KR100402513B1 - 유전자 조작을 통한 식물체의 효과적인 형질전환 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자 조작 기술을 이용하여 식물체를 형질전환시키는 방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 적절한 목적 조직을 선택하고 효과적인 상처 방법을 사용하여 제초제 저항성을 나타내는bar유전자가 포함된 아그로박테리움을 식물체에 도입하는 식물체 형질전환 방법에 관한 것이다. 본 발명의 개량된 형질전환 방법을 이용하여 종래 품종보다 향상된 품종의 식물체를 생산할 수 있다.

Description

유전자 조작을 통한 식물체의 효과적인 형질전환 방법{Efficient method for the development of transgenic plants by gene manipulation}

본 발명은 유전자 조작 기술을 이용하여 식물체를 형질전환시키는 방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 적절한 목적 조직을 선택하고 효과적인 상처방법을 사용하여 식물체, 특히 대두 식물체에 유용한 유전자를 도입하는 개량된 식물체 형질전환 방법과 이를 이용하여 얻은 형질전환체를 제공하는 것이다.

대두는 세계적으로 매우 중요한 농작물로서, 5천만 헥타르 (hectar) 이상의 면적에서 재배되고 있으며 매년 1억 톤이 넘는 대두가 생산되고 있다. 따라서 병 저항성, 제초제 저항성 및 영양학적 질을 향상시킨 신품종을 생산하면 큰 경제적 이익을 얻을 수 있다. 대두의 품종을 개선하기 위하여 돌연변이법, 교잡 및 자연선별법과 같은 고전적 육종 방법이 수행되어 왔으나 만족할만한 신품종을 생산하고 있지는 않다. 따라서 보다 개량된 품종 개발 방법이 요구되고 있으며, 최근 발달한 유전공학적 분자 육종 방법을 적용하여 기능성 유전자를 식물체에 이식 발현시켜 원하는 형질을 얻을 수 있는 방법이 개발되고 있다. 유전공학적 분자 육종 방법은 전통적인 교배 육종 방법과는 달리 우수한 품종의 유전 형질을 그대로 유지하면서 새로운 기능성 유전자의 이식이 가능하고, 단시간 내에 효율적인 육종이 가능하다는 특징을 갖는다 (Altenbachet al.,Plant Mol. Biol. 13: 513-522, 1989).

유전공학적 분자 육종 방법을 성공적으로 수행하기 위해서는 적합한 목표 시료를 얻는 방법, 목표하는 세포 내로 외래 유전자를 효과적으로 이식시키는 방법 그리고 형질전환된 세포로부터 완전한 식물체를 얻는 재분화 기술이 필요하다. 효과적인 식물 세포의 형질전환을 위한 방법으로는 아그로박테리움과 같은 생물학적 벡터를 이용하여 식물 세포로 외래 유전자 DNA를 전달하는 방법과 DNA로 코팅한 미세 입자를 투사하는 방법, 전기천공법, 초음파처리법 및 미세주사법과 같이 식물세포내로 외래 유전자 DNA를 직접 전달하는 방법들이 있다 (Hansen and Wright,Trends Plant Sci.4: 226-231, 1999). 특히 옥수수, 쌀, 보리, 밀 및 대두 등 주요 작물에 미세입자 투사 방법으로 형질전환한 사례가 있으나 외래 유전자 DNA가 반드시 재분화 가능한 세포내로 투입되어야 하고, 외래 유전자가 식물 세포내로 이식, 삽입되는 패턴이 매우 다양하다는 문제점이 있다 (De block M.Euphytica. 71: 1-14, 1993).

최근 가장 일반적으로 이용되고 있는 식물 형질전환 기술은 식물 병원균인아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens)을 벡터로 이용하는 것이다. 이들 세균은 그들의 Ti (tumor-inducing) 또는 Ri (root-inducing) 플라스미드 DNA중 일부인 T-DNA를 감염된 식물 세포내로 전이시키는 능력을 갖고 있다. 따라서, 목적 유전자를 T-DNA내에 재조합한 후 이를 보유한 균과 식물체를 공동 배양하면 식물 세포의 형질전환이 가능해진다 (Binnset al.,Ann Rev Microbiol. 42: 575-606, 1988). 한편, 아그로박테리움을 이용한 형질전환 효율을 높이기 위해 목적 조직을 칼로 절단하거나 입자로 충격을 주는 방법 (미국 특허 제 5,792,935호) 혹은 초음파를 이용하는 방법 (미국 특허 제 5,693,512호)등이 이용되었으나 효과가 크지 않았다. 또한, 떡잎 마디에서 신초의 재분화가 가능하기 때문에 (Barwaleet al.,Planta.167: 473-481, 1986) 이 조직을 목적 조직으로 사용하여 형질전환한 보고가 있다 (미국 특허 제 5,824,877호). 그러나, 이 경우 4-5일 발아된 떡잎 마디를 사용하였고 형질전환 및 재분화 효율이 매우 낮았다. 이와 같이 아직까지 대두의 형질전환 및 재분화의 효율이 매우 낮고, 키메라 (chimera)현상이 나타나며, 재현성이 낮은 문제점들이 발생하기 때문에 보다 효율적이면서 안정성 있는 대두의 형질전환 기술의 개발이 요구되고 있다.

이러한 요구에 따라, 본 발명가들은 대두의 효율적인 품종 개량 방법에 대한 연구를 수행하였으며, 그 결과 재배종 대두 준저리의 하루 발아된 떡잎 마디를 사용하고, 이 목적 조직에 적당한 상처 처리를 하여 유용한 목적 유전자를 도입하여 대두의 형질전환 효율을 높임으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 유용한 목적 유전자를 포함하는 아그로박테리움을 이용하여 식물체를 형질전환시키는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 형질전환 방법을 이용하여 생산된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

도 1은 아그로박테리움의 T-DNA에bar유전자와gfp유전자를 도입하여 제작한 재조합 유전자 pGB의 개략도이고,

도 2는 형질전환용 플라스미드 pGB를 재조합한 후 전기영동하여 확인한 결과이고,

도 3은 형질전환의 목적 조직으로 사용된 떡잎 마디를 포함한 하루 발아된 반쪽 씨앗의 사진이고,

도 4는 형질전환을 실시한 떡잎 마디 절편에서 다신초를 유도한 사진이고,

도 5는 제초제 PPT (phosphinothricin)가 첨가된 배지에서 선별된 형질전환체를 비형질전환체와 비교하여 나타낸 사진이고,

도 6은 식물체에 외래 유전자가 도입되었음을 확인하기 위하여 형질전환체의 게놈 DNA를 대상으로bar유전자를 PCR로 증폭하고 서던 블럿을 수행한 결과이며,

도 7은 형질전환체의bar유전자를 게놈 서던 블럿으로 확인한 결과이며,

도 8은 형질전환체의bar유전자의 발현을 노던 블럿으로 확인한 결과이고,

도 9는 토양에서 자라는 형질전환체의 사진이며,

도 10은 형질전환체의 제초제 저항성을 비형질전환체와 비교하여 나타낸 사진이며,

도 11은 토양에서 자라는 형질전환체의 후대 식물체의 사진이고,

도 12는 후대 형질전환체의 게놈 DNA를 대상으로bar유전자와gfp유전자에 대해 PCR 증폭과 서던 블럿을 수행한 결과이며,

도 13은 형질전환체에 이식된gfp(green fluorescence protein) 유전자의 발현을 공초점 형광 현미경으로 관찰한 결과이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은

1) 분열이 왕성한 하루 발아시킨 반쪽 씨앗을 목적 조직으로 선택하고;

2) 목적 조직을 침 다발로 찔러 상처를 입히고;

3) 재조합 목적 유전자를 포함한 아그로박테리움을 사용하여 목적 유전자를 도입시키고;

4) 발아시킨 떡잎 마디 절편의 재분화를 유도하고;

5) 형질전환 식물체를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로하는 식물의형질전환 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물 형질전환 방법을 이용하여 생산된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서 "키메라"라 함은 유전적으로 상이한 세포들로 구성된 잡종 식물체로서 목적 유전자를 포함한 세포와 목적 유전자를 포함하지 않은 세포를 동시에 지니고 있는 식물체를 말한다.

본 발명에서 "목적 유전자"라 함은 유용한 단백질을 암호화하는 유전자로서 아그로박테리움에 의해 식물체로 도입될 유전자를 말한다.

또한, "형질전환체" 또는 "형질전환 식물체"라 함은 목적 유전자를 포함한 아그로박테리움이 도입된 식물체를 의미한다.

이하 본 발명을 식물체 중 대두를 예로 들어 상세히 설명한다.

본 발명은 대두 식물체에 목적 유전자를 도입하여 신품종의 대두를 생산하는 방법에 관한 것으로써 목적 유전자들은 동물, 식물 및 미생물 등 다른 종으로부터 유래된 유전자 모두가 사용될 수 있다. 즉, 대두의 형질전환에는 병충해 및 제초제 등에 대한 저항성을 나타낼 수 있는 효소 유전자, 대두의 수량 또는 종자의 단백질 및 지방산 품질을 향상시키는 효소 유전자 등과 같은 다양한 목적 유전자들이 이용될 수 있으며, 상기 목적 유전자는 박테리아, 곰팡이, 효모, 바이러스 등과 같은 미생물뿐만 아니라 식물 및 동물에서 유래한 어떠한 유전자라도 활용이 가능하다.

본 발명에서 목적 유전자 카세트는 형질전환된 식물체에서 목표하는 형질을 부여할 수 있는 유용 유전자 재조합체이다. 따라서, 형질전환 식물체의 고유성은 이 목적 유전자에 의해 결정될 수 있다. 상기 목적 유전자 카세트를 제작하기 위해 본 발명에서 사용된 DNA 벡터는 프로모터 (promoter) 및 터미네이터 (terminator) 같은 발현 조절 부위 (regulatory sequence), 전사 개시 부분, 번역 개시 코돈, 단백질의 아미노산 암호화 부위 및 번역 정지 코돈으로 구성된 발현카세트를 포함하고 있으며, 적어도 한 개 이상의 복제 원점 (origin of replication)을 지니고 있다.

형질전환에 사용되는 재조합 유전자는 복제 원점 외에도 선별 유전자 (selectable gene), 표지 유전자 (marker gene) 및 목적 유전자 (target gene)등이 유전자 발현 카세트로 구성된다. 제초제 저항성 유전자를 목적 유전자로 사용할 경우 그 유전자 자체가 유용한 유전자일 뿐만 아니라 선별 유전자로도 이용될 수 있기 때문에 한 개의 발현 카세트로 목적 유전자와 선별 유전자를 함께 발현시킬 수 있다. 선별 유전자로는 NPTII (neomycinphosphotransferase), HPT (hygromycin phosphotransferase), CAT (chloramphenicol acetyltransferase), 니트릴레이즈 (nitrilase) 및 겐타마이신 (gentamicin) 저항성 유전자 등을 사용하며, 상기 유전자들은 항생물질, 독소 및 중금속과 같은 생물독 (biocide)에 대해 내성을 부여한다.

또한, 인디고를 생산하는GUS(b-glucuronidase),CAT, 가시적 빛을 생산하는 루시퍼레이즈 (luciferase) 및 녹색 형광 물질을 발산하는gfp(green fluorescent protein) 유전자 등이 표지 유전자로 사용된다.

형질전환을 위한 목적 조직으로는 일반적으로 배아, 줄기, 정단 및 떡잎 마디의 분열 조직, 캘러스와 같은 유도된 분열 조직이 이용된다. 본 발명의 일 실시예에서는 반쪽 씨앗의 떡잎 마디가 목적 조직으로 이용되었다. 하루 발아시킨 반쪽 씨앗의 떡잎 마디는 매우 왕성하게 세포 분열이 이루어지고 있고 DNA 합성도 높기 때문에 아그로박테리움 접종시 목적 유전자가 식물 세포내로 이식될 가능성이높다 (Binnset al.,Ann Microbiol. 42: 575-606, 1988). 또한, 하루 발아시킨 반쪽 씨앗의 떡잎 마디는 세포 분열이 왕성하지만 아직 충분히 분열되지 않았기 때문에 형질전환이 되면 원기 (primordia)를 형성할 수 있는 단세포에서 이루어질 가능성이 높아 키메라를 줄일 수 있다. 발아 6일 또는 6일 이후의 유식물체 (seedling) 및 절편을 목적 조직으로 사용하면 이미 여러 원기가 형성되어 있기 때문에 키메라가 형성될 가능성이 높다고 알려져 있다 (Wrightet al.,Plant Cell Reports. 5: 150-154, 1986). 구체적으로 본 발명에서는 1일, 2일, 4일 및 14일 발아시킨 떡잎 마디를 대상으로 형질전환 효율을 비교하였다. 표 4에서와 같이 실질적으로 하루 발아시킨 반쪽 씨앗의 떡잎 마디를 목적 조직으로 이용한 경우에 형질전환 효율이 가장 높았다. 반면 2일, 4일 및 14일 발아시킨 떡잎 마디를 목적 조직으로 사용했을 경우 형질전환 효율이 현저히 감소하였다

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 반쪽 씨앗을 목적 조직으로 이용하여 형질전환을 수행하기 위해 재조합 벡터를 제작하였다. 재조합 벡터의 제작에는 제초제 저항성 유전자bar를 선별 유전자로 사용하였고, 초기에 형질전환된 식물체를 선별하기 위하여 녹색 형광을 나타내는gfp유전자를 표지 유전자로 사용하였다. 도 1에서와 같이 상기 유전자들은 아그로박테리움의 T-DNA 상의 우측 경계 (RB)와 왼쪽 경계 (LB)사이에 도입되었고 각각 NOS 프로모터와 NOS 터미네이터, 35S 프로모터와 NOS 터미네이터의 발현 카세트로 구성되어 있다.

본 발명의 다른 실시예에서는 재배종 대두를 제초제 저항성 유전자로 형질전환을 시켰다. 멸균한 종자를 16-24시간 발아시킨 후 반쪽 씨앗을 취했고 이것을목적 조직으로 사용하여 (도 3 참조) 제초제 저항성 유전자를 포함한 아그로박테리움과 공동 배양하여 형질전환을 실시하였다. 이후 도 4에서와 같이 제초제를 포함한 배지에서 신초를 선별하였고, 최종적으로 1ppm의 PPT가 포함된 배지에서 2주간 키워 재선별을 실시하여 (도 5 참조) 표 1에서와 같이 2.5%의 효율로 형질전환체를 얻었다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 형질전환 효율을 높이기 위하여 여러 개의 묶은 침다발, 바람직하게는 30개로 묶은 침다발로 목적 조직 부위에 상처를 입혔다. 대두의 선단 조직이나 떡잎 마디 등을 이용한 재분화 과정에서는 신초의 유도가 캘러스 단계를 거치지 않고 바로 목적 조직의 내부 세포에서 유도 형성된다. 아그로박테리움을 이용하여 형질전환을 수행할 경우 아그로박테리움이 반드시 목적 조직의 세포 부위까지 접근이 되어야 형질전환이 용이해질 수 있기 때문에 신초가 유도되는 조직 내부 세포 부위까지 상처를 입히는 것이 매우 중요하다. 상기 30개로 묶은 침다발로 목적 부위를 1-2mm 깊이로 상처를 낸 후 아그로박테리움을 접종한 경우 표 2에서와 같이 형질전환체를 얻는 효율이 8배 이상 향상되었으며, 한 개의 침을 사용하여 여러 번 상처를 낸 경우와 비교한 결과에서도 역시 효율이 현저히 높음을 알 수 있었다 (표 3 참조). 또한 품종에 따른 형질전환 효율을 비교하기 위하여 재배종 준저리와 단엽, 팔달에 각각 아그로박테리움으로 제초제 저항성 유전자를 도입하고 형질전환 효율을 비교한 결과 표 5에서와 같이 재배종 준저리의 형질전환 효율이 팔달 및 단엽에 비해 각각 15배 및 7배 높게 나타났다. 따라서 형질전환시 재배종 준저리를 사용하는 것이 보다 효과적임을 알 수 있었다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기와 같이 생산된 형질전환체를 대상으로 실지로 형질전환 식물체들이 외부 유전자를 포함하고 있는가를 확인하기 위해 PCR증폭, 서던 블럿 및 노던 블럿을 수행하였고 도 6, 7 및 8에서와 같이 외부 유전자인bar유전자가 형질전환체에서 안정적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 상기와 같이 생산된 형질전환체의 제초제에 대한 저항성을 확인하기 위하여 제초제 100ppm을 식물체의 잎에 발라주고 비형질전환 식물체와 비교하였다. 도 10에서와 같이 비형질전환 식물체의 경우 잎이 변하면서 죽어가는 반면 형질전환체는 건강히 자란 것을 확인할 수 있었고, 상기 형질전환체에서 얻어진 종자를 토양에서 발아시켜 도 11의 후대 식물체를 얻을 수 있었다. 후대 식물체를 대상으로bar유전자를 PCR로 증폭하고 서던 블럿을 실시한 결과 도 12에서와 같이 제초제 저항성 유전자가 안정하게 발현되는 것을 확인하여 외부 유전자가 확실하게 도입되어 있음을 확인할 수 있었다.

상기의 결과와 같이 본 발명의 형질전환 방법을 이용하여 유용한 유전자가 도입된 형질전환 식물체를 생산할 수 있으며, 형질전환에 사용될 수 있는 식물의 예로는 상기의 재배종 대두 이외에 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수와 같은 식량작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근과 같은 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채와 같은 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나와 같은 과수류, 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립과 같은 화훼류 및라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스와 같은 사료작물류 등이 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 제초제 저항성을 부여하는 bar 유전자가 도입된 형질전환용 재조합 플라스미드의 제작

대두의 형질전환에 사용하기 위하여 재조합 플라스미드 pGB를 제작하였다 (도 1 참조). 재조합 플라스미드 pGB는 식물형질전환용 T-DNA 플라스미드 pGA643에 선별유전자로 제초제 저항성 유전자bar를 도입하고, 표지 유전자로 녹색 형광 단백질 유전자gfp를 도입하여 제작하였다. 제초제 PPT에 대한 저항성을 부여하는bar유전자의 발현 카세트는 NOS (nopaline synthase) 프로모터와 NOS 터미네이터로 구성되어 있고,gfp는 35S 프로모터와 NOS 터미네이터로 구성되어 있다. 재조합된 플라스미드 pGB는 각각ClaI과EcoRI 제한효소로 이중 절단하거나KpnI 제한효소로 절단한 후 아가로스 겔상에서 전기영동하여 확인하였고 (도 2 참조), 염기서열분석을 통하여 최종 확인하였다.

<실시예 2> 형질전환을 위한 목적 조직의 선택 및 형질전환

재조합 플라스미드를 도입시킬 목적 조직을 선택하였고 아그로박테리움을 사용하여 형질전환시켰다.

2-1) 목적 조직의 선택

본 발명에서는 형질전환 효율이 높은 재배종 준저리 품종을 사용하였다. 대두의 성숙 종자를 70% 에탄올에서 1분, 20% 락스 용액 (5.25% sodium hypochlorate)에서 12분간 침지하여 표면 살균하고 멸균한 2차 증류수로 4회 정도 세척한 후 쉽게 상처를 입힐 수 있도록 16-24 시간 동안 멸균한 증류수에 담가 실온에서 발아시켰다. 또한, 완전한 종자는 조작이나 상처를 입히기가 쉽지 않기 때문에 반쪽 씨앗을 형질전환에 사용하였다. 칼로 완전한 종자를 떡잎 마디 방향으로 이등분하여 어린 눈이 있는 반쪽 씨앗을 얻었고 (도 3 참조), 본 발명의 목적 조직으로 사용하였다.

2-2) 재조합 플라스미드에 의한 형질전환

실시예 2-1)에서 얻은 반쪽 씨앗을 재조합 플라스미드 pGB를 보유한 아그로박테리움과 3일간 발아 배지 (MS 염 용액 (1/2 Murashige와 Skoog), 비타민 용액 (Gamborg B5), 벤질아데닌 1 ppm)에서 공동 배양하여 형질전환을 실시하였다. 이때 형질전환 효율을 높이기 위하여 100 μM 아세토시린곤을 배지에 첨가하였다. 공동 배양 후 추가로 10 일간 발아 배지에서 발아시킨 후 떡잎 마디를 분리하고 1 ppm의 PPT가 포함된 발아배지에서 3 주간 배양하여 다신초를 선별 유도하였다 (도4 참조). 독립된 형질전환체를 선별하기 위해 서로 멀리 떨어진 신초를 잘라서 2 ppm의 PPT를 함유한 뿌리 유도 배지 (MS 염 용액 (1/2 Murashige와 Skoog), 비타민 용액 (Gamborg B5))에서 2 주간 재선별을 실시하였다. 형질전환되지 않은 신초는 색깔이 변하면서 죽어가는데 비해 형질전환된 신초는 뿌리를 내리면서 성장하였다 (도 5 참조). 뿌리가 유도된 신초는 3 주간에 걸쳐서 점차로 뚜껑을 열어주는 순화 과정을 거쳐 토양으로 옮겼다. 표 1에서와 같이 재조합 플라스미드로 도입된 아그로박테리움에 의한 형질전환 효율은 2.5% 이었다.

<실시예 3> 형질전환 효율의 향상을 위한 목적 조직의 상처 방법

형질전환 효율을 향상시키기 위하여 아그로박테리움 접종 부위인 반쪽 씨앗의 떡잎 마디에 적절한 상처를 입혔다.

3-1) 침다발 접종에 의한 형질전환 효율 향상

효과적으로 상처를 내기 위하여 30개의 침을 묶은 침다발로 1-2mm 깊이로 찔러 상처를 낸 후 아그로박테리움을 접종하였다. 이때 형질전환 효율이 21%로써, 하기 표 2에서 보는 바와 같이, 상처를 입히지 않고 아그로박테리움을 접종한 형질전환 효율에 비해 8배 이상 향상된 것을 볼 수 있었다.

특히, 단순한 아그로박테리움 공동 배양에서는 형질전환 신초를 한차례밖에 얻을 수 없었지만 침다발로 접종한 경우에는 접종한 떡잎 마디에서 형질전환 신초가 계속적으로 재분화되어 최소한 3 차례에 걸쳐 형질전환체를 얻을 수 있었다. 따라서, 이와 같이 침다발을 사용하여 아그로박테리움을 접종하면 효율적이면서 확실하게 원하는 세포 부위까지 상처를 입힐 수 있기 때문에 대두의 형질전환 효율을증가시킬 수 있었고 재분화 단계를 거쳐 안정하게 형질전환된 대두 식물체를 대량 얻을 수 있다.

3-2) 단침과 침다발을 사용한 후 재분화 효율 비교

침다발 접종의 효과를 확인하기 위하여 한 개의 침을 사용하여 여러번 상처를 내는 경우와 침다발을 사용하여 상처를 낸 경우의 재분화 효율을 비교하였다. 침으로 상처를 내지 않은 경우 재분화 효율이 188% 이었고, 침다발을 사용하여 상처를 낸 반쪽 씨앗의 경우 재분화 효율이 191% 이어서 이 두 경우 떡잎 마디에서 이루어지는 신초의 재분화 빈도는 차이가 없어, 침다발을 사용하여 상처를 낼 경우 떡잎 마디에서 이루어지는 신초의 분화 발달에는 영향을 미치치 않음을 알 수 있었다. 그러나, 단침을 사용하여 20회 정도 반복하여 상처를 내었을 경우 신초의 재분화 효율이 38%로써 현저히 감소하여 반복되는 상처로 떡잎 마디가 심하게 손상되어 재분화가 쉽게 일어나지 않음을 알 수 있었다. 이 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 단침을 여러번 사용하는 상처 방법보다 30개의 침을 묶은 침다발로 일회 상처를 내는 것이 보다 효과적임을 알 수 있었다.

<실시예 4> 목적 조직의 발달 정도에 따른 대두의 형질전환 효율 비교

형질전환을 위해서는 대상 식물 조직의 배양을 통한 재분화가 필수적이기 때문에 목적 조직의 발달 정도에 따른 형질전환 효율을 비교하였다. 발달 정도가 서로 다른 반쪽 씨앗의 떡잎 마디를 사용하여 형질전환을 실시한 결과, 비록 크기는 작았지만 하루 발아시킨 반쪽 씨앗의 떡잎 마디를 목적 조직으로 이용한 경우가 형질전환 효율이 가장 높았다. 반면 2일, 4일 및 14일 발아시킨 유식물체의 떡잎 마디를 목적 조직으로 사용했을 경우 형질전환 효율이 현저히 감소한 것을 하기 표 4로부터 알 수 있다.

따라서, 발아가 진행되면서 유식물체의 떡잎 마디가 빠른 속도로 성숙되어 아그로박테리움 접종 및 형질전환이 용이하지 않음을 알 수 있다. 실제로 1일 혹은 2일 발아시킨 반쪽 씨앗에 붙은 떡잎 마디는 침다발로 접종이 가능하였으나 3일 이상 발달한 떡잎 마디의 경우는 이미 조직이 굳어져 침으로 접종이 불가능하였으며, 칼날을 사용하여 상처를 내고 아그로박테리움을 접종하였다. 따라서, 발아 중인 유식물체의 떡잎 마디를 대상으로 형질전환을 실시할 경우에는 1일 미만의 어린 조직을 사용하는 것이 효과적임을 알 수 있었다.

<실시예 5> 대두 품종에 따른 형질 전화 효율 비교

재배종 준저리, 팔달 및 단엽의 형질전환 효율을 비교하였다. 각각의 품종을 아그로박테리움으로 형질전환시킨 후 유도된 신초의 수로 형질전환 효율을 계산하여 하기 표 5에 나타내었다.

이 경우 재배종 준저리의 형질전환 효율이 팔달 및 단엽에 비해 각각 15배, 7배 높게 나타났다. 따라서, 재배종 준저리를 사용하여 형질전환체를 얻는 것이 가장 효과적임을 알 수 있었다.

<실시예 6> 형질전환체 분석

선별 과정을 거쳐 얻어진 식물체들이 이식된 외부 유전자를 갖고 있음을 확인하기 위하여 형질전환된 식물체로부터 게놈 DNA를 분리하여 PCR과 서던 블럿을 수행하였다.서열번호 1및2로 각각 표시되는 NOS 프로모터와 NOS 터미네이터 부위에 특이한 프라이머들을 사용하여 외부 유전자를 PCR로 증폭시킨 후 아가로즈 겔상에서 전기영동하였다. 서열번호 3으로 표시되는bar유전자 특이 탐침을 사용하여 서던 블럿을 실시한 결과, 비형질전환체에서는 어떤 신호도 나타나지 않았으나 형질전환체에서는 1.2 kb 크기의 밴드를 볼 수 있어bar유전자가 식물에 이식되었음을 확인할 수 있었다 (도 6 참조). 또한 이식한 외부 유전자가 형질전환체의 게놈 DNA에 안정하게 이식되었는지 확인하기 위하여 약 5 ㎍의 게놈 DNA를 제한 효소SacII로 절단하고 0.8% 아가로즈젤상에서 전기영동하여 분리한 후 막 (nylon membranes)으로 전이하였다.bar유전자 특이 탐침을 사용하여 서던 블럿을 수행한 결과, 재조합bar유전자 내부에서 유래한 0.6kb 절편과 양쪽 끝이 있던 토막이 형질전환체 게놈 DNA에 삽입되어 생긴 7kb 및 23kb 절편을 확인할 수 있었다 (도 7 참조). 따라서, 1개의 재조합 목적 유전자가 형질전환 대두 식물체 게놈에 이식된 것을 알 수 있었다. 또한, 선별된 시료에서 전체 RNA를 분리한 후, 노던 블럿을 수행하여 이식된 외부 유전자가 형질전환체에서 안정적으로 발현이 됨을 확인하였다.bar유전자 특이 탐침을 사용하여 노던 블럿을 실시한 결과, 비형질전환체에서는 어떤 신호도 나타나지 않았으나 형질전환체에서는bar유전자가 모두 안정적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 8 참조).

<실시예 7> 형질전환체의 순화 및 제초제 저항성 검정

배지에서 선별된 유식물체들을 토양이 들어있는 용기에 옮기고 용기의 뚜껑 부위까지 키운 후 뚜껑을 열어 순화시켰다. 순화된 유식물체를 토양으로 옮겨 형질전환 대두 식물체를 얻었다 (도 9 참조). 또한, 상기 형질전환된 대두의 제초제저항성을 검정하기 위하여 100 ppm 농도의 PPT를 식물 잎에 발라주었고, 일주일 후 검정한 결과, 비형질전환 대두의 경우 잎이 백색으로 변하면서 죽어가는 반면 형질전환체의 경우 건강하게 성장하는 것을 확인할 수 있었다 (도 10 참조).

<실시예 8> 형질전환 후대에서의 이식 유전자 검정

대두 형질전환체에서 얻어진 종자를 토양에서 발아시켜 후대 (T1) 식물체를 얻었고 (도 11 참조), 형질전환체의 후대 식물체들이 이식된 외부 유전자를 갖고 있는지 확인하기 위하여 게놈 DNA를 분리하여 PCR 증폭 및 서던 블럿을 수행하였다. NOS 프로모터와 NOS 터미네이터 특이 프라이머를 사용하여 외부 유전자를 PCR로 증폭한 후bar유전자 특이 탐침을 사용하여 서던 블럿을 수행한 결과, 비형질전환체에서는 어떤 신호도 나타나지 않았으나 형질전환체 2에서 신호가 강하게 나타났다. 또한gfp유전자에 대해서도 서던 블럿을 수행한 결과, 형질전환체 모두에서 신호가 강하게 나타남을 확인할 수 있었다 (도 12 참조). 왕성하게 생장하는 대두 형질전환체의 후대 (T1) 잎을 공초점 형광 현미경으로 관찰한 결과, 역시 형질전환체의 잎과 뿌리 모두에서gfp유전자가 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 13 참조). 따라서, 형질전환체의 후대 식물체에서도 역시 유전자가 발현됨을 확인할 수 있었다.

상기에서 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명자들은 아그로박테리움을 사용하여 재조합 유전자를 도입하여 식물체, 특히 대두를 형질전환시키는 유용한 방법을 제공하였다. 즉, 하루 발아된 반쪽 씨앗을 목적 조직으로 사용하여 적절한 상처 처리를 통하여 제초제에 저항성을 보이는 유전자를 도입하였고, 이후 생산된 형질전환 대두 식물체를 과량의 제초제가 포함된 배지에서 선별할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 형질전환 방법을 사용하여 상업적으로 가치가 있는 형질전환 대두 신품종을 효과적으로 개발할 수 있고, 이를 통해 대두의 생산성을 현저히 향상시킬 수 있다.

Claims (9)

1. 목적 조직으로 하루 발아시킨 반쪽 씨앗을 선택하고, 침 다발로 상기 목적 조직을 찔러 상처를 입히고, 재조합 목적 유전자를 포함한 아그로박테리움을 사용하여 상기 목적 조직에 목적 유전자를 도입시킨 다음 재분화시키는 것을 포함하는 식물의 형질전환 방법.
2. 제 1항에 있어서, 형질전환용 식물이 식량작물류, 채소작물류, 특용작물류, 과수류, 화훼류 및 사료작물류를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 식량작물류는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수; 채소작물류는 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근; 특용작물류는 인삼, 담배, 목화, 참깨,사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채; 과수류는 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나; 화훼류는 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립; 사료작물류는 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 형질전환용 식물이 대두인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 목적 조직이 16-24시간 발아시킨 반쪽 씨앗인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 침 다발은 2개 이상의 침을 묶은 것임을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항에 있어서, 목적 유전자로 제초제 저항성을 보이는bar유전자를 사용한 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항에 있어서, 목적 조직의 상처 깊이가 1-2mm인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항 또는 제 5항에 있어서, 목적 조직은 반쪽 씨앗의 떡잎 마디인 것을 특징으로 하는 방법.