物的遗传改良和培育优质高产的玉米材料具有重要的理论和实践指导意义；本发明产生的材料为优质高产的玉米育种提供新种质资源。

Description

一种玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1及其应用。

背景技术

玉米(ZeamaysL.)是我国和世界上重要的粮食、饲料和工业原料兼用作物。虽然我国玉米播种面积和总产量均超过水稻，成为第一大粮食作物。然而受到玉米生产、加工成本高，高产优质玉米品种资源缺乏等因素影响，导致我国每年的玉米进口量仍然逐年增加。淀粉作为玉米籽粒的主要储存物质，约占籽粒干重的70％，直接影响玉米的产量和品质。据统计，玉米淀粉约占淀粉年产量的80％以上，而且玉米淀粉具有化学成分佳、纯度高、营养丰富等特点。因此提高玉米淀粉含量具有重要的经济价值和社会效益。

淀粉根据其结构可以分为直链淀粉(Amylose)和支链淀粉(Amylopectin)，直链淀粉约占总淀粉的25％，支链淀粉约为75％。如何调节和改善淀粉的合成，需要深入开展对淀粉生物代谢途径的研究。另外，籽粒增重的过程主要是淀粉的合成和积累过程，不断改良玉米淀粉含量可以实现“以质增重”。淀粉的合成途径已经比较清晰，主要由 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPas)、颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(SDBE)等关键酶控制。在玉米中，编码这些关键酶的基因大约有30个，目前多数基因已被克隆，且通过控制这些基因的表达，能调控淀粉含量和籽粒的大小。玉米wx(waxy，编码GBSS酶)，缺少wx功能的胚乳淀粉主要由支链淀粉组成，wx突变体也被广泛用于产生高支链淀粉的分子育种中；玉米SH2(shrunken2)和BT2(brittle2)分别编码种子胚乳AGPase的大、小亚基，在过表达BT2或SH2玉米转基因植株中，其谷粒重量和淀粉的含量提高；SS、SBE及DBE主要与淀粉的结构和支链淀粉的合成有关。

随着玉米籽粒淀粉合成途径和编码基因功能的明确，越来越多的研究集中于玉米籽粒淀粉的调控基因挖掘和解析上。近年来许多研究报道了转录因子在淀粉合成过程中的调控作用。RNA干涉玉米Dof3基因导致淀粉含量的下降和籽粒发育的异常，而过表达该基因的转基因玉米籽粒淀粉含量明显提高；转录因子ZmbZIP22和ZmMADS1a也被报道参与到玉米籽粒淀粉合成的调控途径。这些转录因子多数是通过改变淀粉合成关键基因的转录水平来调控淀粉的合成和籽粒的发育。而关于淀粉合成在蛋白水平上的调控功能基因知之甚少，调控的分子机理如何，这些问题仍不清楚。因此，提出一种玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1及其应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1及其应用。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供了一种玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，全长1626bp，共编码542个氨基酸。

本发明还提供了一种上述玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1在调节玉米籽粒淀粉含量与结构中的应用，所述基因ZmSSP1对淀粉的合成起正调控作用，其过量表达植株籽粒中总淀粉、直连淀粉、支链淀粉含量提高，而Crispr/Cas9敲除突变体中总淀粉、直连淀粉、支链淀粉含量下降。

本发明还提供了一种上述玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1在调节玉米籽粒大小和千粒重中的应用，所述基因ZmSSP1对籽粒的大小起正调控作用，其过量表达可提高籽粒的厚度和千粒重，而Crispr/Cas9敲除突变体中籽粒的厚度和千粒重降低。

本发明还提供了一种上述玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1在在调节玉米籽粒蛋白含量中的应用，所述基因ZmSSP1对籽粒的蛋白合成起负调控作用，Crispr/Cas9敲除突变体中籽粒总蛋白和醇溶蛋白含量提高。

进一步改进在于，所述蛋白包括籽粒总蛋白和醇溶蛋白。

本发明还提供了一种上述玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1的编码蛋白，该编码蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体为通过在pEASY-T1载体上插入上述玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1获得。

本发明还提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞为含有上述重组载体的大肠杆菌感受态Trans5α细胞。

本发明还提供了一种过量表达载体，所述过量表达载体为通过在pZZ00005质粒上转入上述玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1获得，具体为pZZ00005-ZmSSP1过量表达载体。

本发明还提供了一种敲除突变体载体，所述敲除突变体载体为将上述基因ZmSSP1中敲除sgRNA靶位点TGGTGGCAGGCATATTCCAAGGG后克隆到pZmU6-6载体上获得，具体为pZmU6-6-ZmSSP1。

本发明提具有如下有益效果：

ZmSSP1是一个定位于质体的新基因，ZmSSP1蛋白定位于质体中，基因ZmSSP1 在胚乳和花粉中高表达，过量表达该基因可以提高玉米籽粒淀粉的含量和籽粒的千粒重，而敲除该基因可以降低玉米籽粒淀粉的含量和籽粒的千粒重，说明ZmSSP1基因对淀粉表达起正调控作用。该基因的发现为玉米籽粒品质和产量的交叉代谢调控提供了一个新的功能基因，为解析玉米籽粒淀粉调控途径提供了一种新理论，对作物的遗传改良和培育优质高产的玉米材料具有重要的理论和实践指导意义；本发明产生的材料为优质高产的玉米育种提供新种质资源。

附图说明

图1为ZmSSP1基因不同玉米组织表达模式分析结果柱状图；横坐标1-12分别为授粉后5天胚乳、10天胚乳、15天胚乳、20天胚乳、25天胚乳、30天胚乳、35天胚乳、 40天胚乳、三叶期根、三叶期茎、三叶期叶和花粉；

图2为ZmSSP1蛋白在玉米原生质体中的亚细胞定位图；

图3为转基因玉米植株中ZmSSP1基因的表达检测图；WT:玉米Xiang249自交； KO-1，KO-2，KO-3为Crispr/Cas9敲除突变体转基因株系；OE-1，OE-2，OE-3为过表达转基因株系；

图4为ZmSSP1基因转基因植株和野生型植株籽粒厚度和千粒重测定结果，其中图4A为玉米籽粒大小对比图，图4B为厚度测定结果柱状图；图4C为千粒重测定结果柱状图； WT为野生型植株，KO-1，KO-2为Crispr/Cas9敲除突变体转基因株系；OE-1，OE-2为过表达转基因株系；

图5为ZmSSP1基因过表达植株、ZmSSP1基因敲除突变体植株和野生型植株籽粒总淀粉、直链淀粉和支链淀粉含量柱状图；其中图5A为总淀粉含量柱状图，图5B为直链淀粉含量柱状图，图5C为支链淀粉含量柱状图；WT为野生型植株，KO-1，KO-2 为Crispr/Cas9敲除突变体转基因株系；OE-1，OE-2为过表达转基因株系；

图6为ZmSSP1基因过表达植株、ZmSSP1基因敲除突变体植株和野生型植株籽粒扫描电镜图；A为bar为50μm下的扫描电镜图，B为bar为20μm下的扫描电镜图，C 为bar为10μm下的扫描电镜图。其中WT为野生型植株，KO-1，KO-2为Crispr/Cas9 敲除突变体转基因株系；OE-1，OE-2为过表达转基因株系。

图7为ZmSSP1基因过表达植株、ZmSSP1基因敲除突变体植株和野生型植株籽粒蛋白含量测定图；图7A为蛋白电泳图，α19、α22、β14、γ27、γ16等为不同类型的醇溶蛋白；图7B为总蛋白、醇溶蛋白、非醇溶蛋白含量的测定；其中WT为野生型植株， KO-1，KO-2为Crispr/Cas9敲除突变体转基因株系；OE-1，OE-2为过表达转基因株系。

具体实施方式

下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

2、方法

2.1ZmSSP1基因不同组织表达模式分析

取玉米根、茎、叶、5天胚乳、10天胚乳、15天胚乳、20天胚乳、25天胚乳、30 天胚乳、35天胚乳、40天胚乳、三叶期根、三叶期茎、三叶期叶和花粉，每个样取完后，迅速放入液氮速冻，然后冻存于-70℃冰箱，用于后期RNA时提取使用。RNA的提取步骤参考E.Z.N.A.TMMagSi植物RNA提取试剂盒和使用核酸自动提取仪。

ZmSSP1基因荧光定量PCR引物为：(F：CGTGTATTACCGTGGTGATCTA；

R:GTGAGCATCCCCTCGATTC)；以α-qTubulin(F：AGGCTTGTCTCCCAGGTCATC； R:GTTGGTCTGGAACTCGTTCACA)作为内参基因，定量反应使用的是Roche定量试剂盒，反应体系为25μL，各组分为染料混合液9.5μL，cDNA模板为2μL，上下游引物各(10μmol/L)各0.5μL，最后补去离子水至25μL。PCR反应参数如下：95℃，10min； 95℃，15s；60℃，1min，共40个循环。反应结束后，对产物进行加热，获得产物的溶解曲线。采用2^–ΔΔCT[ΔCT＝CT_目标基因–CT_内参基因.ΔΔCT＝ΔCT_处理后–ΔCT_对照]法进行数据处理。

测定三次生物学重复，至少三次实验操作重复，测定结果见图1所示，图中可以看出，ZmSSP1基因主要在不同发育胚乳和花粉中表达。

2.2ZmSSP1基因的克隆

选取玉米B73品种授粉后15天的籽粒胚乳，提取玉米胚乳RNA并反转录成cDNA，以玉米胚乳cDNA为模板，根据玉米B73基因组数据库公布的基因序列，结合克隆载体的多克隆位点设计引物，进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。

引物序列为：

ZmSSP1-F：5′-GGGGTACCATGCCCCCACTCGTCCCCT-3′

ZmSSP1-R：5′-CGGGATCCAGTGACAAGCAGAAGGTTG-3′

PCR反应程序为：98℃，预变性10min；98℃，变性20s；65℃，退火20s；72℃，延伸2min，30个循环；72℃，复性10min；10℃保存。

将PCR扩增产物用质量比为2％的琼脂糖凝胶电泳检测，将与目的基因长度一致的电泳条带进行切胶回收，回收片段连接至pEASY-T1载体(购于全式金生物技术有限公司)，获得连接产物。将连接产物转化到大肠杆菌感受态Trans5α细胞中，并提取质粒，以提取的质粒做模板，以ZmSSP1-F和ZmSSP1-R引物进行PCR扩增验证，同时用KpnI 和BamHI双酶切质粒进行检测，筛选阳性克隆子，将阳性克隆子送去华大生物公司进行测序，测序结果使用MEGA4.0软件比对，结果与预测一致(详见基因序列)。

2.3ZmSSP1基因的亚细胞定位分析

为了进一步了解玉米ZmSSP1基因亚细胞定位特征，我们构建了亚细胞融合载体，将ZmSSP1基因连接到改造后的pCAMBIA1305载体的GFP上游；

命名为p1305-35S-ZmSSP1-GFP：

上下游引物如下：F:GCTCTAGAATGCCCCCACTCGTCCCCTCGCT(下划线标记为 XbaI酶切位点)和R:CGGGATCCAGTGACAAGCAGAAGGTTGTTTTC(下划线标记为 BamHI酶切位点)。

构建正确的载体转化玉米原生质体，原生质体转化步骤如下：玉米培养至第二片叶高于第一片叶10-15cm时，截取距离叶尖6-8cm的部分，切成0.5mm左右，浸在酶解液(1％(w/v)纤维素酶、0.05％果胶酶和0.2％driselase)中，用锡箔纸包住放在40rpm/min的水平摇床上酶解5-6h。用100目的筛子将原生质体的酶解液过滤至圆底50ml的离心管中，除去未溶解的叶片，吸取等量的W5(0.4M蔗糖，2.4g/LHEPES，6g/LKCL， 600mg/LCaCl₂·2H₂O，)溶解含有原生质体的酶解液。100g，4℃离心2min，尽量除去上清，用5ml预冷的W5轻柔重悬，冰上放置30min。100g，4℃离心2min，使原生质体沉淀在管底，除去W5溶液，用适量的MMG(4.3g/LMS盐，0.4M蔗糖，500mg/LMES 盐，750mg/LCaCl₂·2H₂O，250mg/LNH₄NO₃30ml)重悬原生质体，在显微镜下观察溶解液中的原生质体的数目。加入10μLp1305-35S-ZmSSP1-GFP质粒于2ml离心管中，然后加入100μL的原生质体轻柔混匀，最后加入110μL的PEG溶液，轻柔拍打离心管，使它们完全混合，黑暗条件下诱导转化混合物1h。室温条件下，吸取440μLW5溶解混合液，轻柔颠倒摇动离心管，混合均匀，从而终止反应。100g，2min离心，去掉上清。向离心管中加入200μL的W5溶液，缓慢轻柔重悬原生质体，然后吸取到多孔培养皿中。用锡箔纸将多空培养皿包裹，在黑暗条件下诱导原生质体18h，在激光共聚焦显微镜下观察定位情况。

结果如图2所示，ZmSSP1基因定位于质体中，说明其可能参与到淀粉的调控过程。

2.4农杆菌介导的转ZmSSP1基因玉米株系的获得及鉴定

原位转化液的配制：1/4MS培养基中加2％质量浓度的蔗糖，0.05％质量浓度的表面活性剂silwet-77，2mg/L6-BA，1ng/L2，4-D以及10mg/L乙酰丁香酮。每100ml培养基中加4ml农杆菌AG10菌液，于28℃，250rpm培养24小时。

将玉米须剪去，用5ml的注射器将菌液从玉米的下部1/3处直接注入玉米棒(材料为Xiang249)中，注入的量以玉米须处有菌液渗出为宜。经过两个月的生长，收获玉米粒。

将玉米粒晒干，播种，待幼苗长到3-4叶期时用配制的0.01％(质量)除草剂basta和QuickStixPAT/bar蛋白检测试纸条(AS013LS)检测过表达载体和敲除载体上所含的 BAR基因蛋白，筛选阳性转基因植株。

具体方法如下：

1)过表达载体构建：根据玉米B73的cDNA的基因序列设计引物、PCR扩增、胶回收获得ZmSSP1基因；将ZmSSP1基因转入到pZZ00005质粒中，构建pZZ00005-ZmSSP1 过量表达载体；

2)Crispr/Cas9敲除突变体载体构建：根据ZmSSP1基因序列特异性设计敲除sgRNA靶位点TGGTGGCAGGCATATTCCAAGGG，测序正确后克隆到pZmU6-6载体上，产生敲除载体pZmU6-6-ZmSSP1；

3)载体导入细胞：采用冻融法将步骤1)2)中pZZ00005-ZmSSP1过量表达载体和pZmU6-6-ZmSSP1敲除载体导入农杆菌AG10感受态细胞中，形成农杆菌AG10菌液；

4)原位转化液配制：将农杆菌AG10菌液加入到培养基中，培养基为1/4MS培养基中加2％质量浓度的蔗糖、0.05％质量浓度的表面活性剂silwet-77、2mg/L6-BA、1ng/L2，4-D以及10mg/L乙酰丁香酮，在28℃，250rpm培养24小时，得转化菌液；

5)转化：将玉米须剪去，用注射器将转化菌液从玉米的下部1/3处直接注入玉米棒中，注入的量以玉米须处有菌液渗出为宜，经过两个月的生长，收获玉米粒；

6)筛选：将玉米粒晒干，播种，检测玉米中表达载体和敲除载体上所含的BAR基因蛋白，然后筛选阳性转基因植株。

7)独立转化事件的玉米苗成熟后，以其叶片总DNA为模板，使用QuickStixPAT/bar蛋白检测试纸条(AS013LS)检测载体上所含的BAR基因蛋白，同时使用ZmSSP1目的基因进行PCR检测，鉴定转基因植株，鉴定时，以野生型目的玉米植株为阴性对照。

PCR检测的反应程序为：94℃预变性10min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；72℃总延伸10min。

结果如图3所示，分别获得了过表达和敲除突变体株系，WT:玉米Xiang249自交；KO-1，KO-2，KO-3为Crispr/Cas9敲除突变体转基因株系；OE-1，OE-2，OE-3为过表达转基因株系。

2.5ZmSSP1转基因玉米籽粒的厚度和千粒重测定

我们选取两株独立转化事件的转基因株的T₃代籽粒进行玉米籽粒的厚和千粒重测定。千粒重使用电子天平，每千粒计数称重，两个独立转化株其T₃代籽粒分别选取1000粒计重，每次三个重复。

实验结果见图4，过表达植株籽粒厚度和千粒重大于野生型，而敲除突变体植株籽粒厚度和千粒重小于野生型。

2.6ZmSSP1转基因玉米淀粉含量与结构的分析

2.6.1ZmSSP1转基因玉米籽粒淀含量的测定

如图5，实验以玉米Xiang249为空白对照，ZmSSP1转基因玉米籽粒总淀粉含量，直链淀粉含量和支链淀粉测定。

分别选取两个独立转化事件过表达和敲除转基因株进行总淀粉含量，直链淀粉含量和支链淀粉测定，每次实验测定至少重复三次。测定方法如下：

总淀粉测定时，现将烘干的种子去硬壳和胚，再使用组织研磨仪将其研磨成粉末，40℃过夜烘干，过0.5mm筛(35目)。总淀粉测定方法参考Megazyme总淀粉测定试剂盒(K-TSTA)。

将研磨后样品(准确称量约100mg)加入到试管中(16x120mm)，确保全部样品位于试管底部；加入0.2mL乙醇溶液(80％v/v)，用漩涡混合器混合；放入搅拌架子，加入2mL2MKOH至每个试管中，冰水混合浴中搅拌20min左右，重悬粉末和溶解抗性淀粉(注意：不要使用涡旋仪混匀，会使淀粉乳化，确保加入KOH时，试管处于剧烈震荡状态。这是为了避免淀粉形成团块难以溶解)。

当试管在磁力搅拌器上搅拌时，加入8mL1.2M醋酸钠缓冲液(pH3.8)至每个试管。立即加入0.1mL耐热α-淀粉酶(试剂盒配置溶液)和0.1mL淀粉葡糖苷酶(试剂盒配置溶液)，充分混合，在50℃下孵育；孵育30min，间断混匀；样品淀粉含量>10％：将全部的溶液转移到100mL的容量瓶中，用洗瓶冲洗试管，并倒入容量瓶中，然后用蒸馏水调整溶液体积至100mL，充分混匀。

取部分溶液离心(1800rpm，10min)；转移两份稀释的样品溶液(0.1mL)到园底试管中(16×100mm)；加入3.0mLGOPOD溶液(试剂盒配置溶液)到每一个试管中(包括葡萄糖对照和试剂空白对照)，然后在50℃下孵育20min；葡萄糖对照包括0.1mL葡萄糖标准溶液(1mg/mL)+3.0mLGOPOD溶液。

试剂空白对照：0.1mL蒸馏水+3.0mLGOPOD溶液；相对于试剂空白在510nm下测定每一个样品和葡萄糖质控的吸光度。计算公式如下：

ΔA＝相对于试剂空白所读取的吸光度

FV＝总体积(例如100mL或10mL)；0.1＝样品分析体积；1/1000＝转化从μg至mg；100/w＝淀粉作为干粉重量的比例；W＝干粉重量；162/180＝D葡萄糖转化为脱氢葡萄糖；淀粉％(占干物质比重)＝淀粉％×100/100-水分含量(％)。

直链淀粉和支链淀粉测定时，首先对籽粒中淀粉进行提纯，将烘干去硬壳和胚的玉米种子在室温下用0.4％(质量分数)的NaOH溶液浸泡48h，料液(样本比0.4％的NaOH 溶液)比为1:3，洗涤后再用0.4％的NaOH溶液浸泡24h，反复水洗至种子表面不再黏滑为止，沥干水分，用胶体磨粉碎，淀粉乳过筛(200目)，离心(3000r/min，20min)，取下层白色沉淀即为淀粉，将淀粉反复漂洗离心，40℃鼓风干燥，粉碎，过筛(200目)，即得淀粉纯品，将得到的淀粉用于直链淀粉和支链淀粉的测定，具体测定方法参考测定试剂盒(K-AMYL)。

实验以玉米Xiang249材料为对照，测定三次生物学重复，至少三次实验操作重复，测定结果见图5所示，ZmSSP1敲除突变体两个株系的总淀粉、直链淀粉和支链淀粉均显著低于野生型，而过表达植株的直链淀粉也高于野生型。说明ZmSSP1基因能直接或间接影响淀粉合成过程中淀粉相关基因的表达，对淀粉表达起正调控作用。

2.6.2ZmSSP1转基因玉米籽粒淀颗粒扫描电镜观察

扫描电镜具体实验操作方法如下：

(1)取晒干的种子，去壳；使用锋利的切割刀，将种子从中间纵切成两半，分别标号装到离心管中；

(2)向离心管中加入2.5％的戊二醛溶液，4℃过夜固定，倒掉固定液后，用0.1MpH7.0的磷酸缓冲液漂洗种子3次，每次15min；再用1％的锇酸溶液固定，常温下， 1～2h，倒掉固定液后，用0.1MpH7.0的磷酸缓冲液漂洗种子3次；

(3)从离心管中吸去磷酸缓冲液，加入梯度浓度的乙醇溶液分别对种子进行脱水处理。乙醇梯度浓度分别为：30％，50％，70％，80％和90％，每种浓度处理20min，再用纯乙醇洗脱2次，每次20min；

(4)吸去离心管中的纯乙醇，用乙醇和醋酸异戊酯混合液(v:v＝1:1)处理种子30min (间隔摇动溶液)，再用纯醋酸异戊酯溶液处理种子1～2h；

(5)使用临街干燥法，将种子从醋酸异戊酯溶液中挑到样品笼中，用滤纸吸去样品笼外围的溶液后，移入到仪器的样品杯中，盖上盖子，拧紧(注：在装样前，先打开仪器的电源，将温度设定为0℃预处理10～15min)；

(6)打开的CO₂排气阀和仪器的进气阀，向样品杯中注入液体CO₂，当CO₂的量到样品杯的50％时，关闭进气阀，静止15～20min；

(7)再打开仪器排气流量计阀门和进气阀，10min后关闭排气阀；当充入的CO₂到样品杯的80％左右时，关闭进液阀；

(8)加温置换：将仪器温度调至20℃，放置15～20min后，杯中的CO₂会逐渐气化，当杯中的气压升到约为7000Pa时，醋酸异戊酯会与CO₂充分置换；

(9)气化：将温度调至35～40℃时，杯内的CO₂达到临界点；当压力达到7134Pa 时，5min后，打开流量计的排气阀，以1.0～1.51/min的速度排气，45～60min后结束排气，样品杯的压力降为0，当温度降至室温后，即可取出样品；

(10)镀膜：将种子非观察面，用导电胶粘贴到样品台上，胶风干后，进行镀膜。

本实验采用离子溅射镀膜法：装置由真空泵和真空罩两部分组成，真空罩内有阴阳极，阴极面装黄金靶，种子装在阳极面的样品座上。当真空罩中的真空度抽到1～10Pa时，在阴阳极之间加上2000V的直流电压，此时会产生弧光放电电场(在电场的作用下，真空罩里的残余气体分子会被电离为正离子和电子，正离子被阳极吸引轰击黄金靶，激发出黄金颗粒和电子，并被阳极吸引附着在种子表面形成导电膜)；

(11)置于扫描电镜下观察，拍照。

如图6所示，扫描电镜中分析发现，两个敲除突变体转基因植株淀粉颗粒要比野生型小且出现淀粉颗粒异常，两个过表达植株籽粒淀粉颗粒形态正常且排列紧密。ZmSSP1 基因对淀粉结构的形成起到了正调控作用。

2.7ZmSSP1转基因玉米蛋白含量分析

如图7所示，实验以玉米Xiang249为空白对照，ZmSSP1转基因玉米籽粒总蛋白含量，醇溶蛋白以及非醇溶蛋白含量测定。

测定方法如下：

(1)将10颗玉米籽粒去种皮和去胚，用液氮研磨至粉末并装入EP管中，真空抽干；

(2)称取50mg抽干的粉末于EP管中，加入1mL石油醚，涡旋混匀，4℃摇床孵育1h去脂；

(3)13200rpm，离心15min后弃上清，真空抽干；

(4)加入1mL硼酸钠溶液，20μLβ-巯基乙醇，37℃摇床孵育过夜；

(5)13200rpm离心15min，吸取上清液转入新的EP管，上清液则为总蛋白；

(6)从总蛋白中取出300μL，加700无水乙醇，涡旋混匀，室温摇床孵育2h；

(7)13200rpm离心15min，吸取上清于新的EP管，用70％乙醇洗涤沉淀两次，13200rpm离心5min，沉淀风干至边缘透明后加入200μLIPG溶解，即为非醇溶蛋白；

(8)将总蛋白和醇溶蛋白的上清液进行真空抽干后，加入200μLIPG溶解，即为总蛋白和醇溶蛋白；

(9)完成提取的蛋白利用Bradford法进行浓度的测定，并计算其含量；

(10)将抽提的醇溶蛋白和非醇溶蛋白各取40μL加入10μL的蛋白buffer混匀后，99℃煮沸10min加样跑胶，过夜染色，然后脱色拍照观察。

测定结果如图7所示，敲除突变体中总蛋白和醇溶蛋白含量明显高于野生型，说明ZmSSP1基因对蛋白特别是醇溶蛋白的合成具有负调控作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1及其应用

<141> 2021-12-16

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1626

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays L)

<400> 2

atgcccccac tcgtcccctc gctgctcctc ccaatcccag ccttgatcct acccgcgcca 60

cctcgcctct cccgccaccg ctgcttcctg cccgccgtgt cctcctcctc ctcctcctcg 120

tcgtccccgc actccaggga gccataccgc cgccgccgac gcgacacccc gagccagaca 180

ccgacgcctg cgccgcgccc atcctcccag ccgcagccgc ctccgcgccg cgcaaatgcc 240

gccacgcccg gcgctcggag tcaggaggag ctggaggcgg cgatctacga cttcatgtgc 300

cgctccgcca agccgggagc cttccccacc cgcgaggagc tcgtcgcggc cggccgctcc 360

gacctcgcgg ccgccgtcgc gtccagcggg ggctggctct ccctaggctg gtcctccacc 420

gccgcggagg gccccgcgac gacggctgca ccgtgctcat caggcggggg ccaccctgac 480

tacccgcctg agacgggcgt gtattaccgt ggtgatctag cgcccgtctc ggtggaggac 540

tccgagtgtt tgcgttgcag ggaggacgac gaagaggatg cctcaccatc tgggcgggag 600

tcgggaacag aggaggccag cgaggtccgg ctcaacgcag gaatcgaggg gatgctcacc 660

aggctgcaga aggatagaga gcgagcgcgg ccacctccac ggactagtac ccacgacaca 720

cagggccaaa gtgacgatga tgcgggcaac agtggcgctc ctagccatac agcggctggt 780

ggcaggcata ttccaagggc tcctgagaat ggaagtgtcc atggatctca ttctcaaaat 840

ggaacaatag agggcaacag cacctttcag ggttcgaacg atgatgcatg gcaaacatgg 900

acccttggca agggcgattt atctcatttt gaagctgctg aggtcttacc tattgaaaga 960

agaaaagtat cccgacatga tgacattgca tccgtgcaaa atgacattca caggtcatct 1020

aatggtgtgg ctgtaagcga tttttctagc gatggtgttg gcactggaag agatgagata 1080

cattcacggc ttcaaattct ggaattggac ctttctgctg ctctcaagac attaagatca 1140

agatttgaca aagttttatc agatttgtca aatagtaatg gagcaactgt gttggatgac 1200

atctctgatg attgggaatt tgaggagaca aaggtaatgc aagctcagga ggagttaaga 1260

tcaatccggg ctaaaatagc tgtgttagaa gggaagatgg ctcttgagat aattgaaagg 1320

aacaaaataa ttgaagataa acaaaggagg cttgataaag ttgagaaggc actgagtgag 1380

ctccgtactg tctgtattat gtgggccaac cctgcttcag atgttttagt ggttgggtcc 1440

tttgatggct ggacaagtca aagaaagttg gaaagatcag aaaacggcat gttttcctta 1500

aatctgagac tgtaccctgg tagatatgag attaagttta ttgttgatgg tgtttggaag 1560

aatgatccgc tgcgacccac tgtgcacaac aatgggcatg aaaacaacct tctgcttgtc 1620

acttga 1626

<210> 2

<211> 539

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays L)

<400> 2

Met Pro Pro Leu Val Pro Ser Leu Leu Leu Pro Ile Pro Ala Leu Ile

1 5 10 15

Leu Pro Ala Pro Pro Arg Leu Ser Arg His Arg Cys Phe Leu Pro Ala

20 25 30

Val Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Arg Glu Pro

35 40 45

Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Asp Thr Pro Ser Gln Thr Pro Thr Pro Ala

50 55 60

Pro Arg Pro Ser Ser Gln Pro Gln Pro Pro Pro Arg Arg Ala Asn Ala

65 70 75 80

Ala Thr Pro Gly Ala Arg Ser Gln Glu Glu Leu Glu Ala Ala Ile Tyr

85 90 95

Asp Phe Met Cys Arg Ser Ala Lys Pro Gly Ala Phe Pro Thr Arg Glu

100 105 110

Glu Leu Val Ala Ala Gly Arg Ser Asp Leu Ala Ala Ala Val Ala Ser

115 120 125

Ser Gly Gly Trp Leu Ser Leu Gly Trp Ser Ser Thr Ala Ala Glu Gly

130 135 140

Pro Ala Thr Thr Ala Ala Pro Cys Ser Ser Gly Gly Gly His Pro Asp

145 150 155 160

Tyr Pro Pro Glu Thr Gly Val Tyr Tyr Arg Gly Asp Leu Ala Pro Val

165 170 175

Ser Val Glu Asp Ser Glu Cys Leu Arg Cys Arg Glu Asp Asp Glu Glu

180 185 190

Asp Ala Ser Pro Ser Gly Arg Glu Ser Gly Thr Glu Glu Ala Ser Glu

195 200 205

Val Arg Leu Asn Ala Gly Ile Glu Gly Met Leu Thr Arg Leu Gln Lys

210 215 220

Asp Arg Glu Arg Ala Arg Pro Pro Pro Arg Thr Ser Thr His Asp Thr

225 230 235 240

Gln Gly Gln Ser Asp Asp Asp Ala Gly Asn Ser Gly Ala Pro Ser His

245 250 255

Thr Ala Ala Gly Gly Arg His Ile Pro Arg Ala Pro Glu Asn Gly Ser

260 265 270

Val His Gly Ser His Ser Gln Asn Gly Thr Ile Glu Gly Asn Ser Thr

275 280 285

Phe Gln Ser Asn Asp Asp Ala Trp Gln Thr Trp Thr Leu Gly Lys Gly

290 295 300

Asp Leu Ser His Phe Glu Ala Ala Glu Val Leu Pro Ile Glu Arg Arg

305 310 315 320

Lys Val Ser Arg His Asp Asp Ile Ala Ser Val Gln Asn Asp Ile His

325 330 335

Arg Ser Ser Asn Gly Val Ala Val Ser Asp Phe Ser Ser Asp Gly Val

340 345 350

Gly Thr Gly Arg Asp Glu Ile His Ser Arg Leu Gln Ile Leu Glu Leu

355 360 365

Asp Leu Ser Ala Ala Leu Lys Thr Leu Arg Ser Arg Phe Asp Lys Val

370 375 380

Leu Ser Asp Leu Ser Asn Ser Asn Gly Ala Thr Val Leu Asp Asp Ile

385 390 395 400

Ser Asp Asp Trp Glu Phe Glu Glu Thr Lys Val Met Gln Ala Gln Glu

405 410 415

Glu Leu Arg Ser Ile Arg Ala Lys Ile Ala Val Leu Gly Lys Met Ala

420 425 430

Leu Glu Ile Ile Glu Arg Asn Lys Ile Ile Glu Asp Lys Gln Arg Arg

435 440 445

Leu Asp Lys Val Glu Lys Ala Leu Ser Glu Leu Arg Thr Val Cys Ile

450 455 460

Met Trp Ala Asn Pro Ala Ser Asp Val Leu Val Val Gly Ser Phe Asp

465 470 475 480

Gly Trp Thr Ser Gln Arg Lys Leu Glu Arg Ser Glu Asn Gly Met Phe

485 490 495

Ser Leu Asn Leu Arg Leu Tyr Pro Gly Arg Tyr Glu Ile Lys Phe Ile

500 505 510

Val Asp Gly Val Trp Lys Asn Asp Pro Leu Arg Pro Thr Val His Asn

515 520 525

Asn Gly His Glu Asn Asn Leu Leu Leu Val Thr

530 535

Claims

1.一种玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1在调节玉米籽粒厚度和千粒重中的应用，其特征在于，所述基因ZmSSP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1在调节玉米籽粒蛋白含量中的应用，其特征在于，所述基因ZmSSP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因ZmSSP1表达对籽粒的蛋白合成起负调控作用，所述蛋白包括籽粒总蛋白和醇溶蛋白。