BRPI0808665B1 - Métodos e construções para produção de plantas de soja, algodão ou canola transgênicas usando seleção de espectinomicina - Google Patents

Métodos e construções para produção de plantas de soja, algodão ou canola transgênicas usando seleção de espectinomicina Download PDF

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plant
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Brian J. Martinell
Michael Petersen
David Somers
Yuechun Wan
Edward Williams
Xudong Ye
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Monsanto Technology Llc
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Abstract

MÉTODOS PARA TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS USANDO SELEÇÃO DE ESPECTINOMICINA. A presente invenção refere-se a métodos e composições para transformar explantes de soja, milho, algodão, ou canoia, usando espectinomicina como um agente seletivo para a transformação dos explantes. O método pode compreender ainda o tratamento dos explantes com uma citocinina durante o processo de transformação e regeneração.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[001] Este pedido de patente reivindica a prioridade dos pedidos de patente provisórios n°s US 60/894.096, depositado em 9 de março de 2007, e US 60/915.066, depositado em 30 de abril de 2007, cujos teores inteiros são aqui incorporados como referência.
Campo Técnico da Invenção
[002] A presente invenção refere-se a métodos para preparar e transformar tecido meristemático de plantas, e seleção e subsequente regeneração de plantas transgênicas.
Descrição de Técnicas Anteriores
[003] As plantas transformadas podem ser obtidas tratando diretamente o tecido meristemático de um embrião de planta. O tecido me- ristemático contém células vegetais formativas que diferenciam para produzir múltiplas estruturas vegetais, incluindo talo, raízes, folhas, tecido de linhagem germinal, e sementes. O tecido meristemático, tal como o tecido de soja, pode ser excisado de sementes. Os métodos para transformar geneticamente sojas (Glycine max) usando transferência gênica mediada de forma bacteriana diretamente nas células meristemáticas de embriões de soja, são conhecidos. Os meristemas e tecidos do ápice de brotos de algodão isolados foram transformados. O uso de uma citocinina para induzir o desenvolvimento de brotos em cultura de tecidos foi relatado.
[004] Inúmeros agentes seletivos são conhecidos para uso em métodos para transformar geneticamente células vegetais. Uma aminoglicosídeo-3'-adeniltransferase foi usada como um marcador selecionável para transformar células vegetais. A fusão de aadA com uma sequência codificadora de peptídeo de trânsito de cloroplasto, para permitir direcionar um AadA nuclear produzido para o cloroplasto, não foi relatada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[005] Em um aspecto, a invenção fornece um método para produzir uma planta transgênica que contém pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos heterólogas, compreendendo: (a) disponibilizar um explante que compreende uma primeira sequência de ácidos nucleicos heteróloga que confere resistência a um herbicida; (b) transformar o explante para compreender uma segunda sequência de ácidos nuclei- cos heteróloga que compreende um gene marcador selecionável que confere resistência a espectinomicina; e (c) regenerar um explante que apresenta resistência a espectinomicina para dar uma planta transgê- nica que contém pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos he- terólogas. Em uma modalidade, o explante compreende um meristema embrionário. Em outra modalidade, a primeira sequência de ácidos nucleicos heteróloga confere resistência a glifosato, bialafos, fosfinotri- cina, Basta, glufosinato, 2,4-D, canamicina e aminoglicosídeos relacionados, higromicina, um inibidor de acetil-coA carboxilase, um gerador de radicais oxigênio, ou dicamba. Em outra modalidade, o explante é um explante de soja, milho, algodão ou canola. Em uma modalidade específica, o explante é um explante de soja ou algodão, tal como uma planta de soja.
[006] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir uma planta transgênica, compreendendo: (a) transformar pelo menos um primeiro explante de semente com uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga que compreende um marcador selecionável que confere tolerância a espectinomicina; e (b) regenerar uma planta transgênica a partir das células transformadas, onde o explante é colocado, antes, concomitantemente e/ou depois da etapa (a) ou etapa(b), em contato com pelo menos um primeiro meio que compreende espectinomicina para selecionar células transformadas que compreendem o dito marcador selecionável. Em uma modalidade, a planta transgênica se origina a partir da transformação de um meristema, que resulta em transformação de tecido de linhagem germinal. Em certas modalidades, a planta resultante é não-quimérica. Em ainda outras modalidades, a planta resultante é quimérica. Em uma modalidade es-pecífica, pelo menos um broto da planta transgênica é transgênico e é não-quimérico. Em outra modalidade específica, pelo menos um broto da planta resultante é transgênico e não-quimérico, enquanto que pelo menos um outro broto ou uma outra raiz não compreende uma sequência compreendida no ácido nucleico heterólogo. Em certas modalidades, o primeiro explante de semente compreende um transgene. Em outras modalidades, o explante compreende um meristema embrionário. Em ainda outras modalidades, durante ou depois da etapa (a), os explantes são desenvolvidos na presença de um agente seletivo a 35 oC-40 oC e/ou são desenvolvidos sob condições de iluminação que permitem o desenvolvimento normal de plastídios. Em ainda outras modalidades, o crescimento a 35 oC-40 oC é realizado por 1-7 dias ou as condições de iluminação compreendem pelo menos 5 μ einsteins com um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 de escuridão.
[007] Em algumas modalidades, o explante é estocado em uma temperatura entre 0-15 oC durante entre 1 hora e 7 dias antes da etapa (a). Em outras modalidades, o meio compreende entre cerca de 15 mg/L e cerca de 1.500 mg/L de espectinomicina. A invenção refere-se ainda a um método no qual as células do explante compreendem uma sequência codificadora que confere tolerância a glifosato, bialafos, fos- finotricina, Basta, glufosinato, 2,4-D, canamicina e aminoglicosídeos relacionados, higromicina, estreptomicina, ampicilina ou dicamba. Em algumas modalidades, a etapa (a) compreende desenvolver um ex-plante em um meio de cocultura que compreende espectinomicina. Em outras modalidades, o explante não é colocado em contato com um meio que compreende espectinomicina depois de ser transferido de um meio de cocultura. Alternativamente, em outras modalidades, o explante é colocado em contato com um meio que compreende especti- nomicina depois de ser transferido de um meio de cocultura. Em algumas modalidades, o explante que está se regenerando para dar uma planta é transferido para o solo ou substituto de solo para enraizamento sem pré-enraizar em meio ascético. Em outras modalidades, o ácido nucleico heterólogo compreende ainda uma sequência codificadora que confere um traço de interesse agronômico ou melhor uso final.
[008] Em outras modalidades, a invenção fornece um método para produzir uma planta transgênica, compreendendo: (a) transformar pelo menos um primeiro explante de semente com uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga que compreende um marcador selecioná- vel que confere tolerância a espectinomicina; e (b) regenerar uma planta transgênica a partir das células transformadas, onde o explante é colocado, antes, concomitantemente e/ou depois da etapa (a) ou etapa (b), em contato com pelo menos um primeiro meio que compreende espectinomicina para selecionar células transformadas que compreendem o dito marcador selecionável, onde a etapa (a) compreende transformar a célula do explante com pelo menos um segundo ácido nucleico heterólogo. Em modalidades específicas, o segundo ácido nucleico heterólogo compreende uma sequência codificadora que con-fere tolerância a herbicidas. Em certas modalidades, o primeiro e o segundo ácidos nucleicos heterólogos são integrados em diferentes loci dentro do genoma da célula. Certas modalidades da invenção compreendem, antes da etapa (a) a etapa de condicionamento fisiológico da semente, onde o condicionamento osmótico compreende colocar o explante em contato com uma citocinina. Em outras modalidades, um método que compreende ainda colocar o explante em contato com uma citocinina antes, concomitantemente e/ou depois da etapa (b), é contemplado. Em modalidades específicas, a citocinina é selecionada no grupo que consiste em tidiazuron, BAP (6-benzilaminopurina), cine- tina, CPPU (N-(2-cloro-4-piridil)-N'-fenil-uréia), 2iP (6-(y,y- dimetilalilamino)-purina), zeatina, zeatina ribosídeo, adenina, e TIBA (ácido 2,3,5-tri-iodo-benzóico).
[009] Em algumas modalidades, a etapa (a) compreende colocar o explante em contato com Rhizobiaceae recombinantes que compreendem o dito ácido nucleico recombinante, onde as Rhizobiaceae foram expostas a tidiazuron antes ou concomitantemente com o contato do explante com as Rhizobiaceae recombinantes. Em certas modalidades, as Rhizobiaceae são expostas a tidiazuron durante entre cerca de 1 e 5 dias antes de colocar o explante em contato com as Rhizobi- aceae recombinantes. Em outras modalidades, as Rhizobiaceae são colocadas em suspensão na presença de um agente seletivo ativo contra um explante não-transformado antes de colocar os explantes em contato com as Rhizobiaceae. Em certas modalidades, as Rhizobi- aceae são selecionadas no grupo que consiste em Agrobacteria, Si- norhizobia, Mesorhizobia e Rhizobia. Em ainda outras modalidades, os explantes são desenvolvidos na presença de um fungicida, antes, durante ou depois da etapa de transformar pelo menos um explante de semente com uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga que compreende um marcador selecionável que confere tolerância a es- pectinomicina. Em certas modalidades, os explantes são desenvolvidos na presença de um fungicida e DMSO. Em modalidades específicas, os explantes são desenvolvidos na presença de nistatina, tiaben- dazol, e DMSO.
[0010] Em certas modalidades, o explante é um explante de soja, milho, algodão ou canola. Em modalidades específicas, o explante éum explante de soja ou um explante de algodão.
[0011] Em certas modalidades, o método para produzir uma planta transgênica compreende: (a) transformar pelo menos um primeiro explante de semente com uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga que compreende um marcador selecionável que confere tolerância a espectinomicina; e (b) regenerar uma planta transgênica a partir das células transformadas, onde o explante é colocado, antes, concomitantemente e/ou depois da etapa (a) ou etapa (b), em contato com pelo menos um primeiro meio que compreende espectinomicina para selecionar células transformadas que compreendem o dito marcador sele- cionável, compreendendo ainda a etapa de (c) obter uma planta de progênie de qualquer geração da planta transgênica que compreende o gene que confere o traço de interesse e carece do marcador seleci- onável. Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo compre-ende um primeiro segmento de DNA que compreende as bordas esquerda e direita do T-DNA, flanqueando um gene que confere um traço de interesse; e um segundo segmento de DNA que compreende um segundo conjunto de bordas esquerda e direita do T-DNA, flanqueando o dito marcador selecionável que confere tolerância à espectinomi- cina. Em outras modalidades, o método compreende ainda a etapa de (c) obter uma planta de progênie de qualquer geração da planta trans- gênica que compreende o gene que confere o traço de interesse e carece do marcador selecionável.
[0012] Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo compreende as bordas esquerda e direita do T-DNA e o primeiro e o segundo segmentos de DNA, onde o primeiro segmento de DNA compreende um gene de interesse localizado depois da borda direita, e onde o segundo segmento de DNA compreende o marcador selecio- nável localizado depois da borda esquerda. Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo compreende o primeiro e o segundo bordas direitas do T-DNA, onde um primeiro segmento de DNA que compreende um gene de interesse fica localizado depois da primeira borda direita e um segundo segmento de DNA que compreende o marcador selecionável fica localizado depois da segunda borda direita.
[0013] Em certas modalidades, o método compreende cultivar o dito explante sobre um meio que carece de espectinomicina durante entre cerca de 1 e cerca de 7 dias durante a etapa (b). Em outras modalidades, o método compreende colocar o explante em contato com pelo menos um primeiro meio que compreende espectinomicina durante entre cerca de 15 minutos e cerca de 7 dias. Em modalidades específicas, o marcador selecionável é codificado por aadA. Em mais modalidades específicas, aadA compreende SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o gene aadA é fundido a um peptídeo de trânsito de clo- roplasto. Em modalidades específicas, aadA compreende SEQ ID NO: 2.
[0014] Em certas modalidades, o explante é definido ainda como tendo sido mantido antes da etapa (b) sob condições nas quais o explante não germina e permanece viável e competente para transformação genética. Em algumas modalidades, as distas condições compreendem desidratar o explante ou uma semente que compreende o explante. Em certas modalidades, o método é definido ainda como compreendendo aumentar o teor de umidade do explante antes ou concomitantemente com a etapa (b). Em modalidades específicas, as ditas condições compreendem um teor de umidade interna do explante entre cerca de 3% e cerca de 25%. Em modalidades mais específicas, as ditas condições compreendem um teor de umidade interna do explante entre cerca de 3% e cerca de 16%. Em algumas modalidades, as ditas condições compreendem manter o explante em uma temperatura entre cerca de -80 oC e cerca de 60 oC.
[0015] Em algumas modalidades, o método compreende o condi-cionamento osmótico do explante antes da etapa (b). Em modalidades específicas, o condicionamento osmótico da semente compreende colocar o explante ou uma semente que compreende o explante em contato com uma solução aquosa que compreende água, um regulador do crescimento de plantas, um agente de seleção, ou um condicionador da membrana celular.
[0016] Em certas modalidades que compreendem o método para produzir uma planta transgênica, compreendendo: (a) transformar pelo menos um primeiro explante de semente com uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga que compreende um marcador selecionável que confere tolerância a espectinomicina; e (b) regenerar uma planta transgênica a partir das células transformadas, onde o explante é colocado, antes, concomitantemente e/ou depois da etapa (a) ou etapa (b), em contato com pelo menos um primeiro meio que compreende espectinomicina para selecionar células transformadas que compreendem o dito marcador selecionável, o método compreende ainda transformar pelo menos uma primeira célula do explante com um ácido nu- cleico heterólogo e é conduzido por transformação mediada de forma bacteriana ou bombardeio de microprojéteis.
[0017] Em algumas modalidades, o explante é definido ainda como tendo sido excisado a partir de uma semente que compreende 3% a 25% de teor de umidade interna, ou uma semente hidratada ou ger- minante que compreende 26% a 80% de teor de umidade interna, ou compreende um tecido do grupo que consiste em meristema, embrião imaturo, embrião, eixo embrionário, cotilédone, hipocotilédone, meso- cotilédone, folha, base de folha primária, disco de folha, ponta de broto, e plúmula. Em certas modalidades, o explante é definido ainda como tendo sido excisado de uma semente germinada ou embebida. Em outras modalidades, o explante não é colocado em contato com um meio que compreende espectinomicina depois da etapa (a). Em moda-lidades específicas, o primeiro meio é um líquido. Em outras modalidades, uma ou mais das etapas (a)-(b) são automatizadas.
[0018] Em outro aspecto, a invenção fornece uma construção de ácido nucleico que compreende duas sequências que conferem resistência à espectinomicina ou estreptomicina, onde a primeira sequência está ligada operacionalmente a um promotor ativo em uma célula vegetal, e a segunda sequência está ligada operacionalmente a um promotor ativo em uma célula procariótica. Em uma modalidade específica, as sequências que conferem resistência a espectinomicina ou es- treptomicina codificam um polipeptídeo que compreende atividade de aminoglicosídeo-3'-adeniltransferase (aadA). Em uma modalidade mais específica, pelo menos uma das sequências compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0019] Os desenhos que se seguem fazem parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar ainda mais certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem entendida fazendo referência aos desenhos em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas aqui apresentadas.
[0020] A Figura 1 representa detalhes ampliados de quatro explantes de soja a partir de tratamentos com diferentes níveis de TDZ adicionado ao inóculo/meio de cocultivo. Cada explante desenvolveu novamente botões/brotos (fundo) e alguns eram GFP-positivos (topo). As fotografias na fileira do topo foram tiradas em um microscópio com uma fonte de luz azul modificada que detecta tecido que expressa GFP por fluorescência. As mesmas imagens foram feitas com uma fonte de luz branca-padrão para ilustrar todos botões/brotos desenvolvidos (fileira do fundo).
[0021] A Figura 2 é o mapa do plasmídeo pMON96999.
[0022] A Figura 3 é o delineamento do protocolo de seleção com espectinomicina "A". A seleção, indução e alongamento de brotos sobre meio líquido ou semissólido; brotos destacados do enraizamento sobre meio semissólido.
[0023] A Figura 4 é o delineamento do protocolo de seleção com espectinomicina "B". A seleção, indução e alongamento de brotos sobre meio líquido ou semissólido; brotos destacados do enraizamento em tampões OASIS com meio líquido sem seleção.
[0024] A Figura 5 é o delineamento dos protocolos de seleção com espectinomicina, "C" e "D" (fundo), e comparação com o protocolo para seleção usando glifosato (topo). No caso do Protocolo "C", depois do cocultivo os explantes ficam retidos nos PLANTCONs originais e 12 mL de meio de seleção líquido são adicionados. Quatro dias depois, eles são transferidos para cima de meio de seleção semissólido para seleção e indução de brotos. No caso do Protocolo "D", depois da co- cultura, os explantes são diretamente transferidos para cima de meio semissólido para seleção e indução de brotos. Em ambos protocolos "C" e "D", os explantes que produzem brotos verdes são movidos para tampões Oasis com meio líquido sem seleção quanto a alongamento de brotos e indução de raízes. No caso do protocolo que usa seleção com glifosato (topo), onde a indução de brotos, e o alongamento de brotos e o alongamento de brotos são sobre meio semissólido com seleção, o enraizamento de brotos destacados também é realizado sobre meio semissólido com seleção.
[0025] A Figura 6 é o mapa do plasmídeo pMON107379 que compreende 2 T-DNA's, OriRi e aadA.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0026] O texto que se segue é uma descrição detalhada da invenção fornecida para auxiliar os versados nessas técnicas a praticar a presente invenção. Os versados nessas técnicas podem fazer modificações e variações nas modalidades aqui descritas sem fugir do espí-rito ou âmbito da presente invenção.
[0027] A invenção fornece métodos e composições para uso es- pectinomicina como um agente seletivo para preparar, peneirar, transformar, e regenerar explantes a partir de plantas de soja, milho, algodão, ou canola, dentre outras, para obter tecidos vegetais e plantas transformadas. Em alguns aspectos, várias partes dos métodos descritos podem ser procedimentos automatizados, de alto volume de produção. Um explante, tal como um embrião maduro ou imaturo, é obtido, por exemplo, a partir de uma semente, e pode ser transformado, por exemplo, por intermédio de uma abordagem de bombardeio de microprojéteis ou mediada de forma bacteriana. Em certas modalidades, ao mesmo tempo ou depois que o um DNA heterólogo está entrando em contato com o explante, o explante é contatado por uma citocinina selecionada no grupo que consiste em tidiazuron, BAP (6- benzilaminopurina), cinetina, CPPU (N-(2-cloro-4-piridil)-N'-fenil-uréia), 2iP (6-(y,y-dimetilalilamino)purina), zeatina, zeatina ribosídeo, adenina, e TIBA (ácido 2,3,5-tri-iodobenzóico), ou outro agente tal como dikegu- lac. Para facilitar o contato de um explante com a citocinina, a citocini- na pode ser adicionada ao inóculo bacteriano a ser usado na transformação antes de contato do explante com o inóculo. Em certas modalidades, a citocinina empregada é BAP em uma concentração de cerca de 0-3 mg/L ou cerca de 0,25-3 mg/L, ou TDZ (a cerca de 0-3 mg/L ou cerca de 0,25-3 mg/L). Em certas modalidades, a citocinina ou outros agentes também podem ser adicionados durante a embebição da semente para tratar os explantes antes que eles são excisados.
[0028] O uso de espectinomicina, com ou sem tratamento com citocinina, em concentrações entre 15-1.500 mg/L está contemplado, por exemplo, cerca de 25, 50, 100, 150, 250, 300, 500, 1.000, ou 1.500 mg/L. Caso um método para transformação mediado de forma bacteriana seja uso, a espectinomicina pode ser adicionada ao inóculo bacteriano antes de seu contato com o explante. Alternativamente, caso seja usado um método de transformação mediado de forma bacteriana ou mediado por microprojéteis, a espectinomicina pode ser adicionada antes, concomitantemente ou depois da etapa de transformar uma célula de soja, milho, algodão ou canola, de modo a selecionar células transformadas com um ácido nucleico heterólogo. A espectinomicina pode ser empregada também como um "pulso" durante uma parte do período de tempo para a etapa de crescimento da cultura de tecido, tal como a etapa de pré-cultura, etapa de cocultivo, etapa de retardamento, ou etapa de seleção, e opcionalmente em uma concentração mais alta de cerca de 1.000 mg/L.
[0029] As frequências de transformção ("TFs") obtidas usando os métodos e composições aqui descritas não tinham sido atingidas nas técnicas anteriores. Assim sendo, uma aumento na TF de 2-10 ou 5-10 vezes (e ainda mais alto em alguns casos) em relação àquele encontrado, por exemplo, quando se usa glifosato ou dicamba como o agente seletivo para transformção de soja ou algodão, foi atingido. Adicionalmente, a maior eficiência da transformação permite o desenvolvimento de um sistema de transformação de 2 T-DNA's usando seleção com espectinomicina, permitindo assim acumular traços transgênicos por transformação e cruzamento de plantas que já compreendem um traço transgênico com um ácido nucleico que codifica um traço adicional de interesse, e depois triando quanto a plantas que compreendem também o ácido nucleico que codifica o traço adicional.
[0030] Combinados com uma maior TF, os métodos descritos permitem também uma regeneração mais rápida de tecidos vegetais transformados candidatos, maior eficiência em identificar e desenvolver brotos e plantas transformadas, e menores custos e carga ergonômica, e ao mesmo tempo, simplificando e reduzindo a mão-de-obra necessária para produzir plantas transformadas. Por exemplo, depois que os brotos resistentes à espectinomicina com botões ou folhas verdes (isto é, resistentes à espectinomicina) se alongaram e são capazes de ser triados ou selecionados como sendo resistentes à especti- nomicina, eles podem ser colocados no solo ou sobre um substituto de solo, tal como um meio de enraizamento, na presença ou ausência do agente seletivo. Os brotos que se alongam a partir desse explante rotineiramente demonstram ser transgênicos e gerar progênie R1 e pro- gênie subsequente que são transgênicas, enquanto que as raízes que se desenvolvem a partir desses explantes podem ser transgênicas ou não-transgênicas. Assim sendo, uma planta que compreende um broto transgênico e um sistema radicular parcial ou completamente não- transgênico também está contemplada. Um método para regenerar uma planta integral a partir de brotos transgênicos de tecido meriste- mático transformado, enquanto que as raízes são não-transgênicas, cultivando tecido transformado sobre um meio que carece de um agente seletivo, também está contemplado. Os métodos descritos permitem assim um decréscimo significativo no tempo gasto sob condições seletivas e no uso do agente seletivo, reduzindo assim também os custos potenciais.
[0031] Para fornecer uma clara e consistente compreensão do relatório descritivo e das reivindicações, incluindo o âmbito dado a esses termos as definições que se seguem são fornecidas.
[0032] "Embrião" é parte de uma semente, consistindo em tecidos precursores (tecidos meristemáticos) para as folhas, talo, e raiz. Depois que o embrião começa a crescer (germinar), ele se torna uma muda de planta.
[0033] "Meristema" ou "tecido meristemático" consiste em células indiferenciadas, as células meristemáticas, que diferenciam para produzir múltiplas estruturas vegetais, incluindo talo, raízes, folhas tecido de linhagem germinal e sementes. As células meristemáticas são os alvos para transformação para obter plantas transgênicas.
[0034] "Explante" é um termo utilizado para se referir a um material-alvo para transformação, compreendendo tecido meristemático. Ele pode se referir a tecidos vegetais, incluindo, sem limitações, um ou mais embriões, cotilédones, hipocotilédones, bases de folhas, mesoco- tilédones, plúmulas, protoplastos, e eixos embrionários.
[0035] "Plantas quiméricas" são plantas que são compostas de tecidos que não são geneticamente idênticos, isto é, as plantas terão apenas uma parte ou fração de seus tecidos transformados, enquanto o restante dos tecidos não são geneticamente transformados.
[0036] "Transformação de linhagem germinal" ocorre quando o gene de interesse é transformado em células que geram pólen ou óvulo e, assim sendo, em sementes.
[0037] Os explantes podem ser transformados por uma sequência de DNA heteróloga, e as plantas transgênicas podem ser regeneradas a partir deles, sem a necessidade de gerar uma cultura de células de calos a partir do explante transformado, para obter plantas de progênie transgênica. A sequência de DNA heteróloga selecionada pode codificar, por exemplo, um marcador capaz de ser triado ou selecionado e/ou compreender um gene de interesse agronômico que especifica um traço a ser apresentado por uma planta ou célula resultante da expressão do ácido nucleico heterólogo. O traço pode ser agronomica- mente útil, por exemplo, resultando em maior rendimento, tolerância a herbicidas, resistência a pragas ou patógenos, ou adaptabilidade ambiental, dentre outros fenótipos. O traço pode também especificar a produção de um produto final desejado.
[0038] Tais métodos de transformação e regeneração permitem um processo rápido e eficiente com alto volume de produção para gerar plantas transformadas. A mecanização reduz significativamente os homens-horas estimados necessários para produzir 10.000 explantes,por exemplo, no caso de algodão entre cerca de 40 e apenas 2,4 horas, economizando significativamente os custos de mão-de-obra. Tal técnica permite que maiores números de transgenes sejam testados e eventos de qualidade mais alta sejam escolhidos para análise adicional, pois espera-se que apenas um número muito pequeno de eventos de transformação apresente os perfis de expressão mais desejados apropriados para desenvolvimento comercial. Um processo de excisão mecanizado permite também melhor "timing" e programação de etapas de transformação, por causa da maior flexibilidade na distribuição de explantes. O uso de um processo mecanizado para excisão de explantes pode proporcionar benefícios monetários, de segurança e flexibilidade, significativos. Entretanto, a preparação de explantes pode ser realizada também manualmente.
[0039] Antes da embebição, germinação e/ou excisão de explantes, as sementes podem ser submetidas a uma etapa de esterilização bem como uma etapa de separação, para evitar contaminação microbiana, a fim de remover as sementes com um alto grau de contaminação bacteriana ou fúngica, e também para remover as sementes que por qualquer razão sejam improváveis de produzir tecido viável de explante para uso com a presente invenção. A separação pode ser conduzida, por exemplo, baseado em parâmetros tais como tamanho, cor ou densidade da semente ou outras características, incluindo características de composição químicas. Os exemplos de métodos de separação podem incluir o uso de uma balança automática depois da classificação por tamanho. Um classificador óptico para este propósito é o Sortex 3000 Series Color Sorter (Buhler-Sortex KK, Yokohama, Japão). Outras técnicas de separação também podem ser empregadas, incluindo separação por teor de umidade. Depois da excisão, os explantes podem ser também submetidos a uma etapa de reidratação ou pré-cultura antes de serem transformados com um ácido nucleico he-terólogo.
[0040] Em modalidades específicas, a excisão é realizada mecanicamente usando roletes que esmagam as sementes aplicadas às suas faces, que podem ser contra-rotativos. O afastamento entre os roletes pode ser ajustado, baseado no tamanho das sementes aplicadas. O material dos roletes pode ser, por exemplo, elastomérico ou metálico. Em certas modalidades, roletes de aço inoxidável demonstraram reter qualidades benéficas de funcionamento, mesmo depois de uso repetido e prolongado. Para uso com sementes de algodão, roletes com sulcos secundários demonstraram agarrar e esmagar eficientemente as sementes com mínimo dano para a fração de explante meristemático. Os métodos para excisão mecanizada de explantes de plantas são conhecidos; vide, por exemplo, pedidos de patente provisórios n— de série US 60/894.096 e 60/915.066, e publicação de pedido de patente no US 2005/0005321, aqui incorporados como referência em sua totalidade.
[0041] Em uma modalidade, um explante preparado de acordo com a invenção pode ser definido como tendo uma umidade interna de cerca de 4-25%, incluindo cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, e 25% de umidade interna, e incluindo especificamente todas faixas deriváveis entre quaisquer desses valores. Em modalidades específicas, as sementes a partir das quais os explantes vão ser preparados podem ser colhidas em um teor de umidade interna predeterminado apropriado para isolar material transfor- mável a partir delas. Em certas modalidades não-limitativas, as sementes a partir das quais os explantes são obtidos podem ser definidas como tendo um teor de umidade interna de cerca de 3-25%, incluindo cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, e 25% de umidade interna, e incluindo especificamente todas faixas deriváveis entre quaisquer desses valores, tais como, por exemplo, entre cerca de 4% e 16%. Em certas modalidades, a fragilidade das sementes pode ser alterada manipulando o teor de umidade, permitindo uma divisão eficiente das sementes e preparação de explantes. Por exemplo, um teor de umidade interna tal como 3% a 7% pode ser vantajoso. As sementes podem ser mantidas nesses teores de umidade ou qualquer outro teor de umidade produzindo condições de estocagem estáveis (e explantes transformáveis) antes do uso. As sementes, em certas modalidades podem ser sementes de soja, milho, algodão, ou canola.
[0042] Os explantes secos (explantes que foram excisados da semente sob condições de baixa umidade) ou explantes úmidos secados (explantes que foram excisados da semente depois de hidrata- ção/embebição e são subsequentemente desidratadas e estocadas) de várias idades podem ser usados. Em uma modalidade, os explantes são relativamente "jovens" pelo fato de que eles foram removidos das sementes há menos do que um dia, por exemplo, entre cerca de 1 e 24 horas, tal como cerca de 2, 3, 5, 7, 10, 12, 15, 20, ou 23 horas antes do uso. Em outras modalidades, os explantes podem ser estocados por períodos mais longos, incluindo dias, semanas, meses ou mesmo anos, dependendo das condições de estocagem usadas para manter a viabilidade dos explantes. Os versados nessas técnicas em particular devem entender que os tempos de estocagem podem ser otimizados de tal modo que a qualidade e/ou rendimento dos transfor- mantes, bem como a eficiência do processo de transformação sejam maximizados. Isto pode ser conduzido para qualquer protocolo de transformação específico, por exemplo, transformação mediada por Agrobacterium, transformação por bombardeio de microprojéteis, bem como outros procedimentos de transformação.
[0043] Em algumas modalidades, uma semente ou um explante seco pode primeiramente passar por condicionamento osmótico, por exemplo, por embebição em um líquido, tal como água ou um líquido esterilizante, ressecado, e posteriormente usado para transformação e regeneração. Em outras modalidades, a semente ou o explante pode passar por condicionamento osmótico aumentando o teor de umidade interna da semente para mais do que 30%, mantendo a semente ou o explante em um ponto no tempo, e depois reiniciando a embebição em um ponto do tempo posterior. Em uma modalidade alternativa, a semente ou o explante pode passar por condicionamento osmótico aumentando o teor de umidade interna para mais do que 30%, estocando a semente ou o explante por um período predeterminado, secando a semente ou o explante até o teor de umidade interna abaixo de 20%, e depois reiniciando a embebição.
[0044] Podem ser colhidos os explantes transformáveis não contêm algum ou uma parte de cada cotilédone remanescente afixado ao tecido embrionário, por exemplo, tanto quanto % do cotilédone. Estes explantes são considerados substancialmente similares, pois eles podem resultar, cada um, em uma planta transformada estável. O explante deve conter, entretanto, pelo menos uma parte da região meris- temática do embrião, de tal modo que tipicamente o explante possa produzir um broto dentro de 12 semanas a partir do início das condições de crescimento da cultura do tecido.
[0045] O explante pode ser recuperado a partir de uma semente hidratada, a partir de uma semente estocável, a partir de uma reidrata- ção parcial de explante hidratado secado, os termos "hidratação" e "reidratação" são definidos como uma mudança mensurável na porcentagem de umidade interna da semente, ou a partir de uma semente que é passada por "condicionamento osmótico"; isto é, uma semente que iniciou a germinação, mas foi adequadamente colocada em condições favoráveis pendente de estase para completar o processo de germinação. Os versados nessas técnicas devem ser capazes de usar vários métodos de hidratação e otimizar a extensão do tempo de incubação antes da transformação. O explante inusitado resultante é esto- cável e pode germinar e/ou ser transformado quando as condições apropriadas são proporcionadas. Assim sendo, o novo explante de meristema seco e estocável pode ser referido com uma semente artificial.
[0046] Depois da excisão, os versados nessas técnicas podem estocar o explante de acordo com os métodos descritos, antes do uso subsequente. Os métodos e parâmetros para secar, estocar, e germinar sementes são conhecidos nessas técnicas (por exemplo, Senarat- na et al., 1983; Vertucci e Roos, 1990; Chai et al., 1998). A estocagem de meristemas excisados, de acordo com a presente invenção pode ser conduzida usando modificações dessas condições de estocagem, conforme desejado. Qualquer uma dessas condições pode ser usada conforme desejado, incluindo em temperaturas, por exemplo, entre cerca de -80 °C e cerca de 60 °C. Temperaturas de cerca de -20 °C até a temperatura ambiente em particular demonstraram funcionar bem, mas a invenção não está de forma alguma limitada a estas temperaturas.
[0047] Os dados descritos nos exemplos ilustram, por exemplo, que os explantes de sementes estocados que compreendem tecido meristemático podem permanecer viáveis e úteis para transformação genética subsequente e regeneração por semanas ou meses depois da excisão a partir das sementes (por exemplo, Exemplo 12). A manipulação da excisão, esterilização, estocagem, hidratação, reidratação, e parâmetros de transformação permite o desenvolvimento de protocolos de transformação de plantas, eficientes e automatizados com altos volumes de produção. As condições de reidratação, condicionamento osmótico, e hidratação também são apresentadas. Um protocolo típico para excisão com máquina pode envolver colocar as sementes por 15 minutos em uma solução lixiviadora de 200 ppm de Cl ativo, e em seguida, um período de 2 horas de nenhuma exposição a líquidos, e em seguida, uma hidratação durante a noite inteira em meio de germinação de grãos (BGM) ou uma solução lixiviadora de 50 ppm de Cl ativo.
[0048] Inúmeros parâmetros para obter e manusear explantes podem ser variados. Em uma modalidade, o método de excisão pode ser manual; em uma modalidade alternativa, excisão ocorre por um processo automatizado. Em outras modalidades, a esterilização pode ser realizada colocando uma semente ou explante em contato com um agente esterilizante líquido. A adição a um meio de cocultura (como INO) de nistatina (50 ppm) e tiabendazol (10 ppm) dissolvidos em DMSO (1,0 ml de DMSO por litro de INO) pode melhorar a saúde dos explantes, provavelmente controlando leveduras e fungos encontrados comumente em sementes e pode ser uma ferramenta útil quando se realiza cultura de tecido grande e/ou automatizada. Em uma modalidade alternativa, uma semente ou um explante pode ser colocado em contato com um agente esterilizante gasoso. Em uma modalidade alternativa, uma semente ou um explante pode ser colocado em contato com um agente esterilizante irradiante, tal como luz UV. Em uma mo-dalidade alternativa, uma semente ou um explante pode ser esterilizado submetendo a semente ou o explante a um breve período de altas temperaturas de modo a reduzir o vigor de contaminantes biológicos tais como bactérias e fungos adventícios sobre a superfície da semente ou do explante sem reduzir o vigor da semente ou do explante. Isto pode ser realizado em uma temperatura mais alta do que 40 C; de preferência, a temperatura é entre 40 C e 90 C. A temperatura pode ser aumentada, por exemplo, ar ou vapor d'água forçado. Tais temperaturas podem ser proporcionadas por secadores produzidos por Bry-Air Inc. (Sunbury, Ohio, EUA). Em ainda outra modalidade, o teor de umidade da semente na hora da excisão pode ser variado. Em ou-tra modalidade, a temperatura da semente na hora da excisão pode ser variada. Em outras modalidades, um parâmetro de estocagem depois da excisão pode ser variado. Por exemplo, em uma modalidade a umidade relativa sob a qual a estocagem do explante ocorre pode ser variada. Em outra modalidade, a temperatura de estocagem do explante pode ser variada. Em ainda outras modalidades, a extensão do tempo de estocagem do explante pode variar. Em ainda outras modalidades, a composição do meio no qual o explante é estocado pode variar. Os outros parâmetros que podem ser manipulados incluem composições dos meios de hidratação e reidratação, temperatura de incubação, extensão do tempo, e métodos de transformação, dentre outros.
[0049] Depois da excisão, a invenção fornece métodos e aparelhos para peneirar material de explante meristemático transformável a partir de explantes, cotilédones, revestimentos de sementes, e outros detritos danificados não-transformáveis. Os métodos podem ser realizados manualmente, ou podem ser parcial ou completamente mecanizados. Em certas modalidades, o processo de peneiração é substancialmente mecanizado. Por exemplo, uma ou mais etapas de peneira- ção podem ser realizadas, usando peneiras com o tamanho apropriado, baseado no tamanho das sementes que estão sendo esmagadas e os explantes que estão sendo isolados. O volume bruto de sementes esmagadas que atravessaram os roletes pode ser colocado através de uma série de peneiras de separação, de tal modo que os detritos grandes e pequenos indesejados sejam separados do explante desejado por exclusão de tamanho. Isto pode ser realizado eficazmente, por exemplo, com material de semente de algodão, usando peneiras do padrão norte-americano tais como: no 8 (abertura da 2,36 mm), no 10 (abertura de 2,0 mm), no 16 (abertura de 1,18 mm), e outras, conforme apropriado (por exemplo, peneiras com aberturas alongadas tais como 1/16" x 3/4", 1/18" x 3/4", 1/19" x 1/2", ou 1/20" x 1/2"). Peneiras com outros tamanhos de abertura podem ser fabricadas, conforme necessário, para dados tamanhos de sementes, baseado no tamanho do material que está sendo aplicado. A extensão de tempo para o processo de peneiração e o vigor da peneiração também podem ser ajustados para aumentar o volume de produção e/ou rendimento do processo.
[0050] Outros métodos de peneiração também podem ser utilizados, tais como medindo a flutuação diferencial em soluções de material de explante versus detritos. Uma fração do material que flutua em uma solução aquosa demonstrou ser enriquecida quanto a explantes intactos transformáveis. Um explante excisado a seco pode ser utilizado. Combinações desses métodos de peneiração também podem ser usadas. A fração de material com explantes transformáveis pode compreender tecidos meristemáticos e também outros tecidos, tais como partes de cotilédones. O explante deve conter, entretanto, pelo menos alguma região meristemática, de tal modo que tipicamente o explante possa produzir um botão ou broto dentro de 12 semanas desde o iní-cio de condições de crescimento apropriadas.
[0051] Em certas modalidades, os tecidos excisados e peneirados podem ser transformados com um gene heterólogo de interesse. Vários métodos foram desenvolvidos para transferir genes para dentro de tecido vegetal, incluindo microprojeção em alta velocidade, microinje- ção, eletroporação, captação direta de DNA e transformação mediada de forma bacteriana. As bactérias que reconhecidamente medeiam transformação de células vegetais incluem inúmeras espécies de Rhi- zobiaceae, incluindo, porém sem limitações, Agrobacterium sp., Si- norhizobium sp., Mesorhizobium sp., e Bradyrhizobium sp. (vide, por exemplo, Broothaerts et al., 2005; publicação de pedido de patente no US 2007/0271627). Os alvos para tal transformação têm sido frequen-temente tecidos de calos indiferenciados, embora o tecido diferenciado também tenha sido usado para transformação transiente e estável de plantas, e possa ser neste caso. A cocultura e etapas subsequentes podem ser realizadas em condições de escuridão, ou na luz, por exemplo, incubadoras Percival iluminadas, por exemplo, por 2 a 5 dias (por exemplo, um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de escuridão, com intensidade da luz > 5μ E, tal como cerca de 5-200 μ E ou outras condições de iluminação que permitem o desenvolvimento normal de plastídios) em uma temperatura de aproximadamente 23 a 25°C, e podem ser realizadas a até cerca de 35°C ou 40°C.
[0052] Ao desenhar um vetor para o processo de transformação, são selecionados um ou mais componentes genéticos que são introduzidos na célula ou tecido vegetal. Os componentes genéticos podem incluir qualquer ácido nucleico que é introduzido em uma célula ou tecido vegetal, usando o método de acordo com a invenção. Em uma modalidade, os componentes genéticos são incorporados em uma composição de DNA, tal como um plasmídeo recombinante de filamento duplo ou molécula de vetor que compreende pelo menos um ou mais dos seguintes tipos de componentes genéticos: (a) um promotor que funciona em células vegetais para causar a produção de uma sequência de RNA, (b) uma sequência de DNA estrutural que causa a produção de uma sequência de RNA que codifica um produto de utilidade agronômica, e (c) uma sequência de 3' DNA não-traduzida que funciona em células vegetais para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados à extremidade 3' da sequência de RNA.
[0053] O vetor pode conter inúmeros componentes genéticos para facilitar a transformação célula ou tecido vegetal e regular a expressão da sequência de ácidos nucleicos estrutural. Em uma modalidade preferida, os componentes genéticos são orientados de modo a expresser um RNAm, que, em uma modalidade opcional, pode ser traduzido em uma proteína. A expressão de uma sequência codificadora estrutural vegetal (um gene, DNAc, DNA sintético, ou outro DNA) que existe na forma de filamento duplo, envolve a transcrição de RNA mensageiro (RNAm) a partir de um filamento do DNA por enzima RNA polimerase e subsequente processamento do transcrito primário do RNAm dentro do núcleo. Este processamento envolve uma região 3' não-traduzida que adiciona nucleotídeos poliadenilados às extremidades 3' do RNAm. Os meios para preparar plasmídeos ou vetores que contêm os componentes genéticos desejados são bem conhecidos nessas técnicas.
[0054] Quando uma construção de DNA contém mais do que um T-DNA, estes T-DNA's e os transgenes contidos dentro podem ser integrados no genoma da planta em loci separados. Isso é referido como "cotransformação" (patente no US 5.731.179, documento no WO 00/18939). O processo de cotransformação, onde dois T-DNA's estão em loci diferentes no genoma da planta, e portanto, segregam independentemente na progênie, pode ser realizado por distribuição dos T- DNA's com uma mistura de Agrobacteria transformadas com plasmí- deos portadores do T-DNA separado. A cotransformação pode ser realizada também transformando uma cepa de Agrobacterium com duas construções de DNA binárias, cada uma contendo um T-DNA (por exemplo, Daley et al., 1998). Dois T-DNA's podem ser também desenhados em um único vetor de DNA, e em seguida, transformando o vetor em uma célula vegetal e depois identificando as células ou plantas transgênicas que integraram os T-DNA's em loci diferentes (patente no US 5.731.179, documento no WO 00/18939, Komari et al, 1996; patente no 7.288.694).
[0055] Um sistema com dois T-DNA é um método útil para segregar o gene marcador do gene agronomicamente importante de interesse (GOI) em uma planta transgênica. O gene marcador não tem geralmente qualquer utilidade adicional depois que ele foi usado para selecionar ou eleger ou escolher a célula vegetal transformada. Um vetor com um único DNA portando os dois T-DNA's é um método para construir um sistema de transformação com dois T-DNA's. Entretanto, por causa da ocorrência de ambos T-DNA's em uma única construção de DNA, ambos podem ser transferidos para o genoma da planta no mesmo locus. Isto ocorre quando uma das moléculas do DNA da borda do primeiro T-DNA não é reconhecida durante o processo de integração. Esta eficiência reduzida se soma ao custo para produzir os eventos e selecionar quanto aos indivíduos que têm T-DNA's integrados em um locus independente. Pode ser, assim, desejável ter construções de DNA e um método no qual é possível selecionar quimicamente contra indivíduos que incorporaram os dois T-DNA's no mesmo locus, e ao mesmo tempo, selecionar quanto à presença/ausência e estado de ligação de cada um dos T-DNA's.
[0056] A transcrição do DNA no RNAm é regulada por uma região do DNA usualmente referida como o "promotor". A região promotora contém uma sequência de bases que sinaliza RNA polimerase para associar com o DNA e para iniciar a transcrição no RNAm usando um dos filamentos do DNA como um modelo para produzir um filamento complementar correspondente de RNA. Inúmeros promotores que são ativos em células vegetais foram descritos na literatura. Tais promotores incluiriam, porém sem limitações, os promotores de nopalina sin- tase (NOS) e octopina sintase (OCS) que são carregados em plasmí- deos Ti de Agrobacterium tumefaciens, os promotores de caulimovírus tais como os promotores do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 19S e 35S o promotor do vírus do mosaico da escrofulária (FMV) 35S, e o promotor intensificado de CaMV35S (e35S). Vários outros promotores de genes de plantas, que são regulados em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou desenvolvimentais, também po-dem ser usados para a expressão de genes heterólogos em células vegetais, incluindo, por exemplo, promotores regulados por (1) calor (Callis et al., 1988, (2) luz (por exemplo, promotor RbcS-3A da ervilha, Kuhlemeier et al., (1989); promotor RbcS do milho, Schaffner et al., (1991); (3) hormônios, tal como ácido abscísico (Marcotte et al., 1989, (4) ferimento (por exemplo, Wuni, Siebertz et al., 1989); ou outros sinais ou produtos químicos. A expressão específica de tecidos também é conhecida. Como descrito abaixo, prefere-se que o promotor específico selecionado seja capaz de causar expressão suficiente para resultar na produção de uma quantidade eficaz do produto gênico de interesse. Os exemplos que descrevem tais promotores incluem, sem limitações, patente no US 6.437.217 (promotor RS81 do milho), patente no US 5.641.876 (promotor de actina do arroz), patente no US 6.426.446 (promotor RS324 do milho), patente no US 6.429.362 (promotor PR-1 do milho), patente no US 6.232.526 (promotor A3 do milho), patente no US 6.177.611 (promotores constitutivos do milho), patentes nos US 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S), patente no US 6.433.252 (promotor de oleosina L3 do milho), patente no US 6.429.357 (promotor de actina 2 do arroz bem como um íntron de acti- na 2 do arroz), patente no US 5.837.848 (promotor específico de raiz), patente no US 6.294.714 (promotores induzíveis por luz), patente no US 6.140.078 (promotores induzíveis por sais), patente no US 6.252.138 (promotores induzíveis por patógenos), patente no US 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo), patente no US 6.635.806 (promotor de gama-coixina), e pedido de patente no de série US 09/757.089 (promotor de cloroplasto aldolase do milho). Os promotores adicionais que podem encontrar uso são um promoter de nopalina sintase (NOS) (Ebert et al., 1987), o promotor de octopina sintase (OCS) (que é transportado em plasmídeos indutores de tumores de Agrobacterium tumefaciens), os promotores de caulimovírus tais como o promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al., 1987), promotor 35S de CaMV (Odell et al., 1985), o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária (Walker et al., 1987; patentes nos US 6.051.753; 5.378.619), o promotor de sacarose sin- tase (Yang et al., 1990), o promotor do complexo do gene R (Chandler et al., 1989), e o promotor do gene da proteína ligante clorofila a/b, PClSV (patente no US 5.850.019), e promotores AGRtu.nos (Número de Acesso do GenBank V00087; Depicker et al, 1982; Bevan et al., 1983).
[0057] Os híbridos de promotores também podem ser construídos para intensificar a atividade transcricional (patente no US 5.106.739), ou para combinar atividade transcricional desejada, induzibilidade e especificidade de tecido ou especificidade desenvolvimental. Os promotores que funcionam em plantas incluem, porém sem limitações, promotores que são induzíveis, virais, sintéticos, constitutivos como descritos, e temporalmente regulados, espacialmente regulados, e regulados espacialmente e também temporalmente. Outros promotores que são intensificados por tecidos, específicos de tecidos, ou regulados de forma desenvolvimental também são conhecidos nessas técnicas e previstos como tendo utilidade na prática desta invenção.
[0058] Os promotores usados nas construções de DNA (isto é, genes de plantas quiméricas/recombinantes) da presente invenção podem ser modificados, caso desejado, para afetar suas características de controle. Os promotores podem ser derivados por meios de ligação com regiões de operador, mutagênese aleatória ou controlada, etc. Além disso, os promotores podem ser alterados para conter múltiplas "sequências intensificadoras" para auxiliar em elevar a expressão gê- nica.
[0059] O RNAm produzido por uma construção de DNA da presente invenção pode conter também uma sequência-líder 5' não-traduzida. Esta sequência pode ser derivada a partir do promotor selecionado para expressar o gene e pode ser especificamente modificada de modo a aumentar ou diminuir a tradução do RNAm. As regiões 5' não- traduzidas podem ser obtidas a partir de RNA's virais, a partir de genes eucarióticos apropriados, ou a partir de uma sequência gênica sintética. Tais sequências "intensificadoras" podem ser desejáveis para aumentar ou alterar a eficiência da tradução do RNAm resultante. A presente invenção não está limitada às construções nas quais a região não-traduzida é derivada a partir sequência 5' não-traduzida que acompanha a sequência promotora. Ao invés disso, a sequência-líder não-traduzida pode ser derivada a partir de promotores ou genes não relacionados (vide, por exemplo, patente no US 5.362.865). Os exemplos de sequências-líderes não-traduzidas incluem líderes de proteínas de choque térmico do milho e petúnia (patente no US 5.362.865), líderes de proteínas do revestimento viral vegetal, líderes da rubisco de plantas, GmHsp (patente no US 5.659.122), PhDnaK (patente no US 5.362.865), AtAnt1, TEV (Carrington e Freed, 1990), e AGRtu.nos (No de Acesso GenBank V00087; Bevan et al., 1983). Outros componentes genéticos que servem para intensificar a expressão ou afetar a transcrição ou tradução de um gene também estão previstos como componentes genéticos.
[0060] A região 3' não-traduzida das construções quiméricas pode conter um terminador transcricional, ou um elemento que tem função equivalente, e um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados à extremidade 3' do RNA. As sequências de DNA são aqui referidas como regiões de terminação da transcrição. As regiões são necessárias para a poliadeni- lação eficiente do RNA mensageiro transcrito (RNAm). A RNA polime- rase transcreve uma sequência de DNA codificadora através de um sítio onde a poliadenilação ocorre. Os exemplos de regiões 3' regiões apropriadas são (1) as regiões 3' transcritas, não-traduzidas que contêm o sinal de poliadenilação genes de plasmídeos indutores de tumores (Ti) de Agrobacterium, tais como o gene de nopalina sintase (NOS; Fraley et al., 1983), e (2) os genes de plantas tais como os genes de proteínas de armazenamento de soja e a subunidade pequena do gene de ribulose-1, 5-bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO). Um exemplo de uma região 3' preferida é aquela do gene ssRUBISCO E9 da ervilha (pedido de patente europeu no 0385 962).
[0061] Em uma modalidade, o vetor contém um gene selecionável, ou capaz de ser triado ou marcado. Estes componentes genéticos são aqui referidos também como componentes genéticos funcionais, pois eles produzem um produto que serve para uma função na identificação de uma planta transformada, ou um produto de utilidade agronômica. O DNA que serve como um dispositivo de seleção ou triagem pode funcionar em um tecido vegetal regenerável para produzir um composto que conferiria depois a resistência do tecido vegetal a um composto de outra forma tóxico. Inúmeros genes marcadores capazes de serem triados ou selecionados são conhecidos nessas técnicas e podem ser usados na presente invenção. Os genes de interesse para uso como um gene capaz de ser selecionado, triado ou marcado incluiriam, porém sem limitações, gus, proteína verde fluorescente (gfp), luciferase (lux), dentre outros. Em certas modalidades, o vetor compreende um gene aadA com elementos reguladores associados que codificam resistência à espectinomicina em células vegetais. Em uma modalidade específica, o gene aadA compreende uma sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP) que direciona o transporte do produto gênico AadA para o cloroplasto de uma célula vegetal transformada. Em outras modalidades, o vetor compreende um gene de resistência à espectinomicina com elementos reguladores apropriados desenhados para a expressão em uma célula bacteriana, tal como uma célula de Agrobacterium, de tal modo que o reagente de seleção possa ser adicionado a um meio de cocultivo, e permitir a obtenção de plantas transgênicas, por exemplo, sem uso adicional do agente seletivo depois do período de cocultura.
[0062] A presente invenção pode ser usada com qualquer plasmí- deo ou vetor apropriado de transformação de plantas que contém um marcador selecionável ou capaz de ser triado e elementos reguladores associados, como descrito, junto com um ou mais ácidos nucleicos expressados de uma maneira suficiente para conferir um traço desejável específico. Os exemplos de genes estruturais apropriados de interesse agronômico previstos pela presente invenção incluiriam, porém sem limitações, genes para tolerância a doenças, insetos ou pragas, tolerância a herbicidas, genes para melhoras de qualidades tais como rendimento, intensificação nutricional, tolerância ao meio ambiente ou tensão, ou quaisquer mudanças desejáveis na fisiologia das plantas, crescimento, desenvolvimento, morfologia de plantas, ou produto ou produtos vegetais, incluindo produção de amido (patentes n— US 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), produção de óleos modificados (patentes nos US 6.444.876; 6.426.447; 6.380.462), alta produção de óleos (patentes nos US 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; 6.476.295), teor modificado de ácidos graxos (patentes nos US 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; 6.459.018), alta produção de proteínas (patente no US 6.380.466), amadurecimento de frutos (patente no US 5.512.466), maior nutrição animal e humana (patentes nos US 6.723.837; 6.653.530; 6.541.259; 5.985.605; 6.171.640), biopolímeros (patentes nos US RE37,543; 6.228.623; 5.958.745 e publicação de patente no US 2003/0028917). Além disso, resistência a stress ambiental (patente no US 6.072.103), peptídeos farmacêuticos e peptídeos secre- táveis (patentes nos US 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075; 6.080.560), traços de melhor processamento (Patente número US 6,476,295), melhor digestibilidade (patente no US 6.531.648) baixo teor de rafinose (patente no US 6.166.292), produção industrial de enzimas (patente no US 5.543.576), melhor sabor (patente no US 6.011.199), fixação de nitrogênio (patente no US 5.229.114), produção de sementes híbridas (patente no US 5.689.041), produção de fibras (patentes nos US 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; 5.869.720) e produção de biocom- bustíveis (patente no US 5.998.700). Qualquer um destes ou outros elementos genéticos, métodos, e transgenes podem ser usados com a invenção, como deve ser avaliado pelos versados nessas técnicas tendo em vista a presente invenção.
[0063] Alternativamente, as sequências de DNA de interesse podem afetar estes fenótipos codificando uma molécula de RNA que causa a inibição direcionada da expressão de um gene endógeno por intermédio de tecnologias silenciadoras de genes, tais como mecanismos mediados por antisense, co-supressão, tecnologias de RNAi incluindo RNAmi (por exemplo, publicação do pedido de patente no US 2006/0200878).
[0064] Os ácidos nucleicos exemplificativos que podem ser introduzidos pelos métodos englobados pela presente invenção incluem, por exemplo, sequências de DNA ou genes de outras espécies, ou mesmo genes ou sequências que se originam ou estão presentes na mesma espécie, mas são incorporadas em células recebedoras por métodos de engenharia genética ao invés de métodos técnicas clássicas de reprodução ou criação. Entretanto, o termo "exógeno" pretende incluir também referência a genes que não estão normalmente presentes na célula que está sendo transformada ou talvez simplesmente não presentes na forma, estrutura, etc., como encontrados no segmento de DNA em transformação ou gene, ou genes que estão normalmente presentes ainda que se deseje, por exemplo, tenham sido superex-pressado. Assim sendo, o termo gene ou DNA "exógeno" pretende referir-se a qualquer gene ou segmento de DNA que é introduzido em uma célula recebedora, independentemente de se um gene similar já possa estar presente nesta célula. O tipo de DNA incluído no DNA exógeno pode incluir o DNA que já está presente na célula vegetal, DNA de outra planta, DNA de um organismo diferente, ou um DNA gerado externamente, tal como uma sequência de DNA que contém uma mensagem antisenso de um gene, ou uma sequência de DNA que codifica uma versão sintética ou modificada de um gene.
[0065] Em uma modalidade, a transformação de tecido vegetal é realizada por métodos mediados por Agrobacterium ou outra Rhizobia, e as sequências de DNA de interesse estão presentes em um ou mais T-DNA's (patentes nos US 6.265.638, 5.731.179; publicações de pedidos de patentes nos US 2005/0183170; 2003/110532), ou outra sequência (por exemplo, esqueleto de vetor) que é transformada em uma célula vegetal. Os T-DNA's que podem ser ligados por sequências RB e/ou LB, ou podem não sequências de extremidade (border). As sequências que podem ser transferidas para dentro de uma célula vegetal podem estar presentes em um vetor de transformação em uma cepa bacteriana que está sendo utilizada para transformação. Em outra modalidade, as sequências podem estar presentes em vetores de transformação separados na cepa bacteriana. Em ainda outra modalidade, as sequências podem ser encontradas em células ou cepas bac- terianas separadas usadas conjuntamente para transformação.
[0066] As construções de DNA usadas para transformação nos métodos da presente invenção contêm também geralmente os segmentos de DNA do esqueleto do plasmídeo, que fornecem a função de replicação e seleção com antibióticos em células bacterianas, por exemplo, uma origem de replicação de Escherichia coli, tal como ori322, uma origem de replicação de Agrobacterium, tal como oriV ou oriRi, e uma região codificadora para um marcador selecionável tal como Spec/Strp que codifica aminoglicosídeo adeniltransferase Tn7 (aadA) que confere resistência a espectinomicina ou estreptomicina (vide, por exemplo, patente no US 5.217.902; ou Sandvang, 1999). Para a transformção de plantas, a cepa bacteriana hospedeira é frequentemente Agrobacterium tumefaciens ABI, C58, LBA4404, AGLO, AGL1, EHA101, e EHA105 portadora de um plasmídeo que tem uma função de transferência para a unidade de expressão. Outras cepas conhecidas pelos versados nessas técnicas de transformação de plantas podem funcionar na presente invenção.
[0067] A distribuição gênica mediada de forma bacteriana (por exemplo, mediada por Agrobacterium; patentes nos US 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840) pode ser feita em células no meristema vivo de um embrião excisado de uma semente (por exemplo, patente no US 6.384.301), e região meristemática pode ser cultivada na presença de um agente de seleção, tal como espectino- micna. O resultado desta etapa é a terminação ou pelo menos o retardamento do crescimento da maioria das células para dentro das quais a construção genética estranha não foi distribuída com a formação simultânea de brotos, que se originam a partir de uma única célula me- ristemática transformada, ou pequeno agregado de células, incluindo células meristemáticas transformadas. Em modalidades específicas, o meristema pode ser cultivado na presença de espectinomicina, estrep- tomicina ou outro agente seletivo, para cuja tolerância é codificado pelo gene aadA. Os exemplos de vários marcadores selecionáveis e genes que proporcionam resistência contra eles estão descritos em Miki e McHugh, 2004.
[0068] À luz deste relatório descritivo, inúmeros outros elementos reguladores possíveis e outras sequências de interesse devem ficar evidentes para os versados nessas técnicas. Portanto, a discussão precedente pretende ser exemplificativa e não exaustiva.
[0069] Marcadores peneiráveis ou classificáveis podem ser empregados para identificar setores e/ou plantas transgênicas. Os marcadores exemplificativos são conhecidos e incluem β-glicuronidase (GUS) que codifica uma enzima para vários substratos cromogênicos (Jefferson et al., 1987a; Jefferson et al., 1987b); um gene de locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de anto- cianina (cor vermelha) em tecidos de plantas (Dellaporta et al., 1988); um gene de β-lactamase (Sutcliffe et al., 1978); um gene que codifica uma enzima para os vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene de luciferase (Ow et al., 1986); um gene xy1E (Zukowsky et al., 1983) que codifica uma catecol dioxigenase ue pode converter catecóis cromo- gênicos; um gene de α-amilase (Ikatu et al., 1990); um gene de tirosi- nase (Katz et al., 1983) que codifica uma enzima capaz de oxidar tiro- sina para DOPA e dopaquinona, que por sua vez condensa para me- lanina; proteína verde fluorescente (Elliot et al., 1999) e uma α- galactosidase. Como é do conhecimento nessas técnicas, outros métodos para a transformação de plantas podem ser utilizados, por exemplo, como descrito por Miki et al., (1993), incluindo o uso de bombardeio de microprojéteis (por exemplo, patente no US 5.914.451; McCabe et al., 1991; patentes nos US 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880).
[0070] São conhecidos vários meios de cultura de tecidos, os quais, quando suplementados adequadamente, suportam o crescimento e desenvolvimento de tecidos, incluindo a formação de plantas maduras a partir de meristemas excisados. Estes meios de cultura de tecidos podem ser adquiridos como uma preparação comercial ou preparada especialmente, e modificada pelos versados nessas técnicas. Os exemplos desses meios incluem, porém sem limitações, aqueles descritos por Murashige e Skoog, (1962); Chu et al., (1975); Linsmaier e Skoog, (1965); Uchimiya e Murashige, (1962); Gamborg et al., (1968); Duncan et al., (1985); McCown e Lloyd, (1981); Nitsch e Nitsch (1969); e Schenk e Hildebrandt, (1972), ou derivações desses meios suplementados adequadamente. Os versados nessas técnicas estão cientes que os meios e suplementos de meios tais como nutrientes e reguladores do crescimento para uso em transformação e regeneração são usualmente otimizados para a cultura-alvo ou variedade-alvo de interesse. Os meios de cultura de tecidos podem ser suplementados com carboidratos tais como, porém sem limitações, glicose, sacarose, maltose, manose, frutose, lactose, galactose, dextrose, ou proporções de carboidratos. Os reagentes estão disponíveis no mercado e podem ser adquiridos de inúmeros fornecedores (vide, por exemplo, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; e PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS).
[0071] As plantas transgênicas podem ser regeneradas a partir de uma célula vegetal transformada por métodos e composições aqui descritas, tais como, porém sem limitações, os Protocolos "A" até "D" com espectinomicina, como realizados em soja, milho, algodão ou canola. Uma planta transgênica formada usando métodos de transformação com Agrobacterium contém tipicamente (porém nem sempre) uma única sequência de DNA recombinante simples inserida dentro de um cromossoma e é referida como um evento transgênico. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como sendo heterozigotos para a sequência exógena inserida. Um homozigoto de planta transgênica com relação a um transgene pode ser obtido por reprodução sexuada (autocruzamento ou selfing) de uma planta transgênica segregante independente que contém uma única sequência gênica exógena para si própria, por exemplo, uma planta R0, para produzir uma semente R1. Um quarto da semente R1 produzida será homozigótico com rela-ção ao transgene. A semente R1 germinante resulta em plantas que podem ser testadas quanto à zigosidade, usando tipicamente um ensaio SNP ou um ensaio de ampliação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigosidade).
[0072] Para confirmar a presença do DNA exógeno ou "transge- ne(s)" nas plantas transgênicas, uma série de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de "biologia molecular", tais como Southern e Northern blotting e PCR®; ensaios "bioquímicos", tais como detecção da presença de um produto proteico, por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e Western blots) ou por função enzimática (por exemplo, ensaio GUS); histoquímica de pólens; ensaios de parte de plantas, tais como ensaios de folha ou raiz; e também analisando o fenótipo da planta regenerada total.
[0073] Depois que um transgene foi introduzido em uma planta, este gene pode ser introduzido em qualquer planta sexualmente compatível com a primeira planta por cruzamento, sem a necessidade de sempre transformar diretamente a segunda planta. Portanto, como aqui utilizado, o termo "progênie" denota a descendência de qualquer geração de uma planta parental preparada de acordo com a presente invenção, onde a progênie compreende uma construção de DNA selecionada. Uma "planta transgênica" pode ser, assim, de qualquer geração. O "cruzamento" de uma planta para produzir uma linhagem de planta que tem um ou mais transgenes ou alelos adicionados em relação a uma linhagem de planta originária é definido como as técnicas que resultam em uma sequência específica que está sendo introduzida em uma linhagem de planta cruzando uma linhagem de partida com uma linhagem de planta doadora que compreende um transgene ou alelo. Para conseguir isto poder-se-ia, por exemplo, realizar as seguintes etapas: (a) plantar sementes da primeira (linhagem de partida) e segunda (linhagem de planta doadora que compreende um transgene ou alelo desejado) plantas parentais; (b) desenvolver as sementes da primeira e segunda plantas parentais para dar plantas portadoras de flores; (c) polinizar uma flor da primeira planta parental com pólen da segunda planta parental; e (d) colher sementes produzidas na planta parental portadora da flor fertilizada.
[0074] A presente invenção fornece também partes de planta ou uma planta produzida pelos métodos da presente invenção. As partes da planta, sem limitações, incluem fruto, semente, endosperma, óvulo, pólen, folha, talo, e raízes. Em uma modalidade preferida da presente invenção, a parte da planta é uma semente.
[0075] Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência que codifica um polipeptídeo que compreende uma fusão traduzida de peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP)-aadA. Em certas modalidades, o ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 2.
EXEMPLOS
[0076] Os versados nessas técnicas devem avaliar as muitas vantagens dos métodos e composições fornecidas pela presente invenção. Os exemplos que se seguem são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Os versados nessas técnicas devem avaliar que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionar bem na prática da invenção, e assim sendo, podem ser considerados como constituindo modos preferidos para sua prática. Entretanto, os versados nessas técnicas, à luz do presente relatório descritivo, avaliam que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas descritas e ainda assim obter um resultado semelhante ou similar sem fugir do espírito e âmbito da invenção. Todas referências aqui citadas são aqui incorporadas como referência até o grau em que elas suplementam, explicam, fornecem um fundamento para enunciar a metodologia, técnicas ou composições aqui empregadas.
EXEMPLO 1 Preparação de Explante e Material de Inoculação A. Soja
[0077] Para obter material de explante meristemático, sementes de soja (por exemplo, cv. A3525; Asgrow Seed Company) foram processadas para separar o embrião, compreendendo tecidos meristemá- ticos, a partir de outros tecidos, incluindo o revestimento de semente e cotilédone(s). A preparação manual de explantes fornece tecido que é apropriado para transformação mediada por Agrobacterium de meris- temas de soja (patente no US 6.384.301), e os métodos de transformação mediados por partículas (patente no US 5.914.451) são conhecidos. Os métodos mecânicos para extrair explantes também foram descritos na publicação do pedido de patente no US 2005/0005321 e publicação do pedido de patente no US 2006/0059589. Todos estes métodos resultam em um explante de meristema que é suficientemente transformável pelos métodos descritos.
B. Algodão
[0078] Sementes de algodão foram processadas mecanicamente para excisar e isolar seus tecidos meristemáticos. Alternativamente, os explantes de algodão podem ser preparados por excisão do eixo embrionário da semente, cotilédones, e hipocotilédones (por exemplo, McCabe e Martinell, 1993). Para obter material de explante meristemá- tico transformável, as sementes de algodão (por exemplo, dos genóti- pos STN474 (Stoneville Pedigreed Seed Co., Stoneville, MS), Delta Pearl (Delta and Pine Land Co., Scott, MS), DP5415, DP393, 00S04 (Delta and Pine Land Co.), SureGrow501 ou SureGrow747 (Sure Grow Cotton Seed Company, Maricopa, AZ) foram processadas como se segue, para separar o embrião, compreendendo tecidos meristemáti- cos, do revestimento da semente e cotilédone(s). As sementes de al-godão foram removidas da estocagem a 4 oC ou -20 oC e levadas para a temperatura ambiente. As sementes foram pesadas, colocadas dentro de uma unidade germinadora estéril, e esterilizadas na superfície em Clorox a 50% (hipoclorito de sódio) por 5 min. As sementes foram então enxaguadas 3 vezes com água destilada esterilizada e re- hidratadas em um meio de hidratação líquido (CSM) a 28 °C no escuro por cerca de 18 h (faixa de 14 a 42 horas). Alternativamente, uma temperatura de germinação pode ser mais baixa, por exemplo, cerca de 23 °C. O meio CSM continha 200 mg/L de carbenici lina (Phyo- Technology Laboratories, Shawnee Mission, KS), 125 mg/L de cefota- xima (Midwest Scientific, St. Louis, MO), 30 mg/L de BRAVO 75 (Carlin, Milwaukee, WI) e 30 mg/L de Captan 50 (Carlin). Outras soluções também foram usadas com sucesso para hidratar as sementes de algodão, incluindo água desmineralizada estéril, contendo uma concentração fraca de água sanitária tipicamente 50 a 1.000 ppm de hipoclori- to de sódio. Depois da hidratação, as sementes podem ser usadas imediatamente ou estocadas em temperaturas de refrigeração durante até uma semana antes de processamento adicional. A excisão mecânica de explantes de algodão também pode ser utilizada (documento no WO92/15675; Keller et al., 1997; McCabe & Martinell, 1993; publicação de patente no US 2005/0005321).
C. Preparação de Agrobacterium para inoculação e cocultivo
[0079] A cepa de Agrobacterium C58, contendo um vetor binário com um ou dois cassetes de expressão de planta, como descrito acima, foi inoculada a partir de um insumo em glicerina, dentro de um meio LB líquido (10 g/L de cloreto de sódio, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de bacto-triptona), contendo 75 mg/mL de espectinomicina e 50 mg/mL de canamicina. A cultura líquida foi deixada crescer a 28 °C a 200 rpm em um vascolejador rotativo durante a noite inteira. Depois que a densidade óptica (DO660) da cultura noturna atingiu a faixa-alvo de 0,4-1,2, a cultura bacteriana foi centrifugada a 3.500 rpm por aproximadamente 20-25 min para peletizar as células.
[0080] Depois da remoção do sobrenadante, o pélete foi recolocado em suspensão em 10 mL de um meio de inoculação (INO, Tabela 1). A DO660 (uma medição indireta da concentração bacteriana) foi medida e diluída e ajustada até DO660 de cerca de 0,28-0,32. Depois que as culturas de Agrobacterium são preparadas, os explantes de planta são expostos ao inóculo, brevemente expostas a energia de ultrassom a partir de aparelho de ultrassom para limpeza com banho de água de laboratório padronizado, tal como L&R Ultrasonics QS140 (L&R Manufacturing Co., Kearny, NJ); ou um aparelho de ultrassom Honda W113 (Honda, Denshi Japão) por 20 segundos a 2 minutos, dependendo do tipo de explante. Depois da breve etapa de ultrassom, os explantes são drenados para remover o inóculo e transferidos para PLANTCONs frescos, cada um contendo 5 mL de meio INO e um pedaço de papel de filtro, usualmente dentro de várias horas depois do começo da transfecção. Os explantes são então incubados em uma câmara iluminada (geralmente 16 horas de luz a > 5uE) a aproximadamente 23 a 28 oC por 1 a 5 dias. Vários estudos de expressão transiente de GUS indicaram que uma DO660 de 0,3-0,8 do inóculo produziu uma proporção comparativamente mais alta de transformação me- ristemática e expressão de transgene, embora medições mais baixas e mais altas de DO660 também resultem resultados experimentais exito- sos.Tabela 1. Composição do meio de inoculação
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EXEMPLO 2 Transformação de Explantes de Soja - Tratamento com Citocinina
[0081] Para transformação de soja mediada por Agrobacterium, foi preparado um inóculo da cepa ABI (C58) que abriga um vetor binário, tal como pMON96999, que contém um gene marcador de gus e um gene aadA que confere resistência a espectinomicina, pMON101343 que contém os genes CP4 EPSPS e GUS, ou pMON77404 que contém um gene marcador gfp e um gene que codifica CP4 EPSPS que confere tolerância a glifosato, ou pMON73737 que contém um gene marcador gfp e um gene de DMO que confere tolerância a dicamba.
[0082] pMON96999 (Figura 2) contém o gene uidA sob o controle de um promotor intensificado de CaMV35S (patentes n— US 5.322.938; 5.352.605; 5.359.142; e 5.530.196), uma sequência líder 35S, e uma região 3' não-traduzida do gene de nopalina sintase a partir de Agrobacterium tumefaciens (No de Acesso do Genbank E01312), e um gene aadA com alvo nuclear para conferir resistência a especti- nomicina (patente no US 5.217.902; (SEQ ID NO:1)). O produto do gene de adeniltransferase aadA foi assestado para o cloroplasto por um peptídeo de trânsito de cloroplasto de Arabidopsis EPSPS (ShkG- CTP2 Klee et al., 1987.), e estava sob o controle do promotor para o fator de alongamento de Arabidopsis EF-1alfa (Tsf1; pedido de patente no US 2005/0022261) com um intensificador de FMV-35S, um líder Tsf1 (éxon 1), um íntron Tsf1, e uma região 3' não-traduzida de rbcS2 da ervilha.
[0083] A adição de uma citocinina, tidiazuron (TDZ) ou BAP em várias concentrações, foi testada durante a inoculação/cocultivo, bem como depois. Depois da inoculação, o cocultivo foi conduzido por cerca de 2-5 dias (por exemplo, 3 dias) em uma incubadora Percival a cerca de 23 °C com um foto período de 16 hora de lu z/8 horas de escuridão (intensidade da lux > 5 μ E). Assim sendo, a resposta de explantes à citocinina foi testada, e os efeitos dos diferentes tratamentos sobre a indução de múltiplos brotos e produção de eventos foram avaliados.
A. Efeito do tratamento com citocinina com o uso de glifosato ou di- camba como agente seletivo.
[0084] Para o tratamento com TDZ durante a inoculação e coculti- vo, os explantes de soja foram inoculados com a cepa de Agrobacterium ABI que abriga pMON77404 (contendo genes que codificam CP4 EPSPS e GFP), ou pMON101343 (contendo CP4 EPSPS e GUS), e cocultivados com o inóculo suplementado com diferentes níveis da ci- tocinina por 3 dias. Depois do cocultivo, os explantes foram transferi-dos para o meio de seleção (WPM; Tabela 2) contendo 200 mg/L de carbenicilina e cefotaxima, 100 mg/L de timentina para inibir o crescimento de Agrobacterium e outros contaminantes, e glifosato 75 μM ou 0,01 mg/L de dicamba para seleção. Cerca vinte e três dias depois, os explantes foram examinados sob um microscópio equipado com um conjunto de filtros para detectar tecido que expressa GFP, ou examinados quanto à expressão de GUS, conforme apropriado. Como indicado na Tabela 3, mais explantes tratados com TDZ tinham desenvolvido botões que expressam GFP ou brotos jovens em comparação com os explantes não-tratados. O efeito está relacionado à concentração. Neste caso, o marcador selecionável utilizado conferiu tolerância a glifosato.Tabela 2. Composição de WPM usado para a transformação de soja com seleção com glifosato; para seleção com dicamba, o glifosato foi substituído por 0,01mg/L de dicamba
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Tabela 3. Efeito de tratamentos com TDZ durante a inoculação e co- cultivo sobre o desenvolvimento de botões/brotos transgênicos (GFP-positivos) na transformação de soja usando seleção com glifosato
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[0085] Resultados similares foram observados quando os explantes de soja foram tratados com TDZ depois da inoculação e cocultivo, por exemplo, durante a fase de "retardamento" ou seleção da cultura de tecido.
[0086] Entretanto, experimentos adicionais demonstraram que o uso de TDZ (por exemplo, durante a inoculação/cocultura) com glifosa- to como o agente seletivo resultou em um decréscimo no número de brotos de soja enraizados transformados, em relação ao número obtido na ausência de TDZ, como indicado na Tabela 4.Tabela 4. Resultados da transformação de experimentos de seleção com glifosato, comparando diferentes níveis de TDZ no meio de inocu- lação/cocultura
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[0087] O efeito do tratamento com citocinina tratamento sobre a frequência de transformação também foi avaliado usando construções de DNA que codificam tolerância a outro agente seletivo, dicamba. pMON73737, que codifica os genes de GFP e DMO, foi utilizado. Depois do cocultivo, os explantes foram cultivados por 4 dias sobre um meio que contém 0,01 mg/L de dicamba, com ou sem BAP ou TDZ, como indicado na Tabela 5. O tratamento com BAP ou TDZ resultou em um aumento no número de explantes que apresentavam botões GFP-positivos em um estágio precoce, tal como 24 dias depois da ino-culação ("DAI", Tabela 5).Tabela 5. Efeito de tratamentos com BAP e TDZ por 4 dias depois do cocultivo sobre o desenvolvimento de botões transgênicos (GFP- positivos) na transformação de soja usando seleção com dicamba
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[0088] Os explantes tratados com TDZ não apresentaram forte dominância apical e produziram mais brotos (múltiplos brotos repetitivos), como observado em vários experimentos. Em contraste, os explantes não-tratados apresentaram mais crescimento dos brotos primários (o resultado de dominância apical) e produziram menos brotos. Esses brotos também possivelmente se desenvolveram a partir de brotos axilares. Portanto, a frequência de transformação resultante foi mais baixa em comparação com os explantes tratados com TDZ. Entretanto, o crescimento (por exemplo, alongamento) dos brotos resultantes da transformação de explantes de soja que sofreram seleção em meio que contém glifosato ou dicamba foi retardado. Usando seleção com glifosato, o tempo entre a inoculação e a subsequente colhei- ra de sementes R1 transformadas foi de cerca de 7 meses, e o tempo para o desenvolvimento de brotos enraizados transformados foi de cerca de 10-12 semanas. A adição de uma citocinina (BAP ou TDZ) com seleção com dicamba não teve qualquer efeito visível sobre as frequências de transformação finais (TFs) obtidas, embora ela resultasse na produção de mais botões GFP-positivos em um estágio pre-coce, como indicado na Tabela 5.
B. Efeitos do tratamento com citocinina com o uso de espectinomicina como agente seletivo
[0089] Os explantes foram inoculados com Agrobacterium em meio de inoculação (Tabela 1) por ultrassom durante 20 segundos, e depois cultivados sobre meio de cocultura que é igual ao meio de inoculação, como descrito no Exemplo 1. O meio para inoculação e cocul- tura era suplementado com 2 mg/L de TDZ. Os explantes foram cocul- tivados por 4 dias a cerca de 23 °C, com um fotoper íodo de 16 h de luz/8 h de escuridão. Depois da cocultura, 12 mL de meio de líquido de retardamento, que é igual ao meio WPM indicado na Tabela 2 exceto que não solidificado com Agargel e sem um agente seletivo (glifosato, dicamba ou espectinomicina), foram adicionados a cada PLANTCON® (MP Biomedicals, Solon, OH) contendo os explantes. Os explantes foram cultivados no meio de retardamento por 4 dias (28 °C, com um fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão). Para a seleção e indução de brotos, os explantes foram transferidos para o mesmo meio líquido, mas sem a adição de diferentes níveis de espectinomicina (25-250 mg/L de espectinomicina). Os explantes foram implantados individualmente dentro das frestas da esponja de espuma no recipiente do PLANTCON. Cada recipiente continha 60 mL de meio e um pedaço de esponja de espuma que retém cerca de 25 explantes.
[0090] Em todos tratamentos, os explantes desenvolveram múltiplos botões e brotos. As amostras de explantes e tecidos resultantes foram coletadas e testadas quanto à atividade de GUS em diferentes estágios. Quando o tecido do explante transformado com um gene aa- dA e GUS (em pMON96999; Figura 2) foi selecionado na presença de espectinomicina, foram observados botões e brotos verdes distintos (resistentes à espectinomicina) e lixiviados (suscetíveis à espectinomi- cina), bem como tecidos GUS-positivos, em um grande número de ex-plantes tratados com TDZ aproximadamente 3 semanas depois da inoculação (Tabela 8). Até 80% dos explantes desenvolveram botões e brotos GUS-positivos dentro de duas semanas sobre meio seletivo (cerca de 3 semanas depois da inoculação, isto é, cerca de 22 DAI; Tabelas 8-9).Tabela 6. Composição do meio de cocultura de Agrobacterium 1595, por L.
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[0091] Um estudo foi conduzido também para avaliar se o tratamento com citocinina BAP também intensificou a frequência de transformação para transformação de soja usando seleção com espectino- micina, promovendo o desenvolvimento de múltiplos brotos. Os explantes de soja foram inoculados e cocultivados com Agrobacterium que abriga pMON96999 (Figura 2). Os meios de inoculação e cocultu- ra foram suplementados com 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 mg/L de BAP. Depois da cocultura por 3 dias, os explantes foram cultivados em um meio de retardamento (meio de inoculação sem seleção) por 4 dias. O meio de retardamento também foi suplementado com o mesmo nível de BAP para cada tratamento, como indicado na Tabela 7. Os explantes foram então transferidos para cima de meio de seleção (igual ao meio de retardamento, mas contendo 150 mg/L de espectinomicina) para indução e seleção de brotos. Os explantes no tratamento sem BAP apresenta-ram mais dominância apical com mais brotos primários alongados.
[0092] Para determinar quantos explantes poderiam desenvolver brotos transformados sem tratamento com BAP, os tecidos dos explantes foram testados quanto à atividade de GUS em 42 dias depois da inoculação. Aproximadamente 18% do explantes que tinham botões ou pequenos brotos GUS+ (Tabela 7). A maioria deles era axilar, e alguns deles eram aparentemente quiméricos. Os explantes tratados com BAP tinham brotos primários muito menos ou não-alongados, e mais brotos repetitivos. Muitos dos brotos alongaram sobre o meio de seleção e foram colhidos para induzir sobre o meio de indução de raízes que contém também 150 mg/L de espectinomicina como no protocolo "A". As frequências de transformação (TFs) foram determinadas baseado no número de brotos enraizados e estão indicadas na Tabela 7. Como havia apenas 18% dos explantes entre os explantes não tratados com BAP que apresentaram botões ou brotos GUS+, uma TF muito mais baixa do que 18% seria esperada caso os explantes não fossem sacrificados para o ensaio de GUS, pois nem todos os bo- tões/brotos GUS+ se desenvolveriam continuamente para eventualmente se tornarem plantas. Portanto, os dados sugeriram fortemente que o tratamento com BAP intensificou TF inibindo a dominância apical e promovendo desenvolvimento de múltiplos brotos.Tabela 7. Efeito do tratamento com BAP durante o estágio de retardamento de cocultura e pós-cocultura
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1 Todos explantes neste tratamento foram avaliados quanto à atividade de GUS 42 dias depois da inoculação. 2 . Enraizados em meio que contém 150 mg/L de espectinomicina. n/d = não disponível Tabela 8. Efeito de tratamentos com diferentes níveis de TDZ durante a inoculação e cocultura sobre o desenvolvimento de botões GUS- positivos.
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Tabela 9. Porcentagem de explantes cultivados sobre meio que contém diferentes níveis de espectinomicina que desenvolveram botões e brotos que expressam GUS
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[0093] Vários níveis de TDZ também demonstraram ser eficazes em promover o desenvolvimento de botões GUS-positivos. Em contraste com os estudos realizados usando glifosato ou dicamba comoum agente seletivo, brotos verdes resistentes à espectinomicina se alongaram bem, e a colheita de brotos pôde ser realizada em seis semanas depois da inoculação. A maior parte do material de explante cultivado produziu broto alongado em alguma hora, embora alguns produzissem mais do que um broto. Um broto alongado foi colhido de cada explante transformado. A colheita dos brotos terminou aproximadamente 9 semanas depois da inoculação, embora ainda mais brotos em alongamento estivessem sendo produzidos a partir de explantes adicionais. Os brotos foram enraizados em um meio de indução de raízes (BRM). Este meio continha % da potência de sais MS, vitaminas MS, 100 mg/L de inositol, 100 mg/L de cisteína, 30 mg/L de sacarose e 100 mg/L de ticarcilina, e foi solidificado com 8 g/L de ágar lavado e suplementado também com 150 mg/L de espectinomicina e 0,1 mg/L de IAA ou 0,25 mg/L de IBA como hormônio de enraizamento. A es- pectinomicina foi empregada a 0-250 ppm, e até 1.000 ppm em alguns estudos. Como indicado na Tabela 10, no primeiro estudo a frequência média de transformação foi de 18,6%, ficando na faixa entre 12,6 e 26,1%, um aumento significativo em relação a aproximadamente 2% de frequência de transformação observada em experimentos comparáveis que utilizaram glifosato como agente seletivo. Um estudo posterior confirmou o resultado (Tabela 10). Essa alta frequência de transformação foi encontrada com uma ampla série de concentrações de espectinomicina (25-250 mg/L e até 1.000 mg/L), e usou-se 150 mg/L de espectinomicina em estudos posteriores. Adicionalmente, entre as primeiras 32 plantas testadas para confirmar a transformação, 31 plantas demonstraram posteriormente ser transformadas com apenas um "escape". Tabela 10. Frequência de transformação usando seleção com espectinomicina
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1 Apenas um broto foi co hido a partir de cada explante, em bora alguns explantes produzissem múltiplos brotos. Como o alongamento dos brotos não foi uniforme, a colheita dos brotos foi interrompida 9 semanas depois da inoculação, embora mais brotos pudessem ser colhidos posteriormente. "SF" = frequência de brotos; "TF" = frequência de transformação
[0094] Usando seleção com espectinomicina, o tempo entre a hora de inoculação e a hora para o desenvolvimento de brotos enraizados transformados foi de cerca de 8 semanas, e a subsequente colheita de sementes R1 transformadas foi tipicamente em < 6 meses.
Exemplo 3 Desenvolvimento e comparação de transformação rápida e eficiente de soja e de protocolos de cultura usando seleção com espectinomicina
[0095] Para melhorar a velocidade e eficiência da transformação de soja, usando seleção com espectinomicina, incluindo tratamento com citocinina, vários protocolos que utilizam seleção com espectino- micina foram comparados entre si e com um método empregado anteriormente que usou glifosato como meio de seletivo. A Tabela 11 e as Figuras 3-5 delineiam os protocolos e os resultados obtidos. Como assinalado, os protocolos de seleção com espectinomicina demonstraram uma alta frequência de transformação, e um período de tempo mais curto necessário para completar cada protocolo (inoculação até semente de próxima geração), em comparação com o protocolo seletivo com glifosato. Os benefícios adicionais incluem simplicidade, reduzido impacto ergonômico, e manuseio eficiente de plantas, levando a custos mais baixos.
[0096] A frequência aumentada em obter plantas transgênicas (~>10X mais eficiente em comparação com seleção com glifosato ou dicamba) proporciona um sistema e método eficiente de transformação com 2 T-DNA's para acumular traços por transformação em, por exemplo, um germoplasma de ROUNDUP READY®, e em seguida, seleção de segregantes isentos de marcadores do segundo gene de interesse. Devido ao fato de que muitas linhagens de criação de soja são em si tolerantes a glifosato, passar um traço adicional para tal antecedente genético proporciona uma vantagem significativa na integração de traços. Tabela 11. Comparação do protocolo de seleção com glifosato com protocolos de seleção com espectinomicina exempificativos
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As Tabelas 12-13 demonstram as frequências de transfor-mação obtidas usando o Protocolo C ou D. Tabela 12. Frequência de transformação de soja usando seleção com espectinomicina, Protocolo "C".
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Tabela 13. Frequência de transformação de soja usando seleção com espectinomicina, Protocolo "D".
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Exemplo 4 Comparação de Frequências de Transformação e Qualidade de Eventos
[0097] Vários dos protocolos de transformação com espectinomi- cina descritos acima foram comparados entre si e com o protocolo de seleção com glifosato para qualidade de transformação de soja, como indicado na Tabela 14. Na tabela abaixo, "TF" refere-se ao número de eventos produzidos pelo número de explantes; "qTF" refere-se ao número de eventos de qualidade por número de explantes, onde um evento de qualidade é definido como um evento que compreende uma cópia do gene de interesse e sem o esqueleto (sequência de vetor); e "MF TF" refere-se ao número de eventos com uma cópia do gene de interesse, não ligada ao marcador, e sem a sequência do esqueleto do vetor, por número de explantes submetidos à transformação.Tabela 14. Estimativas da qualidade da transformação
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[0098] A taxa de não-ligação para estimar os valores de MF TF na Tabela 14 baseou-se na taxa estimada pelos dados na Tabela 15. Como pode ser observado, certos protocolos de transformação com espectinomicina ("C", "D") produziram um aumento de até 10 vezes no número de "eventos de qualidade" obtidos, em comparação com o protocolo de seleção com glifosato, enquanto que o Protocolo "A" apresentou um aumento significativo também em TF e qTF. Mais do que 92% dos eventos foram confirmados como linhagem germinal transformada, baseado na expressão de GUS em embriões de soja R1 imaturos, quando se usa qualquer um dos Protocolos "A", "C", ou "D". Esta taxa de "escape" é comparável àquela encontrada a partir de protocolos de seleção com glifosato. As plantas R0 também demonstraram se desenvolver normalmente e estabeleceram sementes (geração R1) bem, com uma média de quase 200 sementes por planta a partir de plantas de soja transformadas usando qualquer um dos protocolos AD.Tabela 15. Estimativa da taxa de não-ligação
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Exemplo 5 Desenvolvimento de Sistema de Transformação com Espectinomicina para Explantes de Soja Excisados a Seco
[0099] Métodos de seleção com espectinomicina foram utilizados para transformar explantes de soja excisados a seco, preparados da seguinte maneira: 1) Sementes secas viáveis (a semente de soja de qualidade estocada adequadamente tem um teor de umidade interna de aproxi-madamente 10 a 12%) foram enxaguadas com água esterilizada, ou com uma solução de hipoclorito de sódio (na faixa entre 0 ppm e ~30.000 ppm de cloro ativo, incluindo 50 ppm e 200 ppm de cloro ativo) por 3 a 20 minutos. O líquido foi então drenado. Este processo eleva o teor de umidade interna para aproximadamente 16%. Depois desta breve etapa de sanitização da superfície, o teor de umidade interna da semente é baixado em uma secadora de sementes industrial com um fluxo de ar desumidificado (temperatura controlada até aproximadamente 15 oC a 32 oC (60 a 90o F) até menos do que 8% (4 a 6% geralmente preferido). Esta etapa de secagem mantém o vigor da semente, e ainda solta a casca (revestimento da semente) semelhante a papel da semente para facilidade do processamento. Esta semente com teor de umidade mais baixo é também significativamente mais frágil. Esta fragilidade é empregada para dividir adequadamente a semente no moinho de descascamento, maximizando assim a recuperação de explantes de alta qualidade com meristemas intactos vigorosos. A semente assim preparada pode ser estocada por um período de tempo significativo (2 anos ou mais sob condições apropriadas), ou pode ser usada diretamente para processamento adicional. 2) Sementes de soja secas preparadas adequadamente podem ser divididas, e explantes de meristemas viáveis podem ser recuperados usando uma série de máquinas. Uma máquina empregada com sucesso é uma Grainman Rice Sheller (Modelo 64). As sementes divididas nesta máquina podem ser então processadas adicionalmente para recuperar os explantes portadores de meristemas desejados em uma Clipper-Cleaner modificada com peneiras com tamanho apropriado. Os explantes recuperados neste processo rápido e delicado podem ser usados diretamente para transformação ou podem ser estocados até necessário. As condições de temperatura típicas durante a estocagem podem ficar na faixa entre a temperatura ambiente e - 80 oC. 3) Depois da estocagem desejada, os explantes foram rei- dratados para transformação. Os tipos de meios usados para esta etapa podem ser variados e incluem "meio de germinação de feijão" (BGM; Tabela de Meios 16), meio de inóculo de soja (INO; Tabela 1), e culturas de crescimento de Agrobacterium preparadas em fase log (AGRO). A cultura de crescimento de Agrobacterium foi desenvolvida de um dia para o outro em Caldo de Lisogenia (LB, referido também comumente como Caldo de Luria-Bertani) para fase log, e depois centrifugada e recolocada em suspensão até uma densidade óptica final ae 660nm de 0,25 a 0,6. O meio usado para a diluição é igual ao meio do inóculo de soja. As temperaturas e durações da reidratação tam-bém podem ser variadas, sendo que alguns experimentos tiveram ex-plantes que foram embebidos em uma dessas soluções durante a noite inteira a 4 °C. Outras variações foram feitas na duração de exposição ao respectivo meio de hidratação, nas várias temperaturas durante esta exposição, e no grau de saturação no respectivo meio. Os tempos de exposição testados ficaram na faixa entre 0 e 24 horas. As temperaturas durante tempos de exposição mais longos (aqueles maiores do que 4 horas) foram à temperatura ambiente (~26 °C), 23 °C, ou 4 °C. Tempos de exposição de 4 horas ou menos foram todos testados à temperatura ambiente. Como uma alternativa para submergir completamente ou saturar substancialmente os explantes com meio líquido durante o processo de hidratação, alguns tratamentos empregaram o uso de papel de filtro umedecido (líquido suficiente para umedecer, mas não para saturar). Isto foi feito com papel de filtro umedecido com BGM ou meio de cultura de Agrobacterium. A reidratação foi realizada em uma série de recipientes, incluindo, porém sem limitações, tubos de centrifugação cônicos, frascos de vidro graduados, ou um recipiente de cultura de tecidos PLANTCON (MP Biomedicals, Irvine, CA).
[00100] Depois da reidratação, os explantes foram brevemente sonicados na presença das culturas de Agrobacterium apropriadas, como descrito em outros exemplos. A cocultura foi realizada em incubadoras Percival iluminadas durante geralmente 2 a 5 dias (16 horas de luz, 8 horas de escuridão, intensidade da luz > 5 μ E) em uma temperatura de aproximadamente 23 a 25 °C. A espectinomici na foi aplicada como mum agente de seleção durante a reidratação, em etapas de cocultura, e/ou depois da cocultura a 15 mg/L a 1.000 mg/L. Os brotos (plantas) fenótipo-positivos foram recuperados rotineiramente (vide Tabela 17).Tabela 16. Meio para germinação de soja
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[00101] Como demonstrado na Tabela 17, uma frequência de trans-formação de 20-25% foi obtida em vários experimentos, e mais de 10% foi obtido rotineiramente, dependendo do protocolo usado. Tabela 17. Frequencia de transformação (TF) de explantes de soja ex- cisados a seco
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Exemplo 6 Transformação de Algodão Usando aadA como Marcador Selecionável e Espectinomicina como Agente Seeltivo A. Preparação de inóculo de Agrobacterium
[00102] Foi usada a cepa de Agrobacterium C58 portando um vetor binário que transporta 1 T ou 2 T-DNA contendo aadA e outro GOI ou marcador capaz de ser triado. O inóculo foi preparado como descrito no Exemplo 1.
B. Explantes de algodão, inoculação e cocultura com Agrobacterium.
[00103] Os eixos de embriões de algodão foram excisados mecanicamente de sementes maduras embebidas e a inoculação foi realizada com Agrobacterium preparada e cocultivados. As sementes de algodão foram processadas mecanicamente para excisar e isolar seus tecidos meristemáticos. Para obter material de explante meristemático trans- formável, as sementes de algodão (por exemplo, dos genótipos STN474 (Stoneville Pedigreed Seed Co., Stoneville, MS), Delta Pearl (Delta and Pine Land Co., Scott, MS), DP5415 (Delta and Pine Land Co.), Sure- Grow501 ou SureGrow747 (Sure Grow Cotton Seed Company, Maricopa, AZ) foram processadas como se segue, para separar o embrião, compreendendo tecidos meristemáticos, do revestimento das sementes e cotilédone(s). As sementes de algodão foram removidas da estoca- gem a 4 oC ou -20 oC e levadas para a temperatura ambiente. As sementes foram pesadas, colocadas dentro de uma unidade germinadora estéril, e esterilizadas na superfície em Clorox a 50% (hipoclorito de sódio) por 5 min. As sementes são então enxaguadas 3 vezes com água destilada esterilizada e hidratadas em um meio de hidratação líquido (CSM) a 28 °C no escuro por cerca de 18 h (faixa de 14 a 42 horas). Alternativamente, a temperatura de germinação pode ser mais baixa, por exemplo, cerca de 23 °C. O meio CSM continha 20 0 mg/L de car- benicilina (PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS), 125 mg/L de cefotaxima (Midwest Scientific, St. Louis, MO), 30 mg/L de BRAVO 75 (Carlin, Milwaukee, WI) e 30 mg/L de Captan 50 (Carlin). Outras soluções também foram usadas com sucesso para hidratar as sementes de algodão, incluindo água desmineralizada estéril ou água contendo uma concentração fraca de água sanitária (tipicamente 50 a 1.000 ppm de hipoclorito de sódio). Depois da hidratação, as sementes podem ser usadas imediatamente ou estocadas em temperaturas de refrigeração por até uma semana antes de processamento adicional.
[00104] Os explantes foram enxaguados em água esterilizada. Cerca de 1-60 g, por exemplo, 30 g, de explantes foram colocados dentro da parte do topo (de cabeça para baixo) de um recipiente Plantcon (MP Biomedicals, Solon, OH), e em seguida foram adicionados apro ximadamente 50 mL da suspensão de Agrobacterium preparada, suficiente para cobrir os explantes. Depois que o Plantcon® foi fechado, ele foi inserido dentro de um suporte adequadamente dimensionado, que foi colocado dentro de um aparelho de ultrassom (por exemplo, L&R Ultrasonics QS140; L&R Manufacturing Co., Kearny, NJ; ou um aparelho de ultrassom Honda W113, Honda, Denshi Japão). O aparelho de ultrassom foi enchido com cerca de 2 L de 0,1% de Triton® (por exemplo, Sigma 526-36-23; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO). Depois de até 5 min de aplicação de ultrassom, o Plantcon® foi colocado firmemente em um vascolejador a cerca de 80-100 rpm por 10 min para incubação. Depois da inoculação, o inóculo de Agrobacterium foi removido do Plantcon®. Cerca de 2 g do tecido de explante inoculado foram transferidos para um Plantcon® fresco contendo papel de filtro estéril e 5 mL de INO (Tabela 1), e os explantes foram espalhados sobre a superfície do meio para evitar aglomeração. O meio INO pode também ser suplementado com reguladores do crescimento de plantas, tais como giberelinas (GA3), auxinas (NAA, IBA, IAA, 2,4-D, di- camba, etc), citocininas (BAP, tidiazuron, dikegulac, cinetina, etc.), e os compostos antimicrobianos 50 ppm de nistatina (50 mg/L), TBZ (10 mg/L), e o agente de seleção espectinomicina (100 mg/L). O Plantcon® contendo os explantes inoculados foi colocado dentro de uma incubadora Percival para cocultivo a aproximadamente 22-28 oC e um fotope- ríodo de 16 horas de luz por 2-5 dias (intensidade da luz > 5 μ E).
C. Seleção e identificação de eventos transgênicos usando especti-nomicina como um agente seletivo
[00105] Depois do cocultivo, os explantes foram transferidos para cima de meio de seleção semissólido em recipientes Plantcon® implantando individualmente dentro do meio, ou eles foram assentados sobre a superfície do meio. O meio basal era um Meio de Planta Lloyd & McCown Woody modificado (WPM, Lloyd and McCown, 1981) e foi suplementado com 200 mg/L de cefotaxima, 200 mg/L de carbenicilina e 100-200 mg/L de espectinomicina (Tabela 18) com ou sem reguladores do crescimento de plantas ou outros aditivos para promover a formação e crescimento de múltiplos brotos.Tabela 18. Componentes do meio para seleção e desenvolvimento de brotos usado em transformação de algodão - Meio de Plantas Lloyd & McCown Woody modificado suplementado com antibióticos
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[00106] Vinte e cinco a 50 explantes foram cultivados em cada recipiente. Os explantes foram transferidos imediatamente para dentro de sal de cultura iluminada (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão, intensidade da luz > 5 μ E) com ajuste de temperatura em aproximadamente 28 °C, ou primeiramente dentro de sala ilum inada com ajuste de temperatura em aproximadamente 35 °C, até 40 °C, por um período de tempo curto (por exemplo, 3-5 dias) antes de serem transferidos para 28 °C. Os experimentos comparando estes dois e squemas de cultura foram conduzidos e os resultados sugeriram que o tratamento a 35 °C foi benéfico (Tabela 19).Tabela 19. Comparação de métodos de inoculação e cocultura para transformação de algodão usando seleção com espectinomicina
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[00107] No método A, todos explantes em cada tratamento foram colocados em um PLANTCON e o inóculo de Agrobacterium foi adicionado para cobrir os explantes. Os explantes no inóculo foram sonicados (sonicação a granel) para criar feridas para a entrada de Agrobacterium, por 2 min, e em seguida, por 10 min em agitador (80 rpm). Depois, o inóculo foi removido e os explantes foram distribuídos em PLANTCONs, cada um contendo um pedaço de papel de filtro e 5 mL de meio de ino-culação. No método B, os explantes foram distribuídos para a parte da cobertura de cada PLANTCON (aproximadamente 100 explantes por PLANTCON). Cinco mililitros do inóculo de Agrobacterium foram adicio-nados, e os explantes foram estão sonicados por 20 s, e foram imedia-tamente transferidos, junto com o inóculo, para a parte de fundo de um PLANTCON, que guarda um pedaço de papel de filtro.
[00108] Depois de aproximadamente 3-4 semanas sobre o meio de seleção, os brotos verdes resistentes começaram a ficar evidentes em alguns explantes, enquanto que os brotos jovens lixiviados ou primórdios eram claramente visíveis em outros. Em aproximadamente outras 2 semanas sobre o meio de seleção, os explantes que desenvolveram brotos verdes foram transferidos para tampões Oasis® para crescimento dos brotos e indução de raízes a partir do radical original na estufa. Os tampões Oasis foram colocados em uma base plana-padrão sem furos e foram colocados em um meio líquido simples que continha 0,5 g/L de sais WPM com vitaminas (Phytotechnology Laboratories, Lenexa KS; lote no L449) e 0,25 mg/L de IBA, e foram cobertos com cúpulas de plástico. Os explantes poderiam ser também transferidos para cima de meio de seleção fresco com concentração igual ou mais alta de espectinomicina, ou com espectinomicina removida, para seleção e/ou crescimento posterior antes de serem transferidos para os tampões. Em alguns experimentos, os explantes de algodão foram submetidos a uma cultura de tecidos e condições de crescimento essencialmente como descrito para a transformação, seleção e regeneração de plantas de soja do Protocolo "D" acima. O meio de enraizamento de algodão (CRM; Tabela 20) também poderia ser usado para induzir a formação de raízes.Tabela 20. Componentes do Meio de Enraizamento de Algodão (CRM).
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[00109] Em aproximadamente 3-4 semanas, a maioria dos brotos em tampões Oasis® tinha crescido significativamente e as raízes também estavam bem desenvolvidas. Os tecidos foram testados quanto à caracterização molecular oir um ou mais métodos de ensaios moleculares, por exemplo, ensaio Invader® (Third Wave™ Technologies, Madison, WI), PCR, ou hibridização Southern. Amostras de folhas também puderam ser coletadas de cada broto verde e testadas quanto à atividade de GUS, enquanto ainda no meio de seleção e/ou em estágio posterior, caso uma construção que contém um gene uidA fosse usada. A espectinomicina serviu como um marcador visual útil para a identificação precoce de transformação. Os tecidos não-transformados usualmente pareceram lixiviados e frequentemente malformados sob seleção com espectinomicina, enquanto que os tecidos transformados eram verdes adequadamente em desenvolvimento. Em experimentos que utilizam um gene marcador uidA, a natureza transformada do tecido verde pôde ser confirmada pela expressão de GUS depois de cerca de 4-8 semanas sobre o meio de seleção. Portanto, usando especti- nomicina como um agente de seleção precede os ensaios de GUS intensivos em mão-de-obra e morosos usados frequentemente em sistemas de transformação de meristemas, e proporciona a vantagem de reduzir significativamente a mão-de-obra envolvida na produção de plantas transgênicas.
Exemplo 7 Transformação de Milho Usando aadA como um Gene Marcador Sele- cionável A. Explantes de milho
[00110] Os embriões imaturos que contêm aurículas (por exemplo, FBLL ou LH244) são colhidos aproximadamente 10 dias depois da polinização e mantidos refrigerados a 4 °C até o uso (até 5 dias depois da colheita). O tamanho preferido do embrião para este método de transformação é ~1,0-2,0 mm. Este tamanho é usualmente atingido cerca de 10 dias depois da polinização dentro da estufa sob condições de crescimento de uma temperatura média de 30 oC (87 °F), extensão do dia de 14 horas com iluminação suplementar suprida por lâmpadas GE de sódio de alta pressão de 1.000 watts. O método independente de genótipo.
B. Preparação do inóculo de Agrobacterium
[00111] É usada a cepa de Agrobacterium C58 portadora de um vetor binário que transporta aadA que contém 1 T- ou 2 T-DNA e outro GOI ou marcador capaz de ser triado. O inóculo pode ser preparado como descrito na publicação do pedido de patente no US 2004/0244075.
C. Inoculação e cocultura
[00112] Embriões imaturos são isolados a partir de aurículas esterilizadas na superfície e jogados diretamente dentro da suspensão de células de Agrobacterium preparada em um tubo de microcentrifuga- ção de 1,5 mL. O isolamento dura continuamente por 15 min. O tubo é então deixado de lado por 5 min, o que faz com que o tempo de inoculação para embriões individuais dure na faixa entre 5 e 20 min. Depois que a suspensão de células de Agrobacterium é removida usando uma pipeta de transferência com ponta fina, os embriões imaturos são transferidos para cima de meio de cocultura (Tabela 21). Os embriões são colocados sobre o meio com o escutelo voltado para cima. Os embriões são cultivados emu ma incubadora escura (23oC) por apro-ximadamente 24 h.
D. Seleção, regeneração e crescimento de transformantes sobre um meio que contém espectinomicina
[00113] Depois do cocultivo, os embriões são transferidos para cima de um meio MS modificado (MS de Indução, Tabela 21) suplementado com 500 mg/L de carbenicilina e 50, 100, 150, 200, ou 500 mg/L de espectinomicina em placas Petri (100 mm x 25 mm), 20 a 25 embriões por placa. Auxina e citocinina estão presentes para iniciar uma resposta de cultura embriogênica a partir do tecido do escutelo. As placas são mantidas em uma sala escura de cultura a 27 oC por aproximadamente 2 semanas. Os embriões imaturos com calo desenvolvido são transferidos individualmente para cima do primeiro meio de regeneração, o mesmo meio mencionado acima, exceto que 2,4-D e pi- cloram são substituídos por 3,5 mg/L de BAP (MS/BAP, Tabela 21) e o nível de carbenicilina é reduzido para 250 mg/L. As culturas são transferidas para uma sala de cultura com fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão e 27 oC. Depois de 5-7 dias, os pedaços de calos também podem ser transferidos para cima do segundo meio de regeneração, um meio baseado em MS isento de hormônios (MSOD, Tabela 21) em placas de Petri (100 mm x 25 mm). Depois de aproximadamente mais 2 semanas, os pedaços de calos que tinham brotos regenerados ou ainda estão vivos são transferidos para cima do mesmo meio isento de hormônios em Phytatrays para seleção e crescimento adicional. Todos meios mencionados acima são suplementados com 50, 100, 150 ou 200 mg/L de espectinomicina. As plantas verdes regeneradas (R0) são transferidas para o solo em vasos com turfa em uma câmara de crescimento quando elas atingem o topo de Phytatrays e têm uma ou mais raízes sadias. Depois de mais 7 a 10 dias, elas são então transplanta-das para dentro de vasos de 30 cm (12 in) e levadas para a estufa sob condições para crescimento normal de plantas. As plantas são autopo- linizadas ou cruzadas com plantas do tipo selvagem.
[00114] Ensaios moleculares (por exemplo, como descrito acima para plantas de algodão) são conduzidos para caracterizar as plantas. Tabela 21. Meio de cultura para uso na transformação e regeneração de milho
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Exemplo 8 Preparação de um Promotor de um 16S RNA Intensificado a partir de Agrobacterium e Genes de Fusão CTP-aadA
[00115] pMON107379, um vetor de 2 T-DNA com origem de repli-cação OriRi tem um promotor localizado no esqueleto (isto é, fora do T-DNA) para seleção de resistência à espectinomicina em células hospedeiras de E. coli ou Agrobacterium. Para produzir pMON107379, o cassete de expressão da seleção com espectinomicina em plantas foi excisado de pMON96999 (Figura 2) com digestão por NotI, e inserido dentro de pMON107341 aberto com PspOMI. O pMON107341 parental é um vetor baseado em oriRi com melhor cassete de resistência à espectinomicina direcionado pelo promotor P-rrn. Um promotor de 16S RNA intensificado a partir de Agrobacterium (SEQ ID NO: 3) é es-pecialmente útil quando o número de cópias do vetor é baixo, como com os vetores que contêm OriRi. O promotor P-rrn foi isolado a partir do 16S rDNA da cepa de Agrobacterium por PCR, e fundido ao sítio de ligação ribossômica (RBS) com operon virE para permitir sua tradução eficiente em E. coli e também Agrobacterium. pMON107379 compreende também um gene aadA que codifica uma aminoglicosídeo-3'- adeniltransferase (SEQ ID NO:1) que confere resistência à espectino- micina, sendo o gene que codifica uma aminoglicosídeo-3'- adeniltransferase fundido também com um peptídeo de trânsito de clo- roplasto (SEQ ID NO:2) para transporte da aminoglicosídeo-3'- adeniltransferase codificada no núcleo para plastídeos.
Exemplo 9 Retransformação Direta de Germoplasma com ROUNDUP READY® Valorizado em Soja e Algodão
[00116] Utilizando os métodos aqui descritos, o germoplama trans- gênico de Round-Up Ready® valorizado pode ser transformado utilizando 2 T-DNA's que codificam o gene aadA para seleção com espec-tinomicina, e ao mesmo tempo, empregando um novo gene (frequen-temente referido como "o gene de interesse") no segundo T-DNA (ou plasmídeo, caso dois plasmídeos sejam usados) para permitir a se-gregação longe do aadA como descrito.
[00117] Uma variedade da semente de algodão RRFlex® (07W610F) e a variedade não-transgênica de controle do germoplas- ma (00S04) foram comparadas. A semente foi embebida por ~18 h a 24 °C, excisada com máquina e peneirada com máquina (em duas etapas), e em seguida, enriquecimento dos explantes por flutuação. Os explantes foram inoculados com suspensão de Agrobacterium em INO na DO660 de 0,3, sonicados por 2 min, e incubados por 10 min. A suspensão de Agrobacterium foi então removida e os explantes foram distribuídos dentro de recipientes de cocultura a aproximadamente 2 g por recipiente. Os explantes foram assentados sobre papéis de filtro umedecidos com 5 mL de meio de cocultura (INO com adições de 50 ppm de nistatina, 10 ppm de TBZ, e 100 ppm de espectinomicina) e cocultivados em uma incubadora Percival iluminada a aproximadamente 23 a 25 °C (16 h de luz/8 h de escuridão, intensidade da luz > 5 μ E) por 3 dias. Os explantes foram então transferidos para cima de meio WPM com 150 ppm de espectinomicina, incubados por 3 dias em sala iluminada a 35 °C (16 h de luz/8 h de escuridã o), e depois levados para uma sala iluminada a 28 °C (16 h de luz/8 h de escuridão). As plântulas verdes fenótipo-positivas foram colhidas 6 semanas depois da inoculação, colocadas em tampões Oasis® (Smithers-Oasis USA; Kent, OH) umedecidos com 0,5 g/L de sais WPM (incluindo opcionalmente IBA a 0,25 mg/L para melhorar o enraizamento) e levados para condições de estufa. Depois que as plantas aclimatizaram e começaram a crescer, elas foram testadas quanto à expressão de CP4, GUS, e GUS vascular (um previsor de transformação de linhagem germinal). Esperava-se que as plantas transgênicas retransformadas fossem CP4+ GUS+, enquanto que se esperava que as plantas de controle transformadas fossem CP4- GUS+. Uma análise do rendimento de plantas transformadas está listada na Tabela 22 abaixo. Espera-se que a frequência de transformação total aumente, pois a análise não está completa nesta hora. O procedimento descrito é útil para retrans- formar plantas de algodão transgênicas com uma eficiência similar à transformação de uma variedade de algodão não-transgênica conven-cional. Tabela 22: Frequência de transformação de germoplasma retransfor- mado
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EXEMPLO 10 Esterilização de Sementes e/ou Material de Explante
[00118] Inúmeras técnicas para esterilizar sementes antes da exci- são, bem como esterilizar explantes depois da excisão a partir de sementes foram testadas. A esterilização após a excisão de explantes secos, usando gás cloro em uma câmara de dessecação a vácuo foi testada em intervalos de tempo na faixa entre 15 minutos e 16 horas. O controle da contaminação aumentou com a exposição mais longa ao gás cloro, embora a contaminação fúngica tenha crescido em tratamentos nos quais a exposição ao gás cloro tinha suplantado a broda de sobrevivência dos explantes.
[00119] Tratamentos com gás ozônio também foram testados. A semente integral (antes da excisão) e também os explantes secos (depois da excisão) foram expostos ao gás O3 em uma câmara de PLEXIGLAS (OSR-8 Ozone Generator; Ozone Solutions, Sioux Center, IA) em vários intervalos de tempo de 1-24 horas. O O3 foi usado em uma concentração de 467 ppm. Depois que a semente foi exposta ao ozônio, o material embrionário foi excisado e a viabilidade dos explantes foi medida. A ozonização de semente de soja por 12 horas ou menos não prejudica a viabilidade de explantes isolados subsequentemente, mas diminuiu drasticamente a biocarga (bioburden) encontrada em explantes. A ozonização de explantes excisados por tão pouco quanto 1-4 horas diminuiu a saúde dos explantes (isto é, o número de embriões viáveis).
[00120] Estes adicionais sobre esterilização pré-excisão de semente integral foram realizados usando uma solução lixiviadora de 200 ppm de cloro ativo, e em seguida, um período de hidratação durante a noite inteira (~9 horas) em uma solução de 50 ppm de cloro ativo. Estas sementes foram então deixadas secar em uma capela com fluxo laminar (tipicamente por 12-48 horas) antes de serem excisadas mecanicamente. Foi testada também uma modificação para o protocolo de embebição em água sanitária a 50%, na qual as sementes foram primeiramente enxaguadas com uma solução de etanol a 70%. O eta- nol foi drenado imediatamente (a exposição total ao etanol durou menos do que 5 segundos), e depois uma embebição em água sanitária a 50% foi realizada tratando as sementes por 3-15 min em água sanitária a 50%, e em seguida, 3 enxágues com água e secando as sementes durante a noite inteira, de tal modo que o teor de umidade fosse menor do que 8%. Luz UV também pode ser usada para esterilizar o material vegetal.
EXEMPLO 11 Hidratação de Sementes e Material de Explante
[00121] Estudos que empregaram novas estratégias de hidrata ção/germinação com pré-cultura foram testados. Os tipos de meios usados para esta etapa incluíram "meio de germinação de feijão" (BGM; Tabela 16), meio de inóculo de soja (INO; Tabela 1), e culturas de crescimento de Agrobacterium em fase log preparadas (AGRO). A cultura de crescimento de Agrobacterium foi desenvolvida durante noite inteira em Caldo de Lisogenia (LB, referido também comumente como Caldo de Luria-Bertani) até fase log, e depois centrifugada e recolocada em suspensão até uma densidade óptica final a 660nm de 0,25 a 0,6. O meio usado para a diluição é igual ao meio do inóculo de soja. Os explantes foram embebidos nesta solução durante a noite inteira a 4 °C. Outras variações foram feitas na dura ção da exposição ao respectivo meio de hidratação, nas várias temperaturas durante esta exposição, e no grau de saturação no respectivo meio. Os tempos de exposição testados ficaram na faixa entre 0 e 24 horas. As temperaturas durante tempos de exposição mais longos (os maiores do que 4 horas) foram temperatura ambiente (~ 26°C), 23 °C, ou 4 °C. Os tempos de exposição de 4 horas ou menos foram todos testados à temperatura ambiente. Como uma alternativa a submergir completamente ou saturar substancialmente os explantes com meios líquidos durante o processo de hidratação, alguns tratamentos empregaram o uso de papel de filtro umedecido (líquido suficiente para umedecer, mas não saturar). Isto foi feito com papel de filtro umedecido com BGM ou meio de cultura de Agrobacterium. A reidratação foi realizada em uma série de recipientes, incluindo, porém sem limitações, tubos de centrifugação cônicos, frascos de vidro graduados, ou um recipiente de cultura de tecidos PLANTCON (MP Biomedicals, Irvine, CA).
[00122] Este exemplo demonstra também que a hidratação pode ser feita em uma série de meios que contêm vários tipos de carboidratos tais como glicose (INO), e sacarose (BGM). Outros carboidratos tais como galactose podem ser úteis no meio de hidratação.
Exemplo 12 Transformação de explantes de soja excisados a seco estocados por períodos de tempo prolongados
[00123] Explantes excisados a seco foram estocados por até 20 meses a -20 °C a 4 °C, e depois testados quanto à s obrevivência, capacidade de transformação e vigor. A sobrevivência e o vigor global dos explantes pareceram ser similares em todos grupos de tratamento, independentemente das condições de estocagem ou temperatura em comparação com o tratamento de controle (Tratamento 1). Isto demonstra a capacidade de estocar explantes excisados a seco por quase dois anos sem prejudicar. Os explantes de cada tratamento foram testados quanto à expressão transiente de GUS 4 dias depois da inoculação. A Tabela 23 indica uma comparação da expressão de gus específica de meristemas entre tratamentos, pontuados em uma escala de 0-9, sendo 0 nenhuma expressão visível, e 9 sendo expressão extensiva em todos 3 meristemas do embrião. Isto demonstra que os explantes excisados a seco podem não apenas sobreviver à estoca- gem de longo prazo em várias condições sem perda significativa de vigor, mas eles também retêm suscetibilidade à transformação. Assim sendo, agora é possível excisar grandes quantidades de explantes durante tempos de pouco consume para uso posterior, o que representa economia de custo potencial significativa e flexibilidade no planejamento e execução de estudos de transformação.Tabela 23: Efeito da duração e temperatura de estocagem sobre a transformação de explantes
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Exemplo 13 Identificação de composições e condições apropriadas da cultura de pré-inoculação ("Pré-cultura")
[00124] É provável que os explantes excisados ainda estejam em um estado de semidormência quando eles são inoculados com Agrobacterium para transformação. Assim sendo, foi desenvolvido um método para estimular a atividade metabólica dos explantes excisados secos antes da inoculação com Agrobacterium, para aumentar sua competência para transformação. Isto é, manipulando a biologia do explante seco, é possível aumentar a % de eventos de linhagem germinal positivos por explante em 2 a 10 vezes.
[00125] Várias composições de meios: BGM (Tabela 16), INO (Tabela 1), ou OR (Tabela 24) foram testadas em temperaturas de 23 °C e/ou 28 °C, e sob diferentes condições de luz/escur idão entre 1 e 5 dias, quanto à sua capacidade de intensificar a competência de transformação. Depois da etapa de pré-cultura, os explantes foram reunidos entre si e inoculados com a cultura de Agrobacterium de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Os ensaios de expressão transiente de GUS realizados em explantes indicaram atividade de GUS aumentada nos tratamentos pré-cultivados depois de 2 dias e 4 dias de cocultura.
[00126] As perdas de plantas ocorreu devido à infecção fúngica em alguns dos experimentos de pré-cultura, mas a TF global dos explantes excisados secos que foram pré-cultivados sobre papéis de filtro umedecidos com BGM a 23 °C no escuro por 5 dias pareceu ser mais alta quando comparada com os explantes excisados a seco que não foram pré-cultivados. As perdas devido à contaminação fúngica puderam ser mitigadas usando um agente antifúngico, tal como BRAVO 75 e Captan 50 a cerca de 1% cada durante a etapa de pré-cultura e/ou cocultura. A análise Southern blot e INVADER das plantas produzidas neste exemplo com uma sonda CP4 confirmou a natureza transgênica destas plantas.Tabela 24: MEIO ORGANOGÊNICO (OR) de Soja
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Tabela 25: Efeito de pré-cultura de explante seco; frequência de trans-formação usando pMON10343
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[00127] Os estudos foram repetidos comparando duas construções, pMON101343, que compreende um T-DNA que compreende um gene CP4 que especifica resistência a glifosato e uma origem de replicação OriV; e pMON107350 que compreende um T-DNA que compreende um gene de CP4 que especifica resistência a glifosato e uma origem de replicação OriR (documento no US 2007/0074314) no esqueleto de vetor. Novamente, pré-culivar os explantes secos aumentou a TF em comparação com a TF de explantes secos não pré-cultivados, como indicado na Tabela 26.Tabela 26: Estudos adicionais sobre pré-cultura de explantes excisa- dos a seco
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[00128] Como indicado na Tabela 27, os explantes excisados a seco pré-cultivados também produziram TFs mais altas e foram cultivados em meio líquido de regeneração (meio da Tabela 12, exceto pelo AgarGel) que foi removido e adicionado automaticamente usando um sistema robótico. A TF pareceu ser ainda mais alta com o meio de regeneração líquido com uma etapa de pré-cultura. Os explantes exci- sados a úmido em meio líquido parecem ter TF baixa devido à contaminação.
[00129] Pré-cultivar, surpreendentemente, melhora a competência para transformação e melhora a uniformidade da transformação. Tais melhoras são cruciais para reduzir a variabilidade durante corridas de produção em escala industrial para produzir plantas de soja transgêni- cas.Tabela 27: Pré-cultura de explantes excisados a seco; comparação de meio sólido e líquido
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Exemplo 14 Produção de plantas de soja transgênicas usando explantes de soja secos e seleção com espectinomicina
[00130] Sementes secas viáveis (sementes de soja de qualidade estocadas adequadamente compreendem aproximadamente 10 a 12% de teor de umidade interna) foram enxaguadas com água esterilizada, ou uma solução de hipoclorito de sódio (na faixa entre 0 ppm e ~30,000 ppm de cloro ativo, incluindo 50 ppm e 200 ppm de cloro ativo) por 3 a 20 minutos. O líquido foi então drenado. Este processo eleva o teor de umidade interna para aproximadamente 16%. Depois desta breve etapa de sanitização da superfície, o teor de umidade interna das sementes foi baixado em uma secadora de sementes industrial com um fluxo de ar desumidificado (temperatura controlada até aproximadamente 15 a 32 oC (60 a 90 oF) até menos do que 8%.
[00131] Depois da estocagem desejada, os explantes foram reidratados para transformação. Os tipos de meios usados para esta etapa podem ser variados e incluíram "meio de germinação de feijão" (BGM; Tabela 16), meio de inóculo de soja (INO; Tabela 1), e culturas de crescimento de Agrobacterium preparadas em fase log (AGRO). A cul tura de crescimento de Agrobacterium foi desenvolvida de um dia para o outro em Caldo de Lisogenia (LB, referido também comumente como caldo de Luria-Bertani) até fase log, e depois centrifugada e recolocada em suspensão até uma densidade óptica final a 660 nm de 0,25 a 0,6. O meio usado para a diluição é igual ao meio de inóculo de soja. As temperaturas e durações da reidratação também podem ser variadas, sendo que alguns experimentos têm explantes que foram embebidos em uma destas soluções de um dia para o outro a 4 °C. Outras variações podem ser feitas na duração de exposição ao respectivo meio de hidratação, nas várias temperaturas durante esta exposição e no grau de saturação no respectivo meio. Os tempos de exposição Os tempos de exposição testados ficaram na faixa entre 0 e 24 horas. As temperaturas durante tempos de exposição mais longos (aqueles maiores do que 4 horas) foram à temperatura ambiente (~26 °C), 23 °C, ou 4 °C. Tempos de exposição de 4 horas ou menos fo ram todos testados à temperatura ambiente. Como uma alternativa para submergir completamente ou saturar substancialmente os explantes com meio líquido durante o processo de hidratação, alguns tratamentos empregaram o uso de papel de filtro umedecido (líquido suficiente para ume- decer, mas não para saturar). Isto foi feito com pelo de filtro umedeci- do com BGM ou meio de cultura de Agrobacterium. A reidratação foi realizada em uma série de recipientes, incluindo, porém sem limitações, tubos de centrifugação cônicos, frascos de vidro graduados, ou um recipiente de cultura de tecidos PLANTCON (MP Biomedicals, Irvine, CA).
[00132] Depois da reidratação, os explantes foram brevemente sonicados na presença das culturas de Agrobacterium apropriadas. A cocultura e as etapas subsequentes foram realizadas em incubadoras Percival iluminadas por 2 a 5 dias (16 horas de luz, 8 horas de escuridão, com intensidade da luz de cerca de 5 μ E a 200 μ E) em uma tem-peratura de aproximadamente 23 a 25 °C, e podem ser realizadas a até cerca de 35°C. A luz reconhecidamente promove a transferência de genes da Agrobacterium para células vegetais. A espectinomicina foi aplicada como um agente de seleção durante a reidratação, em etapas de cocultura e/ou depois da cocultura a 15 mg/L a 1000 mg/L.
[00133] Os brotos (plantas) fenótipo-positivos foram recuperados rotineiramente, como indicado na Tabela 28, usando a construção pMON96999 que compreende um T-DNA que compreende um gene aadA e uma origem de replicação OriV, ou a construção pMON101343 que compreende um T-DNA que compreende um gene CP4 e uma origem de replicação OriV. O termo "fenótipo-positivos" na presença de espectinomicina significa que os brotos são verdes e robustos, enquanto que os brotos fenótipo-negativos são fracos e lixiviados (brancos), caso eles absolutamente não alonguem. Espectinomicina ou gli- fosato foram usados no meio de regeneração (sólido e também líquido) na concentração indicada na Tabela 28.Tabela 28: Frequência de transformação de explantes de soja secos usando glifosato ou espectinomicina como agente seletivo
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[00134] Espectinomicina também foi usada como um agente seletivo para a transformação de embriões de soja excisados a seco utilizando as seguintes condições: 1 h de hidratação em meio INO, 4 dias de cocultura em INO, 150 ppm de espectinomicina, com cultura sobre WPM sólido ou líquido (Tabela 2; com ou sem ágar adicionado). Temperaturas de 23-25 ou 28 °C, até cerca de 35 °C, po dem ser utilizadas. Os brotos fenótipo-positivos foram colhidos em 8 e 10 semanas depois da inoculação com Agrobacterium, e o enraizamento foi induzido sobre BRM sólido (vide Exemplo 2) com 150 ppm de espectinomicina. Fre-quências de transformação muito altas de 25,05% e 19,27% foram obtidas e dois estudos diferentes.
Exemplo 15 Produção de plantas de soja transgênicas usando embriões de soja secos, espectinomicina, e meio de cultura líquido
[00135] Nestes estudos, os explantes foram inicialmente hidratados e eventualmente regenerados sobre meio WPM sólido com sobreposição de líquido ou meio WPM líquido como acima. Todos explantes foram transferidos em 6 semanas depois da inoculação para bandejas que contêm o Oasis® Wedge System (Smithers-Oasis USA; Kent, OH) um meio líquido simplificado (0,5 g/L de WPM com 0,25 mg/L de IBA). As plantas R0 enraizadas e brotadas foram obtidas 2 a 4 semanas depois. Em todos estudos e tratamentos, a hidratação inicial dos explantes foi fetia por 1 hora no respectivo meio, como indicado na Tabela 29. O meio de cultura líquido foi igual ao da Tabela 2, exceto que o glifosato foi substituído por espectinomicina a 150 ppm. No tratamento com sobreposição de líquido, foram usados meios de cultura sólidos e também líquidos; o meio líquido foi distribuído sobre o topo dos explantes, pois eles estavam assentados sobre meio sólido em um tempo especificado durante a cutura do tecido, como identificado na Tabela 30. Isto foi feito como um tipo de refersco do meio e evita a necessidade de transferir os explantes do meio antigo para meio novo. Nos tratamentos de controle, os explantes foram plaqueados sobre a superfície de meio WPM sólido (Tabela 2). Os brotos foram colhidos e enraizados sobre BRM sólido como descrito acima, exceto que o glifo- sato foi substituído por espectinomicina a 150 ppm.Tabela 29: Frequência de transformação com dadas condições de hi-dratação
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Tabela 30: Timing de Sobreposição de Líquido
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Exemplo 16 Produção de plantas de soja transgênicas usando embriões de soja secos, espectinomicina, e transferindo os explantes integrais regenerados com uma etapa de pré-cultura
[00136] Nestes estudos, como no Exemplo 13, foi usada uma etapa de pré-cultura (5 dias 23 °C, escuridão em BGM). Um a hidratação de uma hora do explante excisado a seco em meio INO também foi feita antes da etapa de pré-cultura. Cerca de 12 mL de WPM líquido contendo 150 ppm de espectinomicina foram distribuídos para dentro de PLANTCON de cocultura depois do período de cocultura, e os explantes foram plaqueados sobre a superfície de WPM sólido contendo 150 ppm de espectinomicina 4 dias depois. Neste exemplo, os brotos verdes fenótipo-positivos foram identificados em cerca de 4 semanas da regeneração e transferidos do meio de regeneração WPM para bandejas que contêm o Oasis® Wedge System (Smithers-Oasis USA; Kent, OH) e um meio líquido simplificado (0,5 g/L de WPM com 0,25 mg/L de IBA). As plantas R0 enraizadas e brotadas foram obtidas 2 a 4 semanas depois. Na totalidade, a pré-cultura nestes estudos melhorou também a % de TF (Tabela 31). A porcentagem de eventos de qualidade indicada abaixo (Tabela 22) refere-se à proporção de eventos transgê- nicos que demonstram a presença de 1-2 cópias de um gene de interesse (GUS) e também de um gene marcador (aadA) pelo ensaio Invader®. A TF isenta de marcador (mTF) refere-se à % de eventos sem gene marcador.Tabela 31: Frequência de transformação e qualidade observadas a partir de explantes integrais regenerados
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Exemplo 17 Produção de plantas de soja transgênicas usando embriões de soja secos, espectinomicina, e transferência de explante integral regenerado com uma etapa de pré-cultura
[00137] Neste exemplo, foram usados explantes estocados 3 meses, e uma etapa de hidratação de 1 h feita em INO foi utilizada, no explante excisado a seco. A pré-cultura foi realizada por 5 dias a 23 °C em condições de escuridão, em BGM com 50 ppm de nistatina e 10 ppm de TBZ como fungicidas. TDZ e ácido lipóico foram adicionados ao inóculo e também ao meio de cocultura (INO). A construção pMON107379 era um vetor com 2T convencional que compreende oriRi e o gene aadA, e a cocultura foi feita por 5 dias. Depois da cocul- tura, os explantes foram plaqueados sobre a superfície de WPM sólido e depois transferidos para o Oasis® Wedge System (Smithers-Oasis USA; Kent, OH) com um meio líquido simplificado (0,5 g/L de WPM com 0,25 mg/L de IBA). Como indicado na Tabela 32, a pré-cultura de explantes secos aumentou a TF. Assim sendo, os explantes com 3 meses de idade estocados puderam se desempenhar similarmente aos explantes secos recém-excisados. Além disso, a adição de nistati- na (50 ppm) e tiabendazol (10 ppm) ao meio de cocultura INO dissolvidos em DMSO (1,0 mL de DMSO por litro de INO) melhorou a saúde dos explantes, provavelmente por controlar leveduras e fungos encontrados comumente dentro das ementes e sobre elas, e podem ser usada como uma ferramenta útil quando se realiza cultura de tecidos grandes e/ou automatizadas.Tabela 32: Efeito da pré-cultura sobre a TF (%) de explantes secos estocados
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[00138] Todas composições e métodos aqui descritos e reivindicados pode ser feitos e executados sem experimentação excessiva à luz do presente relatório descritivo. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos das modalidades ilustrativas precedentes, deve ficar evidente para os versados nessas técnicas que variações, mudanças, modificações, e alterações podem ser aplicadas às composições, métodos, e nas etapas ou na sequência de etapas dos métodos aqui descritos, sem fugir do verdadeiro conceito, espírito e âmbito da invenção. Mais especificamente, deve ficar evidente que certos agentes que estão quimicamente e também fisiologicamente relacionados podem substituir os agentes aqui descritos, e ao mesmo tempo, resultados iguais ou similares podem ser atingidos. Todos esses substitutos similares e modificações evidentes para os versados nessas técnicas são julgados como estando dentro do espírito, âmbito e conceito da invenção como definida pelas reivindicações apensadas. REFERÊNCIAS As referências que se seguem, até o grau em que elas for-necem detalhes de procedimentos ou outros detalhes suplementares àqueles aqui enunciados, são aqui especificamente incorporadas como referência. Patente número US 4,761,373; Patente número US 4,810,648; Patente número US 5,013,659; Patente número US 5,015,580; Patente número US 5,073,675; Patente número US 5,094,945; Patente número US 5,141,870; Patente número US 5,164,310; Patente número US 5,217,902; Patente número US 5,229,114; Patente número US 5,273,894; Patente número US 5,276,268; Patente número US 5,322,938; Patente número US 5,352,605; Patente número US 5,359,142; Patente número US 5,362,865; Patente número US 5,378,824; Patente número US 5,463,175; Patente número US 5,512,466; Patente número US 5,512,466; Patente número US 5,538,880; Patente número US 5,543,576; Patente número US 5,550,318; Patente número US 5,561,236; Patente número US 5,563,055; Patente número US 5,591,616; Patente número US 5,605,011; Patente número US 5,608,149; Patente número US 5,627,061; Patente número US 5,633,435; Patente número US 5,633,437; Patente número US 5,637,489; Patente número US 5,646,024; Patente número US 5,689,041; Patente número US 5,693,512; Patente número US 5,731,179; Patente número US 5,750,876; Patente número US 5,767,366; Patente número US 5,824,877; Patente número US 5,850,019; Patente número US 5,869,720; Patente número US 5,914,451; Patente número US 5,958,745; Patente número US 5,981,834; Patente número US 5,981,840; Patente número US 5,985,605; Patente número US 5,998,700; Patente número US 6,011,199; Patente número US 6,040,497; Patente número US 6,072,103; Patente número US 6,080,560; Patente número US 6,140,075; Patente número US 6,166,292; Patente número US 6,171,640; Patente número US 6,225,105; Patente número US 6,228,623; Patente número US 6,265,638; Patente número US 6,271,443; Patente número US 6,380,462; Patente número US 6,380,466; Patente número US 6,384,301; Patente número US 6,414,222; Patente número US 6,426,447; Patente número US 6,444,876; Patente número US 6,459,018; Patente número US 6,476,295; Patente número US 6,483,008; Patente número US 6,489,461; Patente número US 6,495,739; Patente número US 6,531,648; Patente número US 6,537,750; Patente número US 6,538,178; Patente número US 6,538,179; Patente número US 6,538,181; Patente número US 6,541,259; Patente número US 6,576,818; Patente número US 6,589,767; Patente número US 6,596,538; Patente número US 6,613,963; Patente número US 6,653,530; Patente número US 6,660,849; Patente número US 6,706,950; Patente número US 6,723,837; Patente número US 6,770,465; Patente número US 6,774,283; Patente número US 6,812,379; Patente número US 6,822,141; Patente número US 7,022,896; Patente número US 6,828,475; Patente número US 5,106,739; Patente número US 5,378,619; Patente número US 5,530,196; Patente número US 5,641,876; Patente número US 5,659,122; Patente número US 5,837,848; Patente número US 6,051,753; Patente número US 6,140,078; Patente número US 6,175,060; Patente número US 6,177,611; Patente número US 6,232,526; Patente número US 6,252,138; Patente número US 6,294,714; Patente número US 6,426,446; Patente número US 6,429,357; Patente número US 6,429,362; Patente número US 6,433,252; Patente número US 6,437,217; Patente número US 6,635,806; Patente número US 7,002,058; Patente número US 7,288,694. Patente número US RE37,543 Publicação de Pedido de Patente número US 2005/0005321; Publicação de Pedido de Patente número US 2006/0059589; Publicação de Pedido de Patente número US 2003/0028917; Publicação de Pedido de Patente número US 2003/0083480; Publicação de Pedido de Patente número US 2003/0115626; Publicação de Pedido de Patente número US 2003/0135879; Publicação de Pedido de Patente número US 2003/110532; Publicação de Pedido de Patente número US 2004/0177399; US Patent Application Publication No. 2004/0244075; Publicação de Pedido de Patente número US 2005/0183170; Publicação de Pedido de Patente número US 2005/0022261; Publicação de Pedido de Patente número US 2006/0200878; Publicação de Pedido de Patente número US 2007/0271627. Bevan et al., Nature, 304:184-187, 1983 Broothaerts et al., Nature 433:629-633, 2005. Callis et al., Plant Physiol., 88:965-968, 1988. Carrington e Freed, J. Virology, 64:1590, 1990. Chai et al., Seed Science Research 8 (Supplement 1):23- 28, 1998. 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Claims (59)

1. Método para produzir uma planta de soja, algodão ou canola transgênica que contém pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos heterólogas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) disponibilizar um explante que compreende uma primeira sequência de ácido nucleico heteróloga que confere resistência a um herbicida; (b) transformar o explante para compreender uma segunda sequência de ácido nucleico heteróloga que compreende um gene marcador selecionável que confere resistência à espectinomicina, em que o referido marcador selecionável é codificado por um gene aadA que é fusionado a uma sequência codificando um peptídeo de trânsito de cloroplasto; e (c) regenerar um explante que apresenta resistência à es- pectinomicina para dar uma planta transgênica que contém pelo menos as duas sequências de ácido nucleico heterólogas.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o explante compreende um meristema embrionário.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência de ácidos nucleicos heteróloga confere resistência a glifosato, bialafos, fosfinotricina, Basta, glufosina- to, 2,4-D, canamicina e aminoglicosídeos afins, higromicina, um inibidor de acetil-coA carboxilase, um gerador de radicais oxigênio, ou di- camba.
4. Método para produzir uma planta de soja, algodão ou canola transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar pelo menos um primeiro explante de semente com uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga que compreende um marcador selecionável que confere tolerância à espectinomici na, em que o referido marcador selecionável é codificado por um gene aadA que é fusionado a uma sequência codificando um peptídeo de trânsito de cloroplasto; e (b) regenerar uma planta transgênica a partir das células transformadas, onde o explante é colocado, antes, concomitantemente e/ou depois da etapa (a) ou etapa (b), em contato com pelo menos um primeiro meio que compreende espectinomicina, para selecionar células transformadas que compreendem um marcador selecionável.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta transgênica origina-se a partir da transformação de um meristema que resulta na transformação de um tecido de linha germinal.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta resultante é não-quimérica.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta resultante é quimérica.
8. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o primeiro explante de semente compreende um transgene.
9. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o explante é estocado em uma temperatura entre - 80oC e temperatura ambiente durante entre 1 hora e 7 dias antes da etapa (a).
10. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o explante compreende um meristema embrionário.
11. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o meio compreende entre 15 mg/L e 1.500 mg/L de espectinomicina.
12. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as células do explante compreendem uma sequência codificadora que confere tolerância a glifosato, bialafos, fosfinotricina, Basta, glufosinato, 2,4-D, canamicina e aminoglicosídeos afins, higro- micina, estreptomicina, ampicilina ou dicamba.
13. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que durante ou depois da etapa (a), os explantes são de-senvolvidos na presença de um agente seletivo a 35 oC-40 oC por 3-5 dias e/ou são desenvolvidos sob condições de iluminação que permitem o desenvolvimento normal de plastídeos.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o desenvolvimento a 35 oC-40 oC é realizado por 3-5 dias ou as condições de iluminação compreendem pelo menos 5 einsteins com pelo menos um fotoperíodo de 16 horas de 16 horas de luz/8 horas de escuridão.
15. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende desenvolver uma explante em um meio de cocultura que compreende espectinomicina.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o explante não é colocado em contato com um meio que compreende espectinomicina depois de ser transferido de um meio de cocultura.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o explante é colocado em contato com um meio que compreende espectinomicina depois de ser transferido de um meio de cocultura.
18. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico heterólogo compreende ainda uma sequência codificadora que confere um traço de interesse agronômico ou melhor uso final.
19. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende transformar a célula do ex-plante com pelo menos um segundo ácido nucleico heterólogo.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o segundo ácido nucleico heterólogo compreende uma sequência codificadora que confere tolerância a herbicidas.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo ácidos nucleicos heterólo- gos são integrados em diferentes loci dentro do genoma da célula.
22. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, antes da etapa (a), a etapa de condicionamento osmótico (priming) da semente, em que o condicio-namento osmótico compreende colocar a semente em contato com uma citocinina.
23. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda colocar o explante em contato com uma citocinina antes, concomitantemente e/ou depois da etapa (b).
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a citocinina é selecionada no grupo que consiste em tidiazuron, BAP (6-benzil-amino-purina), cinetina, CPPU (N-(3- cloro-4-piridil)-N'-feniluréia), 2iP (6-(y,y-dimetil-alil-amino)-purina), zea- tina, zeatina-ribose, adenina, e TIBA (ácido 2,3,5-triiodo-benzóico).
25. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende colocar o explante em contato com rizobiáceas recombinantes que compreendem o dito ácido nucleico heterólogo, em que as rizobiáceas foram expostas a tidiazuron antes ou concomitantemente com a colocação em contato do explante com as rizobiáceas recombinantes.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a rizobiácea é exposta a tidiazuron durante entre 1 e 5 dias antes da colocação em contato do explante com a rizobiácea recombinante.
27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que as rizobiáceas são colocadas em suspensão na presença de um agente seletivo ativo contra um explante transformado antes de colocar os explantes em contato com as rizobiáceas.
28. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que as rizobiáceas são selecionadas no grupo que consiste em Agrobacteria, Sinorhizobia, Mesorhizobia, e Rhizobia.
29. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que os explantes são desenvolvidos na presença de um fungicida antes, durante ou depois da etapa (a).
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que os explantes são desenvolvidos na presença de um fungicida e DMSO.
31. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que os explantes são desenvolvidos na presença de nistatina, tiabendazol, e DMSO.
32. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de (c) obter uma planta progênita de qualquer geração da planta transgênica que compreende o gene que confere o traço de interesse e carece do marcador selecionável.
33. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico heterólogo compreende um primeiro segmento de DNA que compreende bordas esquerda e direita do T- DNA, flanqueando um gene que confere um traço de interesse; e um segundo segmento de DNA que compreende um segundo conjunto de bordas esquerdo e direito do T-DNA, flanqueando o dito marcador se- lecionável que confere tolerância à espectinomicina.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de (c) obter uma planta progênita de qualquer geração da planta transgênica que compreende o gene que confere o traço de interesse e carece do marcador selecionável.
35. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico heterólogo compreende bordas direita e esquerda do T-DNA e primeiro e segundo segmentos de DNA, em que o primeiro segmento de DNA compreende um gene de interesse localizado depois da borda direita, e em que o segundo segmento de DNA compreende o marcador selecionável localizado depois da borda esquerda.
36. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico heterólogo compreende a primeira e segunda bordas direitas do T-DNA, em que um primeiro segmento de DNA que compreende um gene de interesse fica localizado depois da primeira borda direita, e um segundo segmento de DNA que compreende o marcador selecionável fica localizado depois da segunda borda direita.
37. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar o dito explante em meio carecido de espectinomicina por 1 a 7 dias durante a etapa (b).
38. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a colocação do explante em contato com pelo menos um primeiro meio que compreende espectinomicina é durante entre 15 minutos e 7 dias.
39. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o marcador selecionável é codificado por aadA.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que aadA compreende SEQ ID NO: 1.
41. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o gene aadA é fundido a um peptídeo de trânsito de cloroplasto.
42. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que aadA compreende SEQ ID NO: 2.
43. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o explante é definido ainda como tendo sido mantido antes da etapa (b) sob condições nas quais o explante não germina e permanece viável e competente para transformação genética.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as ditas condições compreendem desidratar o explante ou uma semente que compreende o explante.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que compreende ainda aumentar o teor de umidade do explante antes ou concomitantemente com a etapa (b).
46. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as ditas condições compreendem um teor de umidade interna do explante de menos de 8%.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que as ditas condições compreendem um teor de umidade interna do explante entre 4-6%.
48. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as ditas condições compreendem uma temperatura de temperatura ambiente até -80 °C.
49. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o condicionamento osmótico (priming) do explante antes da etapa (b).
50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o condicionamento osmótico (priming) da semente compreende colocar o explante ou uma semente que compreende o explante em contato com uma solução aquosa que compreende água, um regulador de crescimento de plantas, um agente de seleção, ou um condicionador da membrana celular.
51. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a transformação de pelo menos uma primeira célula do explante com um ácido nucleico heterólogo é conduzida por trans-formação mediada de forma bacteriana ou bombardeio de microprojé- teis.
52. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o explante é definido ainda como tendo sido excisado de uma semente que compreende 4% e 8% de teor de umidade interna, ou uma semente hidratada ou germinante, ou compreende um tecido do grupo que consiste em: meristema, embrião imaturo, embrião, eixo embrionário, cotilédone, hipocotilédone, mesocótilo, folha, base foliar primária, disco foliar, ponta de broto, e plúmula.
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o explante é definido ainda como tendo sido exci- sado de uma semente germinada ou embebida.
54. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o explante não é colocado em contato com um meio que compreende espectinomicina depois da etapa (a).
55. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o primeiro meio é um líquido.
56. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que uma ou mais etapas (a)-(b) são automatizadas.
57. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende duas sequências que conferem resistência a es- pectinomicina ou estreptomicina, em que a primeira sequência está operacionalmente ligada a um promotor ativo em uma célula vegetal, e a segunda sequência está operacionalmente ligada a um promotor ativo em uma célula procariótica.
58. Construção, de acordo com a reivindicação 57, caracte- rizada pelo fato de que as sequências que conferem resistência a es- pectinomicina ou estreptomicina codificam um polipeptídeo que com-preende atividade de aminoglicosídeo-3'-adeniltransferase (aadA).
59. Construção, de acordo com a reivindicação 57, caracte-rizada pelo fato de que pelo menos uma das sequências compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.
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