CN118290548A

CN118290548A - 将马齿玉米转变成硬粒玉米的基因

Info

Publication number: CN118290548A
Application number: CN202310002595.3A
Authority: CN
Inventors: 巫永睿; 王海海; 黄永财; 李瑜洁
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2023-01-03
Filing date: 2023-01-03
Publication date: 2024-07-05

Abstract

本发明公开了一种能够将马齿玉米转变成硬粒玉米的基因，其为马齿玉米B73来源的转录因子MYB40即Zm00001d040621，马齿玉米过表达该基因，能够导致马齿型玉米转变为硬粒型。本发明使得硬粒马齿玉米的遗传改良及种质资源创新变得更加高效、便捷，具有重要的应用价值和经济价值。

Description

将马齿玉米转变成硬粒玉米的基因

技术领域

本发明属于玉米育种技术领域，具体地说，涉及一种将马齿玉米转变成硬粒玉米的基因及其在创制硬粒型玉米种质资源中的应用。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是由发源于墨西哥南部的野生玉米teosinte(Zea mayssubsp.parviglumis)经过1万多年的驯化而成。随着现代杂交种的应用，玉米已成为世界产量最高的农作物之一。硬粒型(flint)和马齿型(dent)玉米是两种重要的玉米种质，它们各自具有独特的地理适应性，被广泛用于玉米的育种。

虽然硬粒玉米和马齿玉米之间有许多遗传差异，但两者最明显的区别是籽粒表型(Unterseer,S.et al.A comprehensive study of the genomic differentiationbetween temperate Dent and Flint maize.Genome Biol 17,doi:ARTN 137 10.1186/s13059-016-1009-x(2016).)。马齿型籽粒的顶部在发育后期开始塌陷，在成熟时留下凹陷的总冠。硬粒玉米在整个发育和成熟过程中，总冠保持凸起，被厚厚的硬质胚乳包裹，使种子变得很坚硬。硬质胚乳与籽的外观品质、收获及加工过程中的籽粒破损有关(Zhang,H.&Xu,G.Physicochemical properties of vitreous and floury endosperm flours inmaize.Food Sci Nutr 7,2605-2612,doi:10.1002/fsn3.1114(2019).)。硬质胚乳对干磨很重要，因为它能产生更高的“玉米糁”，这是制作玉米片和玉米粉所需的。马齿玉米的粉质胚乳较多，更适合湿磨，其中淀粉回收是主要目标(Weber,C.et al.Determination ofmaize hardness by biospeckle and fuzzy granularity.Food Sci Nutr 2,557-564,doi:10.1002/fsn3.130(2014).Blandino,M.et al.Determination of maize kernelhardness:comparison of different laboratory tests to predict dry-millingperformance.J Sci Food Agric 90,1870-1878,doi:10.1002/jsfa.4027(2010).Juarez-Garcia,E.,Agama-Acevedo,E.,Gomez-Montiel,N.O.,Pando-Robles,V.&Bello-Perez,L.A.Proteomic analysis of the enzymes involved in the starch biosynthesis ofmaize with different endosperm type and characterization of the starch.J SciFood Agric 93,2660-2668,doi:10.1002/jsfa.6054(2013).)。马齿玉米和硬粒玉米相比，籽粒脱水缓慢，这会影响玉米收获过程中的籽粒破(Guo,Y.N.et al.Study of cornkernel breakage susceptibility as a function of its moisture content by usinga laboratory grinding method.J Integr Agr 21,70-77,doi:10.1016/S2095-3119(20)63250-6(2022).)。但是，硬粒玉米的籽粒通常较小，产量低于马齿玉米(Weiss,T.M.etal.Unraveling the potential of phenomic selection within and among diversebreeding material of maize(Zea mays L.).G3(Bethesda)12,doi:10.1093/g3journal/jkab445(2022).)。因此，育种家希望在不断追求提高产量的情况下，通过结合马齿和硬粒玉米的优点，培育出马齿籽粒顶部凹陷程度得到改良、外观质量好、脱水快、容重高和产量高的理想玉米粒型。

硬粒型和马齿型的农艺性状由微效多基因控制，分子遗传机制复杂。因此在育种改良中，只能通过传统育种方法对硬粒、马齿玉米进行杂交、回交进行多代的选择，比较盲目也费时费力，效率较低。长久以来，一直缺乏能够直接应用于生产育种，快速、高效、低成本改良硬粒、马齿玉米明确的“即用工具型”基因。我们经过多年努力首次克隆到一个可以决定玉米硬粒马齿的关键基因Fln1(ZmARF17，基因号为Zm00001d014013，参见专利文献CN202210236129.7)，打开了控制玉米农艺性状改变的突破口。

发明内容

在此期间、以及后续研究中，我们进一步通过解析基因Fln1的功能，挖掘到另外一个可改良马齿玉米向硬粒型性状的重要转录因子MYB40(基因号为Zm00001d040621)，MYB40是调控玉米黄酮代谢的转录因子P1的同源基因Pericarp Color1，可以激活CHS和DFR启动子。实验发现，在马齿玉米B73中过量表达MYB40，可以将马齿型的籽粒变为硬粒型，在F1代收获的种子就可以看到表型相当于一个显性作用的基因位点，这样更方便后续的遗传改良；而且转基因材料的鉴定只需要通过常规的PCR反应就可以进行筛选。因此，MYB40新功能的发现和克隆能使硬粒马齿玉米的遗传改良及种质资源创新变得更加高效、便捷，具有重要的应用价值和经济价值。据此发现，本发明的技术方案包括如下内容。

1.一种多肽，其选自下组：

(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽，即马齿玉米B73来源的转录因子MYB40(Zm00001d040621)；

(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能、或者功能比(a)多肽增强的由(a)衍生的多肽；

(c)与(a)限定的多肽序列有80％以上同源性，优选地85％以上同源性，优选地90％以上同源性，优选地95％以上同源性，更优地98％以上同源性，且具有(a)多肽功能、或者功能比(a)多肽增强的由(a)衍生的多肽；或

(d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述多肽序列的衍生多肽。

应理解，上述术语“功能”是指作为转录因子调控玉米黄酮代谢(例如诱导、激活或者增强CHS和DFR启动子基因表达)、在马齿玉米中表达后将玉米表型性状由马齿型(dent)转变成硬粒型(flint)的功能。

上述术语“增强”或者“提高”表示相较于参考水平(例如MYB40)提高至少10％，例如相较于参考水平的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、至少约1倍、至少约2倍、或至少约3倍、或至少约5倍、或至少约10倍的提高。

2.一种多核苷酸，其选自：

(A)编码上述项目1所述多肽的多核苷酸；

(B)编码如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(C)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸，即马齿玉米B73来源的MYB40基因(Zm00001d040621)CDS序列；

(D)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的同源性≥70％，优选地≥75％，优选地≥80％，优选地≥85％，优选地≥90％，优选地≥95％，更优地≥98％的多核苷酸；

(E)与(A)-(D)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

3.一种表达框，其包含上述项目2所述的多核苷酸和位于其上游调控其表达的启动子。

优选地，上述启动子是如核苷酸序列SEQ ID NO:3所示的玉米ubi1启动子(ubiquitin1,Zm00001d015327)。这种情况下，由玉米ubi1启动子(ubiquitin1,Zm00001d015327)驱动所述多核苷酸(尤其是MYB40基因)在马齿玉米比如B73中过表达。

进一步地，优选上述表达框还包含位于ubi1启动子下游的如核苷酸序列SEQ IDNO:4所示的3xFLAG-MYB40，即所述表达框是ubi启动子+3xFLAG-MYB40。

6.一种质粒，其包含：

上述项目2所述的多核苷酸，或者

上述项目3所述的表达框。

上述质粒可以是基因表达质粒，用于通过农杆菌介导法转入玉米中表达上述项目1所述的多肽。这种情况下，质粒所用载体例如是pCAMBIA3300、pCAMBIA1301、pCAMBIA2301、pBI121、pTF102等植物转基因用的载体或改造后的载体。

上述质粒也可以是基因编辑系统质粒，用于通过这些植物转基因载体和植物转基因体系将上述项目2所述的多核苷酸(例如MYB40基因)或者上述项目3所述的表达框整合入玉米基因组中。

本发明还提供了上述项目所述的多肽、上述项目2所述的多核苷酸、上述项目3所述的表达框或者上述项目6所述的质粒在玉米育种中的用途，用于将马齿玉米转变成硬粒玉米。

本发明另一方面还提供了一种将马齿玉米转变成硬粒玉米的方法，包括下述步骤：

(1)使马齿玉米过表达上述项目1所述的多肽；或者

(2)使马齿玉米过表达上述项目2所述的多核苷酸；和/或

(3)增强马齿玉米基因组中已有的上述项目2所述多核苷酸(例如已有的MYB40基因)的表达。

上述步骤(1)或(2)可以采用下述转基因过表达方式：

(i)通过转基因技术或基因编辑技术将整合单拷贝或多拷贝上述项目2所述的多核苷酸(例如MYB40基因)或者上述项目3所述的表达框整合入马齿玉米基因组中；和/或

(ii)将用于表达上述项目2所述多核苷酸(例如MYB40基因)或者上述项目3所述表达框的质粒通过农杆菌介导法转入玉米中，进行目的基因表达。

上述基因编辑技术例如选自下组：同源双交换，TALEN系统，CRISPR-Cas9系统，CRISPR-Cpf1系统，CRISPR-Cas12系统，CRISPR-BEST系统，MuGENT(multiplex genomeediting by natural transformation，通过自然转化进行多重基因组编辑)。

上述步骤(3)可以采用下述方式：

(I)通过筛选或者突变所述多核苷酸(例如MYB40基因)上游调控因子，导致所述多核苷酸(例如MYB40基因)表达量上升；和/或

(II)用强启动子调控所述多核苷酸(例如MYB40基因)表达；和/或

(III)通过筛选MYB40的互作蛋白来提高MYB40基因或其同源基因功能。

本发明的另一个方面提供了一种用于检测玉米中MYB40基因Zm00001d040621过表达的试剂盒，其包括用于检测核苷酸序列SEQ ID NO:2的引物、或者DNA/RNA探针、或者DNA/RNA探针的微阵列芯片。

在一种实施方式中，所述试剂盒中用于检测SEQ ID NO:2的引物包括正向引物MYB40-OE-F(ubi启动子内部正向引物)和反向引物MYB40-OE-R(MYB40基因内部反向引物)：

MYB40-OE-F：5’-TTAGCCCTGCCTTCATACGC-3(SEQ ID NO:5)，

MYB40-OE-R：5’-CAGGTGCGAGTTCCAGTAGTTTT-3’(SEQ ID NO:6)。

在使用上述试剂盒检测玉米中MYB40基因过表达时，抽取玉米基因组DNA作为模板，使用引物对MYB40-OE-F和MYB40-OE-R进行PCR，可扩增出如核苷酸序列SEQ ID NO:7所示的510bp左右的扩增条带，表明MYB40基因过表达。

TTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCATGgactacaaggaccatgacggtgactacaaggaccatgacattgactacaaggatgacgatgacaagggaggaggaGGGAGGGCGCCGTGCTGCGAGAAGGTGGGGCTGAAGAAGGGGAGGTGGACCAAGGAGGAGGACGAGGTCCTGGCGAGGTACATCAAGGAGCACGGGGAAGGATCGTGGAGGTCACTGCCCAAGAATGCCGGGCTGCTGCGGTGCGGGAAGAGCTGCAGGCTGCGGTGGATCAACTACCTGCGGGCGGGTCTCAAGAGGGGGAACATCTCGGAGGAGGAGGAGGACATGATCATCAAGCTCCACGCCACGCTTGGCAACAGGTGGTCCCTGATCGCCGGTCACTTGCCCGGTCGAACAGACAACGAGATCAAAAACTACTGGAACTCGCACCTG(SEQ IDNO:7)。

本发明首次发现基因号为Zm00001d040621的玉米MYB40基因是调控玉米硬粒形成的基因，一个基因的过表达就可以将马齿籽粒转变为硬粒型。例如用玉米ubi1(ubiquitin1,Zm00001d015327)启动子驱动MYB40在B73中过表可以实现马齿玉米向硬粒玉米的转变。因此本发明为马齿玉米改良为硬粒玉米提供了有效的基因资源和遗传材料，包括基因、表达框和质粒，将该基因工具导入普通玉米自交系，无论正反交，后代植株只要携带MYB40的过表达位点(不论纯合或杂合)，所产生的果穗都为硬粒型(不论自交还是杂交)，作用效果显著，使得硬粒马齿玉米的遗传改良及种质资源创新变得更加高效、便捷，具有重要的应用价值和经济价值。

附图说明

图1显示了将ZmARF17突变基因型fln1导入不同自交系后籽粒表型照片。将fln1硬粒突变体与20个马齿自交系杂交，并将具有纯合fln1的F2植株的棒子与分离出野生型基因型的棒子进行比较。比例尺，1cm。

图2显示了fln1改良郑单958杂交种在上海松江农场的表型。其中，a、普通郑单958和fln1改良后的郑单958杂交种的棒子表型。比例尺，1厘米。b、郑单958和改良版郑单958籽粒冠部凹陷程度的测量。c、硬质胚乳(VE)面积与总胚乳的比率。d、成熟郑单958和改良郑单958的籽粒含水量。e、郑单958和改良郑单958的百粒干重。f、郑单958和改良郑单958的雌穗长度。g、郑单958和改良郑单958的行数。h、郑单958和改良郑单9581的行粒数。i、郑单958和改良郑单958的每穗粒重。j、郑单958和改良郑单958的容重。在b-j中，使用双尾Student’st-test检验确定P值。

图3显示了ZmARF17的亚细胞定位和DNA结合功能检测结果。其中，a、ZmARF17亚细胞定位。为了研究ZmARF17亚细胞定位，我们将全长ZmARF17-融合到增强型绿色荧光蛋白(GFP)的N末端。融合蛋白在玉米叶原生质体中的瞬时表达揭示了其在细胞核中的定位。比例尺，5μm。b、ZmARF17结合DR5启动子DNA的EMSA分析。c、ZmARF17结合P3(2x)的EMSA分析，包括TGTCTC元件的两个反向重复序列的串联拷贝。

图4显示了黄酮合成相关转录因子基因的表达分析情况。其中，a、显示了B73和fln1突变体种皮中黄酮合成相关转录因子基因的FPKM值。b、MYB40和MYB95的氨基酸序列比对。黑色阴影的氨基酸表示100％相同的氨基酸残基，灰色的表示相似的氨基酸残基。

图5显示了ZmARF17与MYB40相互作用。其中，a、双分子荧光互补实验(BiFC)显示ZmARF17和MYB40在烟草叶片中的相互作用。比例尺，10μm。b、荧光素酶互补成像试验显示了ZmARF17和MYB40在烟草叶片中的相互作用。c、体外Pull-down实验显示ZmARF17与MYB40的相互作用。d，e、双荧光素酶报告基因测定ZmARF17和 MYB40对CHS(d)和DFR(e)启动子的调控。f，g、EMSA显示MYB40与CHS(f)和DFR(g)启动子结合。CHS-P，该探针包含两个CAAC基序，位于CHS启动子起始密码子上游414至291bp之间；DFR-P，该探针包含三个核心CAAC/GTTG基序，位于DFR启动子起始密码子上游-255至-80bp之间。

图6显示了MYB40-OE转基因材料的分子鉴定和籽粒表型。其中，a、对T0代MYB40过表达转基因材料进行PCR鉴定，M，为marker；P，为质量；W，为野生型B73。b、RT-qPCR分析MYB40在过表达材料中的表达量。c、MYB40过表达转基材料T1代自交的表型。

图7显示了B73和MYB40过表达玉米籽粒表型分析情况。其中，a、B73和过表达MYB40(MYB40-OE)的转基因玉米的籽粒表型。比例尺，1cm。b、B73和MYB40-OE籽粒的纵向截面。比例尺，2mm。c、B73和MYB40-OE籽粒总冠凹陷的统计测量。d、硬质胚乳(VE)面积与总胚乳的比率。e、B73和MYB40-OE核的果皮长度。c-d中，使用双尾Student’s t-test检验来确定P值。

图8显示了MYB40过表达玉米中黄酮基因表达和IAA含量测定结果。其中，a-c、RT-qPCR分析MYB40(a)、CHS(b)、DFR(c)在过表达转基因叶片中的表达量。d、B73和MYB40-OE授粉后15DAP种皮组织中IAA的含量测定。d，使用双尾Student’st-test检验来确定P值。Per，没有花梗的上部种皮；Ped，花梗。

具体实施方式

硬粒、马齿型玉米是现代杂交玉米育种的重要种质资源，也是重要的农艺性状。由于硬粒马齿型玉米受微效多基因控制，而且遗传机制复杂，控制其形成的QTL(quantitative trait locus，数量性状基因座)很难克隆，目前还没有报道；同时硬粒玉米的形成机制也不清楚。因此通过常规育种方法进行硬粒玉米的遗传改良及其遗传种质的拓展，不仅费时费力、效率低、而且进展非常缓慢方向不明确。我们首次克隆了控制硬粒马齿的关键基因Fln1(参见专利文献CN202210236129.7)；通过寻找FLN1的互作蛋白，我们又克隆到一个新的调控硬粒马齿玉米形成的重要基因MYB40即Zm00001d040621。

为了便于理解本发明，以引用方式将CN202210236129.7中的部分内容并入本文中作为参考。

控制硬粒马齿的关键因子FLN1/ZmARF17互作蛋白的获得

我们通过大规模EMS诱变，克隆了首个控制硬粒马齿和籽粒脱水的关键基因Fln1(ZmARF17)，该基因可以调控玉米种皮中的黄酮含量，该基因的突变可以使大部分马齿的自交系转变为硬粒型(图1)。该基因导入郑单958杂交种后，可以使杂交种的粒型由马齿转变为硬粒型，同时籽粒脱水速率增加，并且产量相关的农艺性状没有发生改变(图2)。我们发现ZmARF17蛋白和大多数转录因子一样可以定位在细胞核，但是对生长素相应原件没有结合功能(图3)，暗示该转录因子需要与其他蛋白相互结合来调控黄酮的合成和种皮的发育。已有报道表明，拟南芥中黄酮合成基因的表达受AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111转录因子的调控，而玉米中这类转录因子的同源基因是P基因家族，包括P1、P2、MYB40、MYB95和MYB154，但是只有MYB40和MYB95在种皮中表达，其中MYB40表达更高，是MYB95的两倍多(图4中a)；而且MYB95蛋白缺少一段N段序列(图4中b)。因此我们推测MYB40转录因子可能和FLN1互作来调控黄酮的合成和种皮的发育。

ZmARF17和MYB40结合抑制MYB40对黄酮合成基因启动子的激活活性

为了验证上述推论，我们用烟草系统研究通过BiFC、LUC互补实验以及体外的Pull-down实验证明，MYB40可以和ZmARF17蛋白互作(图5中a-c)。为了进一步验证MYB40和ZmARF17的蛋白互作是否可以调控黄酮基因的表达，我们将这两个转录因子分别和黄酮合成关键基因CHS和DFR启动子在玉米叶片原生质体中共表达，发现MYB40可以激活CHS和DFR启动子，而ZmARF17不能激活这两个基因的表达。当ZmARF17和MYB40与这两个启动子分别共转后，发现MYB40对这两个启动子的激活会抑制因为加入ZmARF17而明显收到抑制(图5中d,e)。进一步用EMSA实验证明，MYB40可以体外结合CHS和DFR启动子，而加入ZmARF17后可以增强MYB40的DNA结合能力(图5中f,g)。这些结果表明，ZmARF17可以通过和MYB40直接结合，从而抑制MYB40对黄酮合成基因的转录激活活性，负调控玉米种皮中黄酮的合成，调控种皮的发育。

在马齿自交系B73中过表达MYB40可以将马齿粒型转变为硬粒型

由于ZmARF17需要互作蛋白来调控硬粒马齿的形成，MYB40可能也会调控硬粒马齿的形成。为了验证这个推论，我们在B73背景下过表达MYB40基因。试验发现过表达MYB40基因的确可以将马齿的B73粒型转变为硬粒型玉米(图6)。进一步研究发现，B73籽粒顶部凹陷的表型由于MYB40的过表达而变成凸起，变为硬粒型，同时硬质胚乳的含量明显增加(图7中a-c)。

MYB40过表达可以调控诱导黄酮基因表达、使生长素含量下降并抑制种皮发育

为验证MYB40能否调控黄酮基因表达，我们检测了过表达转基因玉米叶片中CHS和DFR基因的表达，结果显示，过表达MYB40可以诱导黄酮关键基因CHS和DFR的表达(图8中a-c)。同时MYB40过表达株系中籽粒纵向切面的种皮长度明显减少(图8中d)，过表达玉米的上部种皮和种子基部组织中的生长素含量也明显减少。生长素含量的下降会抑制种皮细胞的生长。这些结果表明，MYB40过表达可能会促进黄酮在种皮中的积累、降低生长素含量，从而影响种皮发育，导致硬粒玉米的形成。

研究发现，MYB40基因即Zm00001d040621用于改造马齿玉米至少具有如下特点：

1.MYB40的功能非常强、并且遗传稳定性好。将MYB40在玉米中过量表达，可以改良马齿型的籽粒变为硬粒型，聚合这两种粒型农艺性状上的优点，理论上对绝大部分自交系都有效，这将大大拓宽硬粒、马齿的种质资源。而且改造获得的玉米遗传稳定性非常好，在上海、云南和海南三地育种的表型都非常稳定。

2.用MYB40进行硬粒玉米改良的时间周期短。由于硬粒型相对于马齿型玉米为隐性，如果采用传统的遗传筛选方式，需要杂交后再自交获得纯合的位点，才能出现硬粒的表型，而杂合的基因型表现为马齿的粒型。我们首次克隆到的Fln1/ZmARF17基因进行硬粒玉米改良时需要与其杂交，再自交一代，通过我们开发的分子标记鉴定获得Fln1/ZmARF17纯合植株产生的种子全为硬粒型，需要自交一代。但是，用MYB40过表达进行改良时，只需要杂交，种子种下去产生的玉米棒子就是全硬粒型，不需要再自交纯合；只要基因型是杂合就可以产生改良马齿玉米向硬粒型的表型。这样，相当于把一个隐性的性状变为了显性，在遗传材料的改良过程中将会大大节约育种时间。由于农业育种周期很长，需要大量的农田、气候和灌溉保障、耗费人力，更是要耗费大量的时间，导致成本高昂，因此“时间就是金钱”，这是本发明另外一个巨大的优势。

3.用MYB40进行硬粒玉米改良的操作简单，适合进行规模化作业。玉米的杂交和自交技术相对简单，普通工人就可以掌握。我们开发了MYB40过表达鉴定的引物，可以便捷地对MYB40进行基因型鉴定。而所涉及的玉米叶片DNA提取、PCR反应这些都是常规的分子实验，在普通实验室就可以完成。

4.用MYB40进行硬粒玉米改良可以大大降低成本。相比传统的玉米遗传改良，用fln1进行硬粒玉米改良的效果强、稳定性好、缩短时间、减少工作量，从而大大节约成本。而用MYB40过表达进行改良时，一方面大大缩短了时间，节约了种植和管理成本，稳定性好，同时分子鉴定也不需要测序，成本进一步降低，因此优势更加突出。

这些优点赋予了MYB40基因广泛的应用前景和重大经济价值。

在本文中，为了描述简便起见，有时会将某种蛋白比如转录因子(MYB40)与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。例如，对于MYB40，用于描述转录因子功能或类别时，指的是蛋白质或多肽；在作为一种基因描述时，指的是编码该转录因子的基因。

应理解，本发明技术方案中使用的多肽MYB40不仅仅限于马齿玉米B73来源的氨基酸序列为SEQ ID NO:1的MYB40，还包括其他玉米品种来源的同工转录因子、甚至包括其他植物来源的同类转录因子，这些同工转录因子是多肽SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸残基突变后形成的突变体。

所述的“突变”包括但不限于氨基酸残基的替换、删除、插入、化学修饰，优选是正向突变即酶活力提高的突变。所述取代可以是非保守取代、保守取代或非保守取代和保守取代的组合。“保守的”氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的可互换性，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而，如本文所用，如果保守的突变可以代替地为脂肪族至脂肪族、非极性至非极性、极性至极性、酸性至酸性、碱性至碱性、芳族至芳族、或限制残基至限制残基的取代，则保守的突变不包括亲水至亲水、疏水至疏水、含羟基至含羟基或小残基至小残基的取代。本技术领域公知，保守性置换的常见情况包括：芳香族氨基酸F、W、Y之间的相互置换；疏水性氨基酸L、I、V之间的相互置换，极性氨基酸Q、N之间的相互置换，碱性氨基酸K、R、H之间的相互置换，酸性氨基酸D、E之间的相互置换，羟基的氨基酸S、T之间的相互置换。此外，A、V、L或I可以保守地突变为另一脂肪族残基或另一非极性残基。示例性的保守取代例如为：

“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸进行的多肽中氨基酸的取代或突变。非保守取代可以使用上面所列的定义组之间而不是之内的氨基酸。在一个实施方案中，非保守突变影响(a)取代区域中肽主链的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)、(b)电荷或疏水性、或(c)侧链体积。

“缺失”是指通过从参考多肽移除一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。缺失可以包括移除1个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、或20个或更多个氨基酸、多达构成参考酶的氨基酸总数的10％，同时保留酶活性和/或保留工程化醛缩酶的改良特性。缺失可以针对多肽的内部和/或端部。在多个实施方案中，缺失可以包含连续的区段或者可以是不连续的。

“插入”是指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。在一些实施方案中，改良的工程化醛缩酶包括将一个或多个氨基酸插入天然存在的醛缩酶中以及将一个或多个氨基酸插入其他改良的醛缩酶多肽中。插入可以是在多肽的内部，或羧基端或氨基端。如本文所用的插入包括如本领域中已知的融合蛋白。插入可以是连续氨基酸区段或者被天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸分隔开。

本发明在马齿玉米中过表达MYB40或者增强MYB40表达的实施方式可以有多种，这些实施方式可以相结合/组合采用。

应理解，在具体的基因工程实施方案中，步骤(1)、(2)、(3)和(i)、(ii)以及(I)、(II)和(III)的排序并非完全根据阿拉伯数字、英文字母顺序由前到后地固定不变，它们可以交叉、颠倒地操作，只要每个步骤能实现各自的功能、完成细胞基因型的定向改变即可。

本发明的技术方案描述中，所用术语诸如“A和/或B”、“A并且/或者B”中使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，如短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；C(单独)。

以下通过实施例对本发明的技术方案进行阐述和验证。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例

本文的实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

本文的实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。

材料和方法

玉米的自交、杂交、转基因操作、大田育种等按照常规的育种方式进行。

实施例中的引物合成及基因测序皆由上海博尚生物技术有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据试剂供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

实施例中用于构建质粒的引物列于表1。

表1：载体构建用到的引物

表中，名称中的后缀“-F”代表正向；“-R”代表反向。

实施例中用于基因PCR鉴定的引物列于表2。

表2：定量RT-PCR引物列表

表中，名称中的后缀“-F”代表正向；“-R”代表反向。

实施例1：用Fln1/ZmARF17基因改良马齿自交系的粒型

将20份马齿自交系的花粉分别杂交到Fln1/ZmARF17的突变体fln1的雌穗上，产生F1代种子，F1代自交产生F2代种子，播种后对F2的植株进行PCR测序鉴定(方法参考实施例10)，分别获得Fln1基因型为野生型和纯合突变的植株，然后每种基因型分别自交6个玉米棒子，成熟后考察籽粒表型。每个自交系群体中，分离出的Fln1纯合基因型的植株自交产生的F3籽粒都得到了改良，大部分自交系的籽粒都由马齿改变为硬粒型(图1)。

实施例2：用Fln1/ZmARF17基因对郑单958改良

首先用Fln1/ZmARF17的突变体基因分别和郑单958的亲本郑58和昌7-2杂交，然后再分别用郑58和昌7-2进行回交，每代都用Fln1的基因型进行鉴定，然后再自交，获得Fln1纯合突变的郑58-fln1和昌7-2-fln1，再杂交获得改良版本的杂交种郑单958-fln1，并在上海种植，进行常规田间管理，籽粒成熟后进行籽粒表型、硬质胚乳面积、百粒重、穗行数、行粒数、穗粒重、容重、含水量等农艺性状进行统计和分析，结果显示，Fln1可以将郑单958马齿籽粒转变为硬粒型，同时硬质胚乳增加、含水量明显下降、容重增加，而其他产量相关农艺性状没有改变(图2)。

实施例3：Fln1/ZmARF17蛋白的亚细胞定位

为了确定ZmARF17的亚细胞定位，使用引物ZmARF17-GFPF和ZmARF17-GFPR扩增不含终止密码子的全长编码序列，并克隆到pCAMBIA1300GFP载体中，生成35Spro:ZmARF17:GFP融合质粒。B73幼苗在28℃下黑暗中生长7天，然后将叶片切成1mm大小的切片，并在裂解缓冲液(1.5％纤维素酶R10、0.5％ Macerozyme R10、0.4M甘露醇、20mM KCl、20mM MES pH5.7、10mM CaCl₂、0.1％BSA、5mMβ-巯基乙醇)中，在22℃下孵育3h。然后使用W5缓冲液(154mM NaCl、125mM CaCl₂、5mM KCl、5mL葡萄糖、0.03％MES、pH 5.7)终止反应，洗涤和收集原生质体。原生质体中加入MMG缓冲液(0.4M甘露醇，15mM MgCl₂，0.1％MES，pH 5.7)，将浓度调节至1x10⁶/mL。每100μL原生质体中加入10μg质粒和110μL PEG(45％PEG4000，0.2M甘露醇，100mM CaCl₂)进行转化。室温孵育15分钟后，加入440μL W5缓冲液终止。去除上清液后，加入1mL WI(20mM KCl，0.6M甘露醇，4mM MES pH5.7)，将原生质体孵育16小时。使用LSM880共焦显微镜(Zeiss，Jena，Germany)观察GFP荧光信号。ZmARF17蛋白定位在细胞核中(图3中a)。

实施例4：EMSA实验检测FlN1/ZmARF17蛋白的DNA结合功能

使用引物ZmARF17-PET30F和ZmARF17-PET30R扩增ZmARF17的编码序列，并将其克隆到pET30a载体中以产生具有His标签的融合蛋白。使用引物MYB40 pCOLDF和MYB40pCOLDR扩增MYB40的编码序列，并将其克隆到pCold载体中，产生NH末端具有GST标签的融合蛋白。将载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，用0.5mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在20℃下诱导20小时产生重组蛋白。在Ni-NTA琼脂糖(QIAGEN)上纯化ZmARF17-His和MYB40-GST的重组蛋白。将含有生长素响应元件的DNA片段DR5和P3(2X)用荧光素酰胺(FAM)进行5'末端标记。将0.05pmol的标记探针与100ng纯化重组蛋白在室温下在20μL结合反应混合物(1μL 1mg/ml鲑鱼精子DNA、20mM Tris-HCl、pH 7.9、5％甘油、0.04mg/ml牛血清白蛋白、2mMMgCl₂、0.2mM二硫苏糖醇和40mM KCl，超纯水至最终体积20μL)中孵育30分钟。对于竞争分析，将100倍未标记探针加入反应混合物中。电泳在天然4％聚丙烯酰胺凝胶中用0.5M三硼酸EDTA在4℃和恒定110电压下进行80分钟。用Starion FLA-9000仪器(FujiFilm，日本)检测荧光。结果显示，生长素响应因子Fln1/ZmARF17蛋白不能直接结果生长素响应原件(图3中b,c)，表明该转录因子可能不具有DNA结合的功能，需要与其他可以结合DNA的转录因子互作来调控下游基因的表达。

实施例5：黄酮合成相关基因的表达分析

分别取Fln1突变体硬粒材料和B73授粉后12、20、30天的种皮材料，提取RNA(方法参见实施例11)，在上海欧意公司进行RNA-seq分析，然后分析黄酮合成相关基因的表达变化。另外用序列分析软件分析MYB40和MYB95氨基酸序列的差异。这些数据表明，玉米种皮中调控黄酮合成的转录因子P1、P2及同源基因MYB154都不表达；MYB40和MYB95在种皮中表达，其中MYB40的表达量是MYB95的两倍；序列比对分析发现MYB95和MYB40的相似性很高，但是MYB95蛋白N端的76个氨基酸缺失，这可能会影响其生物学功能(图4)。因此我们将MYB40作为FLN1/ZmARF17的候选互作蛋白进行深入分析。

实施例6：MYB40与FlN1/ZmARF17蛋白互作的研究

6.1双分子荧光互补(BiFC)检测

将ZmARF17和MYB40的全长编码序列扩增并插入nYFP和cYFP质粒中，分别获得ZmARF17-YN和MYB40-YC载体。将载体转入根癌农杆菌(A.tumefaciens)菌株GV3101。转化子培养后，通过离心收集含有所述载体的菌株，并在最终OD₆₀₀＝1.0时，将其重新悬浮在渗透缓冲液(10mM MgCl₂、10mM MES和150mM乙酰丁香酮)中，然后以1:1的体积比例混合。注射到本氏烟草叶表皮细胞中，培养48小时。通过共焦激光扫描显微镜(Zeiss LSM880)检测BiFC诱导的YFP荧光。实验表明ZmARF17和MYB40可以相互结合定位于细胞核中(图5中a)。

6.2荧光素酶互补成像试验

将ZmARF17 CDS克隆到质粒JW771(NLUC)中，将ZmMYB40的CDS克隆到JW772(CLUC)中。每个ORF分别融合到LUC的羧基端一半(CLUC-X)和N端一半(X-NLUC)。用空的载体JW771和JW772作为阴性对照。将构建好的载体转入根癌农杆菌GV3101中。将转化的农杆菌细胞培养后重悬于渗透缓冲液(10mM MgCl₂、10mM MES和150mM乙酰丁香酮)中，OD₆₀₀在0.8-1之间。将悬浮液注射到本氏草叶片背面，培养2d。将荧光素溶液注射到同一区域的测试叶片中，然后使用Tanon-5200化学发光成像系统检测荧光素酶信号。实验表明，ZmARF17和MYB40可以相互结合(图5中b)。

6.3Pull-down实验

将纯化的重组蛋白ZmARF17-His和MYB40-GST在4℃的结合缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，0.2v/v％Triton X-100，10v/v％甘油，无EDTA蛋白酶抑制剂1025cocktail)中孵育过夜。用谷胱甘肽琼脂糖珠(Sangon Biotech，C650031)回收蛋白质复合物，用缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，140mM NaCl，0.1v/v％Triton X-100，和无EDTA蛋白酶抑制剂1025cocktail)洗涤三次。去除未结合的蛋白质后，使用抗GST(Abmart，M20007)和抗ZmARF17抗体通过免疫印迹分析结合的蛋白质。Western blotting：将蛋白用10％ SDS-PAGE凝胶分离，然后电泳转移到PVDF膜上，用一抗孵育4℃过夜，然后用二次抗室温孵育，再用化学发光底物试剂(Invitrogen)处理膜，然后用Tanon-5200体系检测免疫反应条带。实验表明ZmARF17和MYB40可以在体外相互结合(图5中c)。

实施例7：双荧光素酶报告基因检测MYB40和FlN1/ZmARF17对下游基因启动子的调控

将ZmARF17和ZmMYB40的全长CDS扩增后分别插入35S驱动的效应质粒62SK中；将黄酮合成关键基因CHS和DFR启动子序列扩增后连入报告载体pGreenII 0800LUC的上游。然后用质粒大抽试剂盒NucleoBond Xtra Midi(50)抽提质粒，将质粒浓度调整到1μg/μL。转化玉米原生质体(转化方法见实施例3)。原生质体孵育16h后，用Dual-ReporterAssay System提取总蛋白，进行反应，然后再在光度计(Promega 20/20)上分析LUC和REN的比值。实验表明，MYB40可以诱导CHS和DFR基因的表达，ZmARF17则不能激活这两个基因的启动子，而且ZmARF17可以抑制MYB40对下游启动子的激活功能(图5中d,e)。

实施例8：EMSA实验检测MYB40和FlN1/ZmARF17对下游启动子序列的结合

将纯化的重组蛋白ZmARF17-His和MYB40-GST与黄酮合成关键基因CHS和DFR启动子序列(含CAAC元件)进行EMSA实验，具体步骤参见实施例4。结果表明，MYB40可以和CHS和DFR启动子在体外结合，同时ZmARF17可以增强MYB40对DNA的结合(图5中f,g)。

实施例9：将MYB40在B73背景下过表达创制硬粒型玉米

MYB40表达载体构建

为了创建MYB40过表达(MYB40-OE)质粒，设计如下引物对：

正向引物MYB40 FlagF：

aggtcgactctagaggatccATGgactacaaggaccatgacggtgactacaaggaccatgacattgactacaaggatgacg atgacaagggaggaggaGGGAGGGCGCCGTGCTGCGAGA，

反向引物MYB40CDS-R：ggggaaattcgagctcCTAGAGATTGTCCAGGAAGAAG。

以玉米B73基因组DNA作为模板，使用引物MYB40 FlagF和MYB40CDS-R进行PCR，以便将MYB40 CDS与N端的Flag标签融合。

PCR检测用KOD FX Neo高保真酶(KFX-201T，TOYOBO)及其试剂盒推荐的PCR程序。胶回收PCR片段，大约1200bp。

将含有ubi1启动子(Zm00001d015327)的pCAMBIA3300载体用BamHI和SacI双酶切(酶切体系按照酶的说明书)，然后进行胶回收。

将胶回收的MYB40基因片段和酶切回收的pCAMBIA3300载体用同源重组酶ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞，C112-02)进行连接(方法参照试剂盒说明书)。

将重组后的产物转化大肠杆菌：重组后的产物加入大肠杆菌感受态100μl，冰中放置，30min，42℃水浴热激30s，在冰上放置2min，加1ml LB液体培养基，37℃摇菌1h，收集细菌，然后涂LB固体平板(卡那抗性)，37℃培养。第二天，挑菌落在含卡那的LB液体培养基中扩繁。

载体验证：扩繁后的大肠杆菌2ml用试剂盒抽提质粒，BamHI和SacI双酶切验证；然后用MYB40-OE-F测序并在基因内部加测一个反应。

经过测序验证后转化农杆菌EHA105菌株：农杆菌感受态细胞EHA105于冰上融化，加入100μg MYB40过表达质粒DNA，轻轻混匀，冰上静置孵育30min；液氮中速冻1min后，迅速放入37℃水浴锅中水浴5min；加入1ml LB培养基(不含抗生素)，28℃，200rmp培养2小时；浓缩菌液并涂于含有相应抗生素的LB(卡那霉素和利福平)培养板上，将平板封口后倒置于28℃培养箱中避光培养，2天左右可见菌落。

将含有该载体的农杆菌转化玉米B73幼胚，获得MYB40-OE的T0代转基因玉米。然后自交或和B73杂交保种，种子种下去再自交收获T1代转基因玉米。

实施例10：对MYB40过表达转基因玉米进行PCR鉴定

用CTAB法提取玉米DNA用于后续鉴定

取玉米叶片放于2mL管中，加入钢柱，液氮处理后进行研磨(60Hz，60s)；研磨后，加入0.6mL CTAB提取缓冲液，混匀；放入65℃烘箱60min，期间每10-15min混匀一下；取出置于室温5-10min，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)至离心管，密封后摇晃5min；室温13000rpm转速下离心15min，吸取上清至新1.5mL离心管中；加等体积异丙醇，来回颠倒混匀，放置负20度20min；室温12000rpm转速下离心1min，倒掉上清。用1mL的75％乙醇洗DNA沉淀1至2次，每次12000rpm转速下离心1min后，将乙醇倒出；短暂离心，吸出多于液体，在室温中晾干DNA沉淀；加入0.3mL H₂O溶解DNA沉淀。

PCR检测反应使用常规PCR MIX，检测使用如下引物：

正向引物MYB40-OE-F：5’-TTAGCCCTGCCTTCATACGC-3’，

反向引物MYB40-OE-R：5’-CAGGTGCGAGTTCCAGTAGTTTT-3’。

F引物(正向引物)在ubi启动子，R引物(反向引物)在MYB40内部。

结果如图6中a，500bp左右，可以扩增出目的条带，胶回测序后确定PCR产物为目的序列。

实施例11：玉米籽粒种皮中MYB40基因的表达

RNA的提取：

(1)分离B73和MYB40-OE的种皮组织，液氮速冻，磨样机充分磨粉，并迅速转移至-80℃超低温冰箱保存。

(2)取约50mg样品放置于2mL管中，加入400μL的RNA提取SDS缓冲液，充分震荡，放于冰上。SDS缓冲液见下表：

(3)加入400μL的酚-氯仿(酚饱和于NaAc/HAc中，1:1混合，酚pH为4.2，放置于4℃，分层后用下层)，剧烈震荡30s，放置于冰上5min，期间震荡，12000rpm转速下4℃离心10min，吸取350μL上清至新的1.5mL离心管中。

(4)向上清液管中加1mL的Trizol提取液，充分震荡，冰上放置5min；再向混合液中加200μL的氯仿，充分震荡，冰上放置5min，12000rpm转速下4℃离心10min，吸取上清液(切勿吸到中间层和下面有机相)500μL到新的离心管中。

(5)向上清中加500μL的异丙醇，充分震荡，放置冰上10min，12000rpm转速下4℃离心10min后，弃上清。

(6)加1mL的70％乙醇溶液，轻弹使沉淀漂浮，冰上放置1min后，12000rpm转速下4℃离心5min，弃上清。

(7)离心机短暂离心，用小枪头吸取多余液体。室温晾干RNA沉淀2min左右，加100μL的ddH₂O溶解沉淀。

(8)利用QIAGEN的RNeasy Plus Mini Kit试剂盒，按照试剂盒标准方法将上述初提RNA过柱进行纯化处理，其中涉及使用DNaseI进行DNA的去除，最后用30μL无RNA酶的H₂O进行溶解。

定量RT-PCR：

(1)RNA的反转录：采用Pomega公司的反转录试剂盒(ImProm-II^TMReverseTranscription System)进行RNA的反转录，按照试剂盒中标准方法进行。

(2)通过NCBI设计特异性引物(见表2)，并进行特异性分析，以TUA4(Zm00001d013367)为内参基因。

(3)按照Takara的SYBR Green试剂盒标准方法进行定量分析。每个样品进行三个生物学重复，将上述反转录后的cDNA样品统一稀释到90ng/μl，用20μL的反应体系进行定量分析。用SYBR Green Mix，按照20μL的反应体系，加入mix 10μL，引物各0.5μL，稀释后的cDNA 2μL，ddH₂O 7μL进行。

(4)通过BIO-RAD荧光定量分析仪CFX，采用两步PCR扩增法检测基因表达量，反应条件：预变性95℃，30s；扩增：95℃，5s，60℃，35s，40个循环；终止：95℃，15s；60℃，60s；95℃，15s。

(5)采用EXCELL 2010和△△CT法对定量数据进行分析

PCR鉴定为阳性的T0代种子，种植在大田后进行PCR鉴定，取阳性植株自交后15DAP(授粉后15天)的籽粒，进行RT-qPCR鉴定。结果表明，MYB40基因在过表材料的种皮中都显著上调(图6中b)；阳性植株自交的成熟籽粒由马齿型转变为硬粒型(图6中c)。

实施例12：MYB40过表达转基因玉米籽粒表型考察

MYB40-OE转基因玉米成熟后进行籽粒表型考察，测定籽粒顶部凹陷角度、硬质胚乳面积的变化和种皮长度变化。结果显示，MYB40-OE转基因玉米顶部由于灌浆充足而凸起，野生型玉米籽粒顶部灌浆补充足而凹陷(图7中a-c)；过表达转基因玉米中硬质胚乳的面积明显增加(图7中d)；而且过表达转基因玉米中种皮长度变短(图7中e)。这些结果提示，MYB40和FLN1都是通过调控玉米种皮的发育来调控硬粒马齿玉米形成。

实施例13：MYB40-OE玉米叶片中黄酮基因表达

为了验证MYB40是否可以调控黄酮基因，我们取MYB40过表达叶片进行RT-qPCR分析(方法见实施例11)，结果表明，MYB40过表达玉米叶片中CHS和DFR基因的表达明显生高(图8中a-c)。

实施例14：MYB40-OE种皮中IAA含量的测定

我们取MYB40过表达玉米授粉后15天的上部种皮(Per)和下部花梗(Ped)测定IAA的含量。将50mg样品在1ml 80％甲醇溶液中提取4小时，然后在4℃下以13523g离心10分钟。将液体上清液置于-20℃下过夜，并在4℃下以13523g离心10min，然后进行分析。提取物在UPLC仪器上进行分析，该仪器与配备电喷雾电离(ESI)源(AB SCIEX)的6500+MS系统相结合。使用Analyst 1.6.3软件(AB SCIEX)进行仪器控制和数据采集，使用MultiQuant3.0.2软件(AB SCI EX)进行数据处理。通过计算每个峰值的面积并将其与标准曲线进行比较，对植物激素进行量化。为了定量IAA含量，使用5、20、50、100、200和500ng/ml IAA(Agrisera)创建标准曲线。结果显示，MYB40过表达转基因玉米种皮中的生长素含量明显下降(图8中d)，这个结果和Fln1突变体中生长素含量结果类似；这样表明MYB40和FLN1通过调控相似的途径来调控种皮发育和硬粒马齿玉米的形成。

上述实施例对于基因MYB40能够将马齿玉米转变成硬粒玉米的功能和原理进行了介绍和验证，但本领域的技术人员应理解，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员可以在此基础上做出各种改动或者修改，由此所做的各种变形或者修改的等价形式，同样应属于本发明的范围。

Claims

1.一种多肽，其选自下组：

(a)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽，即马齿玉米B73来源的转录因子MYB40；

(c)与(a)限定的多肽序列有80％以上同源性，优选地85％以上同源性，且具有(a)多肽功能、或者功能比(a)多肽增强的由(a)衍生的多肽；或

(d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述多肽序列的衍生多肽。

2.一种多核苷酸，其选自：

(A)编码权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(B)编码如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(C)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸，即马齿玉米B73来源的MYB40基因CDS序列；

(D)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的同源性≥70％，优选地≥75％的多核苷酸；

(E)与(A)-(D)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

3.一种表达框，其包含如权利要求2所述的多核苷酸和位于其上游调控其表达的启动子。

4.如权利要求3所述的表达框，其特征在于，所述启动子是如核苷酸序列SEQ IDNO:3所示的玉米ubi1启动子。

5.如权利要求4所述的表达框，其特征在于，所述表达框还包含位于ubi1启动子下游的如核苷酸序列SEQ ID NO:4所示的3xFLAG-MYB40，即所述表达框是ubi启动子+3xFLAG-MYB40。

6.一种质粒，其特征在于，包含：

如权利要求2所述的多核苷酸，或者

如权利要求3或4所述的表达框。

7.如权利要求6所述的质粒，其特征在于，为基因表达质粒，用于通过农杆菌介导法转入玉米中表达如权利要求1所述的多肽。

8.如权利要求6所述的质粒，其特征在于，为基因编辑系统质粒，用于通过基因编辑系统将如权利要求2所述的多核苷酸(例如MYB40基因)或者如权利要求3所述的表达框整合入玉米基因组中。

9.如权利要求1所述的多肽、如权利要求2所述的多核苷酸、如权利要求3所述的表达框或者如权利要求6所述的质粒在玉米育种中的用途，其特征在于，用于将马齿玉米转变成硬粒玉米。

10.一种将马齿玉米转变成硬粒玉米的方法，包括下述步骤：

(1)使马齿玉米过表达如权利要求1所述的多肽；或者

(2)使马齿玉米过表达如权利要求2所述的多核苷酸；和/或

(3)增强马齿玉米基因组中已有的如权利要求2所述多核苷酸(例如已有的MYB40基因)的表达。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)或(2)采用下述转基因过表达方式：

(i)通过基因编辑技术将整合单拷贝或多拷贝如权利要求2所述的多核苷酸(例如MYB40基因)或者如权利要求3所述的表达框整合入马齿玉米基因组中；和/或

(ii)将用于表达如权利要求2所述多核苷酸(例如MYB40基因)或者如权利要求3所述表达框的如权利要求7所述的质粒通过农杆菌介导法转入玉米中，进行目的基因表达。

12.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)采用下述方式：

(II)用强启动子调控所述多核苷酸(例如MYB40基因)表达；和/或

13.一种用于检测玉米中MYB40基因Zm00001d040621过表达的试剂盒，其特征在于，包括用于检测核苷酸序列SEQ ID NO:2的引物、或者DNA/RNA探针、或者DNA/RNA探针的微阵列芯片。

14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测SEQ ID NO:2的引物包括正向引物MYB40-OE-F和反向引物MYB40-OE-R：

MYB40-OE-F：5’-TTAGCCCTGCCTTCATACGC-3(SEQ ID NO:5)，

MYB40-OE-R：5’-CAGGTGCGAGTTCCAGTAGTTTT-3’(SEQ ID NO:6)。

15.如权利要求14所述的试剂盒在检测玉米中MYB40基因过表达中的用途，其特征在于，抽取玉米基因组DNA作为模板，使用引物对MYB40-OE-F和MYB40-OE-R进行PCR，扩增出如核苷酸序列SEQ ID NO:7所示的扩增条带，表明MYB40基因过表达。