KR100447919B1

KR100447919B1 - 수박 형질전환체의 제조방법 및 형질전환 수박

Info

Publication number: KR100447919B1
Application number: KR10-2002-0001147A
Authority: KR
Inventors: 이선교; 유제근
Original assignee: (주)넥스젠
Priority date: 2002-01-09
Filing date: 2002-01-09
Publication date: 2004-09-08
Also published as: AU2002367434A1; KR20030060442A; WO2003057891A1

Abstract

본 발명은 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용한 수박 형질전환체의 제조방법 및 이로부터 제조되는 수박 형질전환체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (ⅰ) 수박 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 자엽 또는 배축으로부터 유래된 수박 조직을 감염시키는 단계: (a) 수박 세포 내에서 작동하여 RNA를 형성할 수 있는 프로모터; (b) 상기 프로모터 서열에 기능적으로 결합되어 있는 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (c) 수박 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열; 그리고, (ⅱ) 상기 감염된 수박 조직을 6.0-1.0 ㎎/ℓ의 시토키닌 및 0.2-0 ㎎/ℓ의 옥신계 성장 조절제를 포함하는 배지에서 재분화시키는 단계를 포함하는 수박 형질전환체의 제조방법 및 이로부터 제조되는 수박 형질전환체에 관한 것이다.

Description

수박 형질전환체의 제조방법 및 형질전환 수박{Method for Preparing Transformed Citrullus Plants}

본 발명은 수박 형질전환체의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 수박 형질전환체의 제조방법 및 이로부터 제조되는 수박 형질전환체에 관한 것이다.

박과에 속하는 과채류인 수박 (Citrullus vulgarisL.)은 한국을 비롯한 일본, 중국 등의 동남 아시아권과, 북아프리카 등에서 주로 재배되며, 중국이 전세계 재배면적의 60-70% 이상을 차지하고 있어 주요 종자 수출 대상국으로 부각되고 있다.

수박은 주로 초여름에서 초가을까지만 소비되어 왔으나, 최근에는 시설 재배기술의 발전으로 80년대 후반부터 시작되어 계속 시설 재배면적이 증가하는 추세를 보이고 있으며, 이로 인하여 수박의 연중 생산이 가능하게 되었고, 계절에 관계없이 소비되고 있다. 이들의 총 재배면적은 1999년 현재 약 40,000 ha로 국내 채소 재배면적의 11.9%에 이르며, 향후에도 식생활수준 향상 등으로 지속적인 증가가 예측되고 있다. 한편, 생산량은 1999년 현재 노지재배 수박이 26만톤, 시설재배 수박이 67만톤이 생산되어 수박의 총생산량은 93만톤에 이르고 있다.

최근 들어 수박은 재배 및 소비량이 급격히 늘어 년간 총생산액 기준으로 채소작물 중 3위 자리를 유지하고 있다. 또한 WTO 체제 출범과 농산물 수입 자율화에 따라 국내에서 생산되는 과수의 경우 일부를 제외하고는 국제경쟁력이 없는 것으로 판단되고 있지만, 수박은 농산물 수입 자율화 이후에도 국제 경쟁력을 유지할 수 있는 소득작물로 평가되고 있는 등 주요한 위치를 확보하고 있다.

이와 같이 중요한 과수인 수박의 품종개발은 관행 육종방법에 의하여 개발 보급되고 있는 실정이다. 그러나 기존의 관행육종에 의한 품종육성을 하는 데에는 다음과 같은 문제점들이 있다. 첫째, 시설 재배에 적합한 저온기 화분신장 강화, 웅성불임에 의한 채종체계 구축, 당도향상, 씨없는 품종개발, 저장 및 수송력 강화, 생산종자의 품질관리 등 기술적인 제약에 의한 문제들이 있다. 둘째, 관행육종을 위하여 많은 재배면적과 비용이 소요되며, 또한 고전적인 육종은 장시간에 걸쳐 이루어지는 문제점을 가지고 있어 즉각적인 시장변화에 대처하기 위한 신속성이 부족하여 다양한 소비자요구를 충족시키지 못하고 있다. 셋째, 육종을 위해서는 면적, 인력, 시간이 많이 요구되어 유용형질의 효과적 선발 및 고정이 어렵다. 따라서, 소비자의 다양한 기호변화에 효과적으로 대처하는 상품의 개발이 어렵다. 이에 따라 신속한 신품종 수박개발을 위해 유전공학적인 방법의 접목이 요구되고 있다.

유전자조작을 통한 작물개량을 위해서는 효율적인 형질전환 기술의 개발이 가장 기본적인 과정이다. 형질전환을 통한 농업적 또는 유용 유전자의 종간 이동은 기존 육종기술로는 극복할 수 없는 어려운 기술적인 문제들을 해결해 줄 수 있다. 또한 급속도로 발전하는 유전공학분야의 과학기술과 농업적으로 사용 가능한 유용 유전자의 수가 증가하는 추세를 감안할 때 효율적인 유전자 형질전환기술의 개발은 고부가 신품종 육성을 위한 농업의 미래 지향적인 발전을 위해 필수적인 과정이다.

한편, 박과작물은 식물체 재분화나 형질전환이 어려운 작물이다. 특히 수박 형질전환은 지금까지 국내는 물론이고 외국에서도 보고가 거의 없고, 발표된 논문의 형질전환은 그 효율이 매우 낮고 재현성이 없는 것이다(Choi P.S. et al.,Plant Cell Rep., 13(6):344-348(1994); Kim Y.S.,Mol. Cells, 8(6):705-708(1998)). 더욱이, 농업적으로 유용한 유전자를 형질전환시켜 수박 품종을 개발시킨 예는 전무하다.

따라서 수박의 식물체 재분화 및 형질전환에 관한 연구는 아직까지는 많은 노력이 요구되고 있는 실정이다. 수박의 형질전환기술의 확보는 향후 급변하는 소비자의 요구를 가장 빠른 시간안에 수용 가능하고, 저비용으로 고품질 수박을 생산할 수 있는 가장 기반적인 기술이다. 그러나 수박의 경우, 한국, 일본, 중국 일부와 북아프리카 등에서 주로 재배되므로 유럽이나 미국에서는 형질전환 연구나 시도가 아직까지 보고된 바가 없고, 일본과 중국에서도 품종생산에 관한 보고가 이루어 진 바 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용은 괄호내에 표시된다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 요지가 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 상술한 업계의 오랜 요구를 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, 수박 종자의 발아 조건, 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)와의 공동배양 방법 및 재분화 배지의 조성 등을 새롭게 구축하고, 이에 따르는 경우에는 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 수박 형질전환체의 제조가 보다 단시간에 효율적으로 발생하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 수박 형질전환체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 수박 형질전환체의 제조방법에 의해 제조된 수박 형질전환체를 제공하는 데 있다.

도 1은 발아 시기별 수박 자엽의 재분화능을 나타내는 사진;

도 2는 본 발명에 이용된 바이너리 벡터 pRD400의 유전자 지도;

도 3은 본 발명의 수박 형질전환체의 기내정식된 양상 및 발근된 양상을 나타내는 사진; 및

도 4는 본 발명의 수박 형질전환체를 확인하는 PCR 결과를 나타내는 겔 사진.

본 발명은 (ⅰ) 수박 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)로 자엽 또는 배축으로부터 유래된 수박 조직을 감염시키는 단계: (a) 수박 세포 내에서 작동하여 RNA를 형성할 수 있는 프로모터; (b) 상기 프로모터 서열에 기능적으로 결합되어 있는 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (c) 수박 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열; 그리고, (ⅱ) 상기 감염된 수박 조직을 6.0-1.0 ㎎/ℓ의 시토키닌 및 0.2-0 ㎎/ℓ의 옥신계 성장 조절제를 포함하는 배지에서 재분화시키는 단계를 포함하는 수박 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태는 (ⅰ) 수박의 종자를 발아배지에서 2-6일 동안의 암배양 및 12-30 시간 동안의 광배양을 통하여 발아시키는 단계; (ⅱ) 상기 발아에 의해 형성된 자엽의 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 수박 조직을 감염시키는 단계: (a) 수박 세포 내에서 작동하여 RNA를 형성할 수 있는 프로모터; (b) 상기 프로모터 서열에 기능적으로 결합되어 있는 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (c) 수박 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열; 그리고, (ⅲ) 상기 감염된 수박 조직을 6.0-1.0 ㎎/ℓ의 시토키닌 및 0.1-0 ㎎/ℓ의 옥신계 성장 조절제를 포함하는 배지에서 재분화시키는 단계를 포함하는 수박 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

이와 같은 본 발명을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다:

Ⅰ.형질전환 재료의 준비

수박의 형질전환 재료로서 이용될 수 있는 것은 잎, 줄기 및 엽병 등이다. 이러한 재료는 식물의 다양한 부분에서 얻을 수 있으나, 가장 바람직하게는 종자로부터 얻는다. 종자는 사용하기 전에 미리 염소 (특히, 소듐 하이포클로라이드) 등과 같은 소독제를 이용하여 멸균하는 것이 바람직하다.

Ⅱ.종자의 발아

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 종자의 발아시 이용되는 배지는 MS, B5, LS, N6 및 화이트'스 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 비타민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 또한, 상기 비타민은 바람직하게는 니코틴산, 티아민 및 피리독신 등을 포함한다. 한편, 본 발명의 발아 배지는 pH 변화를 완충시키는 역할을 하는 MES(2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Monohydrate)를 추가적으로 포함할 수 있고, 고체 지지체로서 아가를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 발아 배지에는 식물 성장 조절제는 첨가하지 않는다.

종자 발아의 조건에 있어서는 특히 암배양 기간이 중요하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 암배양 기간은 2-6일이고, 광배양은 12-30 시간이며, 보다 바람직하게는 암배양은 3-5일이고, 광배양은 20-28 시간이며, 가장 바람직하게는 암배양은 4일이고, 광배양은 24시간이다. 상기한 암배양 기간에 따라 하기의 재분화능이 크게 영향을 받는다. 광배양시 처리되는 광은 대략 3000-5000 룩스이다. 한편, 발아 단계에서의 배양 온도는 25℃±1℃가 바람직하다.

Ⅲ.형질전환 조직의 준비

본 발명에서 이용될 수 있는 조직은 종자의 발아로부터 생성된 모든 조직이 이용될 수 있으나, 바람직하게는 자엽 및 배축을 이용할 수 있고, 가장 바람직하게는 자엽을 이용하는 것이다. 자엽을 발아된 종자로부터 얻은 경우에는 생장점이 완전히 배제되도록 채취하는 것이 바람직하다.

Ⅳ.아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 감염

수박 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 실시한다 (Depicker, A. et al., Plant cell transformation byAgrobacteriumplasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York (1983)). 보다 바람직하게는 바이너리 (binary) 벡터 시스템을 이용하는 것이다 (An, G. et al., Binary vectors" In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York(1986)). 상기한 바이너리 벡터는 예컨대, pBin19, pRD400 등이 있다.

본 발명에 이용되는 바이너리 벡터는 기본적으로 (a) 수박 세포 내에서 작동하여 RNA를 형성할 수 있는 프로모터; (b) 상기 프로모터 서열에 기능적으로 결합되어 있는 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (c) 수박 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열을 포함한다. 또한, 바람직하게는 상기 벡터에는 선택 표지로서 항생제 (예: 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자를 포함한다. 한편, 상기 벡터는 추가적으로 리포터 물질(예: 루시퍼라아제, β-글루쿠로니다아제 등)을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 바이너리 벡터내에 이용될 수 있는 프로모터는 예컨대, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 1' 프로모터, 2' 프로모터 또는 노팔린 합성효소 (nos) 프로모터를 포함한다. 한편, 상기 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열은 얻고자 하는 바람직한 형질에 따라 결정된다. 예컨대, 제초제 (글라이포세이트, 설포닐우레아 등) 저항성 유전자, 바이러스 저항성 유전자, 해충 저항성 유전자 (예: Bt 유전자), 악조건 (가뭄, 기온, 염도) 저항성 유전자, 품질향상을 위한 유전자 (예; 당도 증가, 과숙 지연등), 의료용 단백질 생산 관련 유전자(EGF, 각종 질병의 항원 또는 항체, 인슐린 등), 기능성 화장품 생산 관련 유전자 (알부민, 항균성 펩타이드 등) 등이 있다.

상기한 벡터를 내재하고 있는 아그로박테리움에 의한 식물 세포의 감염은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있으나, 가장 바람직하게는 상술한 바와 같이 생장점이 배제되도록 채취한 자엽을 절단하고, 절단면을 갖는 자엽 단편을 아그로박테리움의 배양액에 침지시켜 공동배양함으로써 절단면을 통하여 아그로박테리움이 자엽에 감염되도록 하는 것이다. 이 방법은 감염을 위한 공동배양 시간을 획기적으로 단축시키기 위하여 개발된 것이다. 바람직하게는 자엽을 여러 단편으로 절단하지 않고 두 단편으로 절단하여도 공동배양 시간을 크게 단축시킬 수가 있다. 본 발명의 방법을 따르는 경우에는 공동배양 시간이 1시간-5분, 보다 바람직하게는 20분-7분으로 할 수 있다.

종래에는 메스로 여러 곳을 상처 입힌 자엽을 아그로박테리움의 배양액과 공동배양하여 수박 조직을 감염시켰으나(Choi P.S. et al.,Plant Cell Rep., 13(6):344-348(1994)), 이는 공동배양 시간이 48 시간 이상 소요되고, 여러 곳을 상처 입힌 자엽을 아그로박테리움의 배양액과 장시간 공동배양하는 동안 식물조직의 괴사가 발생하는 문제점이 있었다. 그러나, 본 발명을 따르는 경우에는 이러한 문제점이 완전히 해결된다.

공동배양액에는 바람직하게는 아세토시리곤이 포함되는데, 이는 아그로박테리움의 식물로의 형질전환을 돕기 위한 것이다.

Ⅴ.재분화

상기 아그로박테리움에 의해 형질전환된 식물 조직의 재분화는 엄격하게 조절된 성분과 성분양를 포함하는 재분화 배지에서 실시되어야 한다.

본 발명에 따르면, 재분화 배지는 MS, B5, LS, N6 및 화이트'스 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 비타민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 상기 비타민은 바람직하게는 니코틴산, 티아민 및 피리독신 등을 포함한다. 한편, 본 발명의 재분화 배지는 pH 완충 역할을 하는 MES를 추가적으로 포함할 수 있고, 고체 지지체로서 아가를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 재분화 배지에는 식물 성장 조절제가 포함된다. 식물 성자 조절제 중 함유되는 시토키닌은 6-벤질아미노퓨린, 키네틴, 제아틴, 이소펜틸아데노신 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 6-벤질아미노퓨린이 이용된다. 한편, 옥신계 성장 조절제 (예: 1- 나프탈렌아세트산, 인돌아세트산, (2,4-디클로로페녹시) 아세트산)는 본 발명의 재분화 배지에는 실질적으로 거의 포함되지 않는데, 이는 종래의 재분화 배지와 크게 구별되는 측면이다.

재분화 배지에 포함되는 시토키닌의 양은 바람직하게는 4.0-1.5 ㎎/ℓ이고, 가장 바람직하게는 2.0 ㎎/ℓ이다. 상기 옥신계 성장 조절제의 함량은 바람직하게는 0.02-0 ㎎/ℓ이고, 가장 바람직하게는 0 ㎎/ℓ이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 형질전환된 조직을 선별할 수 있도록항생제 (예: 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등)를 추가적으로 포함한다.

재분화 배지에서의 배양 온도는 25℃±1℃가 가장 바람직하고, 광배양:암배양의 비율은 16시간:8시간이 가장 바람직하다. 배양 기간은 가변적이나, 바람직하게는 약 3주-6주이다.

상기한 조건에 따라 재분화 배지에서 형질전환된 수박 조직을 배양하면 캘러스 상태를 거쳐 재분화되어 신초가 형성된다.

Ⅵ.발근

재분화된 조직은 본 발명의 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 수박을 얻는다. 본 발명의 발근 배지는 MS, B5, LS, N6 및 화이트'스 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 비타민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 상기 비타민은 바람직하게는 니코틴산, 티아민 및 피리독신 등을 포함한다. 한편, 본 발명의 재분화 배지는 pH 완충 역할을 하는 MES를 추가적으로 포함할 수 있고, 고체 지지체로서 아가를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 발근 배지에는 식물 성장 조절제로서 시토키닌은 거의 이용되지 않고, 옥신이 주로 이용된다. 상기 옥신계 성장 조절제로서는 1- 나프탈렌아세트산, 인돌아세트산, (2,4-디클로로페녹시) 아세트산 등이 이용될 수 있고, 가장 바람직하게는 인돌아세트산이다. 본 발명의 발근 배지에는 형질전환체를 선택하기 위한 항생제를 첨가하지 않는 것이 바람직하다.

Ⅶ.형질전환체의 확인

본 발명에 의해 제조된 수박 형질전환체는 당업계에 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 예컨대, 형질전환 수박의 조직으로부터 분리한 DNA 시료를 이용하여 PCR을 실시함으로써 형질전환에 의해 수박의 지놈에 삽입된 외래 유전자를 용이하게 확인할 수 있다. 또한, Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)에 개시된 서던 블롯팅 및 노던 블롯팅에 의해서도 형질전환체를 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 (ⅰ) MS, B5, LS, N6 및 화이트'스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 영양 기본 배지, 당을 포함하는 에너지원 그리고 비타민을 포함하는 발아배지에서 3-5일 동안의 암배양 및 20-28 시간 동안의 광배양을 통하여 발아시키는 단계; (ⅱ) 상기 발아에 의해 형성된 자엽의 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 수박 조직을 감염시키는 단계: (a) 수박 세포 내에서 작동하여 RNA를 형성할 수 있는 프로모터; (b) 상기 프로모터 서열에 기능적으로 결합되어 있는 외래 단백질을 인코딩하는 구조 유전자 서열; (c) 수박 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열; 및 (d) 선택 표지로서의 항생제 내성 유전자; (ⅲ) 상기 감염된 수박 조직을 6-벤질아미노퓨린, 키네틴, 제아틴 및이소펜틸아데노신 등으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 시토키닌 4.0-1.5 ㎎/ℓ; MS, B5, LS, N6 및 화이트'스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 영양 기본 배지; 에너지원인 당; 그리고 비타민을 포함하는 재분화 배지에서 재분화시키는 단계; 그리고, (ⅳ) 상기 재분화 단계에서 형성된 신초를 1-나프탈렌아세트산, 인돌아세트산 및 (2,4-디클로로페녹시) 아세트산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 옥신계 성장 조절제; MS, B5, LS, N6 및 화이트'스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 영양 기본 배지; 에너지원인 당; 그리고 비타민을 포함하는 발근배지에서 발근시키는 단계를 포함하는 수박 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기한 본 발명의 방법에 의해 제조된 수박 형질전환체를 제공한다.

상술한 본 발명의 수박 형질전환체의 제조방법은 하기하는 실시예에서 확인할 수 있듯이, 형질전환 효율 및 재분화 효율이 매우 높을 뿐만 아니라, 작업 시간이 크게 단축되는 장점이 있으며 수박 형질전환체 제조의 재현성이 매우 우수하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 식물 조직의 준비

수박 4품종(아폴로수박, 사철꿀수박, 슈퍼금천수박 및 금보수박)을 재분화 및 형질전환 실험에 이용하였다. 각 품종의 종자들은 4℃에 보관하면서 물리적인 방법으로 종피를 제거한 후 4% NaOCl 용액에 5분 간격으로 교반하면서 60분간 침지, 소독한 후 증류수로 충분히 수세하였다. 이어, 1/2 MSMS(Murashige & Skoog medium including Minimal Salts), 1% 수크로스 및 0.6% 아가를 첨가한 발아배지를 이용하여 암배양 조건에서 4일 동안 25℃±1℃에서 발아시켰다. 그런 다음, 자엽 또는 배축을 채취하여 재분화 및 형질전환을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 2: 식물 조직의 재분화

자엽 및 배축의 재분화 조건을 확립하기 위해, 하기 표 1에 기재된 성분을 갖는 4종의 배지에 상기 실시예에서 수득한 자엽 및 배축을 치상하고, 4주간 25℃±1℃(16시간:8시간 광배양:암배양)에서 배양한 후 재분화율 및 평균 신초수를 조사하였다. 재분화율은 치상한 총 절편수에 대한 재분화된 절편수를 백분율로 환산하였고, 평균 신초수는 재분화한 절편수에 대하여 발생한 신초의 총수를 백분율로 환산하였으며, 그 결과는 다음 표 2와 같다. 재분화를 위한 기본배지 조성은 MSB5(Murashige & Skoog medium including Gamborg B5 vitamins), 500 ㎎/ℓ의 MES(2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Monohydrate), 3% 수크로스와 0.6% 아가를 사용하였다.

구 분	배지 1	배지 2	배지 3	배지 4
NAA^a(㎎/ℓ)	0	0	0.1	0.1
BAP^b(㎎/ℓ)	2	4	2	4
염	MS^c	MS	MS	MS
비타민	B5^d	B5	B5	B5
^aNAA: 1-naphthaleneacetic acid^bBAP: 6-benzylaminopurine^cMS: Murashinge & Skoog 배지^dB5: 니코틴산, 티아민-HCl, 피리독신-HCl

품종 및 배지 조건에 따른 재분화율 및 평균 신초수
품종	식물조직	BAP/NAA (㎎/ℓ)
		2.0/0.0	4.0/0.0	2.0/0.1	4.0/0.1
		재분화율(%)	평균 신초수(개)	재분화율(%)	평균 신초수(개)	재분화율(%)	평균 신초수(개)	재분화율(%)	평균 신초수(개)
A^a	자엽	53.0	1.33	40.0	1.13	33.0	0.73	20.0	0.47
A^a	배축	0.0	0.00	0.0	0.00	0.0	0.00	6.0	0.22
B^b	자엽	50.0	1.10	20.0	0.30	25.0	0.50	30.0	0.35
B^b	배축	0.0	0.00	0.0	0.00	0.0	0.00	0.0	0.00
C^c	자엽	50.0	1.00	30.0	0.40	15.0	0.30	10.0	0.15
C^c	배축	0.0	0.00	0.0	0.50	0.0	0.20	0.0	0.50
D^d	자엽	30.0	0.55	10.0	0.10	5.0	0.05	0.0	0.00
D^d	배축	0.0	0.00	0.0	0.00	5.0	0.05	5.0	0.05
^a슈퍼금천수박;^b사철꿀수박;^c아폴로수박;^d금보수박

상기 표 2에 기재된 자엽의 경우를 먼저 살펴보면, 재분화율에 있어서는 품종간에 차이가 심하여 0-약 50%의 재분화율을 나타내었다. 또한, 옥신계 생장 조절제인 NAA가 첨가된 경우에는 재분화율이 크게 감소하는 경향을 나타내었으며, 아폴로수박 품종의 경우 NAA 무처리구에 비해 0.1 ㎎/ℓ를 처리한 구는 약 38-50%가 감소했으며, 이러한 양상은 슈퍼금천수박과 금보수박 품종에서도 유사한 양상을 나타내었다. 한편, 사철꿀수박 품종은 BAP 2.0 ㎎/ℓ와 NAA 0.1 ㎎/ℓ가 첨가된 경우에는, 다소 재분화율이 25%로 감소한 반면에 BAP 4.0 ㎎/ℓ와 NAA 0.1 ㎎/ℓ가 첨가된 경우에는 NAA가 첨가되지 않은 것보다 재분화율이 10% 더 증가하는 양상을 보였으나 유의성은 없었다.

평균 신초수를 비교하여 보면, 대체적으로 BAP/NAA가 2.0/0.0의 재분화 조건에서 우수한 결과를 나타내었고, NAA의 양이 증가되는 경우에는 신초수가 감소하였다.

배축의 경우는 자엽에 비해 재분화율이 매우 낮고, 신초가 거의 형성되지 않았으며, 처리구의 대부분이 재분화하지 않고 캘러스가 형성되다가 고사하거나 생장을 멈추는 양상을 나타내었다.

결과적으로, 수박의 재분화를 위해서는 자엽이 우수한 재료가 되고, 재분화 조건은 옥신계 생장 조절제를 첨가하지 않는 것이 바람직하며, BAP는 약 2.0 ㎎/ℓ으로 첨가하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있다.

실시예 3: 발아 시기별 자엽의 재분화능

상기 실시예 2에서 확인된 재분화능이 가장 우수한 자엽을 대상으로, 자엽의 채취 시기와 재분화능 사이의 관계를 다음과 같이 확인하였다: 우선, 슈퍼금천수박 품종의 종자를 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일하게 처리한 다음, 암배양상에서 1일, 2일, 3일, 4일 및 5일 동안 각각 25℃±1℃으로 배양한 다음, 4000 룩스의 광상태에서 1일간 25℃±1℃으로 배양하였다. 이어, 자엽을 채취한 다음, 상기 실시예 2에 기재된 배지 중 재분화율이 가장 우수한 것으로 나타난, BAP 2 ㎎/ℓ이 함유된 재분화 배지에 치상하고, 4주 배양한 후에 재분화율 및 신초수를 조사하였다.

실험 결과, 암배양 기간에 따라 자엽의 재분화능력은 큰 차이를 나타내었다. 특히 5일간 암배양한 자엽의 경우에는 재분화 능력이 절반 이하로 감소했으며, 1일 이하로 처리한 자엽의 경우에는 신초 발생이 거의 관찰되지 않았다. 신초 재분화를 위한 자엽 채취시기는 2-4일간 암배양한 경우가 양호했으나, 그 중에서도 4일 동안 암배양한 자엽이 충분히 성숙되어 생장점 배제가 용이했으며, 자엽의 상태도 보다 양호하였다 (참조: 도 1). 도 1에서 A는 암배양 1일, B는 2일, C는 4일 그리고 D는 5일의 수박 자엽의 재분화양상을 나타내는 것이다. 도 1에서도 볼 수 있듯이, 1-2일 배양한 처리구에서는 절편간의 편차가 있고, 다신초를 형성하는 특성을 나타냈고, 4일 배양한 경우에는 2-3개의 신초를 형성했으며, 절단부위를 중심으로 캘러스가 형성되면서 캘러스에서 유래하는 신초가 형성되었다. 또한, 5일 동안 암배양한 경우에는 재분화 능력이 절반 이하로 감소하였다.

따라서, 발아 기간은 암배양 4일이 가장 적합함을 알 수 있다.

실시예 4: 식물 조직의 형질전환

수박 자엽의 형질전환을 위해, 우선 슈퍼금천수박 품종의 종자를 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 처리하고, 암상태에서 4일 동안 이어 1일 동안 광배양한 다음, 생장점이 완전히 배제되도록 자엽을 채취하였다.

한편, 바이너리 벡터 pRD400(참조: 도 2)에 의해 형질전환된 아그로박테리움튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciensGV3101(Mp90);Plant-cell-rep., 15(11):799-803(1996))를 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone)이 함유된 슈퍼 브로스(Super broth: 37 g/ℓ Brain heart infusion broth(Difco), 0.2% 수크로스, pH5.6)에서 18시간 배양한 다음, 배양액을 2,4-D 1 ㎎/ℓ가 함유되어 있고 하기 표 3의 성분을 갖는 감염 브로스(Infection broth) 및 DMSO 용액으로 1:37:2의 비율로 희석하였다. 도 2에서 LB 및 RB는 각각 T-DNA의 좌측 및 우측 보더 (border), MCS는 다중 클로닝 위치, Tnos 및 Pnos는 각각 nos 유전자의 종결 서열 및 프로모터 서열, nptII는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 Ⅱ 서열을 나타낸다.

이어, 채취한 말단에 절단면을 지닌 자엽을 상기 혼합 용액에 침지시켜 10분간 공동 배양함으로써 상기 아그로박테리움 튜머페이션스에 의해 절단면을 통하여 식물체가 감염되도록 하였다. 이 방법의 사용으로 인하여 수박형질전환 실험 시간의 단축과 아울러 여러 곳을 상처 입힌 자엽을 장시간 배양액 내에서 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양액과 공동 배양하는 동안 발생하는 식물조직의 괴사를 방지할 수 있었다.

상기의 방법으로 10분간 공동배양한 다음, 멸균 여과지로 수분을 제거한 자엽을 BAP 2 ㎎/ℓ가 함유된 공동 배양배지(4.04 g/L MSB5, 3.0% Sucrose, 0.5 g/L MES, 0.6% agar, pH 5.6)에 치상하고, 4000 룩스로 16시간의 광배양 조건에서 2일간 25℃±1℃로 배양하였다. 배양한 자엽은 카베니실린 500 ㎎/ℓ만이 함유되어 있는 재분화 배지(표 3)에 치상 후 7일간 25℃±1℃에서 전배양하여 신초의 발생을 일차적으로 유도하였다. 그리고 유도된 신초는 카나마이신 200 ㎎/ℓ를 함유한표 3의 성분을 갖는 선택배지에서 4주간 배양한 후 카나마이신에 의하여 선발된 재분화 신초를 유기하였다.

유기된 재분화 신초는 카베니실린과 카나마이신이 함유되어 있는 하기 표 3의 성분을 갖는 발근배지에 계대배양하여 약 2-3주 후에 형질전환된 것으로 추정되는 발근된 신초를 선별하였다.

형질전환에 사용된 배지 조성표
성분	발아배지	감염 브로스	재분화 배지	선택배지	발근배지
염	MS	MS	MS	MS	MS
비타민	B5	B5	B5	B5	B5
수크로스(g/ℓ)	10	20	20	30	30
MES(㎎/ℓ)	500	500	500	500	500
피타겔(g/ℓ)	6 g(아가)	-	4.0	4.0	2.0
2,4-D(㎎/ℓ)	-	1	-	-	-
BAP(㎎/ℓ)	-	-	2	2	-
IAA(㎎/ℓ)	-	-	-	-	0.1
기타	-	아세토시린곤(200 μM)	카베니실린(500 ㎎/ℓ)	카베니실린(500 ㎎/ℓ)카나마이신(200 ㎎/ℓ)	-

아그로박테리움 튜머페이션스와 공동배양한 슈퍼금천수박 품종의 자엽은 치상 후 약 10일이 경과하면서 다수의 캘러스가 형성되기 시작했으며, 약 2-3주 경과 후에 다수의 신초를 형성하였다. 그러나 형성된 신초가 모두 형질전환된 것은 아니었으며, 재분화된 신초를 선택배지나 발근배지로 계대 배양하면 형질전환되지 않은 신초는 대부분이 백화하거나 고사하였다. 한편, 형질전환된 신초는 약 2-3주 경과하면서 뿌리를 형성했으며, 이 후 몇번의 서브-배양에서도 계속적인 발근을 관찰할 수 있었다 (참조: 도 3). 도 3에서 A는 기내정식 (항생제가 함유되어 있는 배지에서도 형질전환체가 정상적으로 뿌리를 활착하여 증식하고 있음을 의미함)된수박 형질전환체의 사진이고, B는 항생제가 포함된 선택배지에서 발근된 양상을 나타내는 사진이다.

실시예 5: 형질전환체의 확인

발근배지에서 발근된 형질전환 추정체를 선발하여 PCR 분석으로 형질전환체를 다음과 같이 확인하였다: 우선, 상기 실시예 4에서 선별된 형질전환체로부터 PCR 분석을 할 DNA를 다음과 같이 수득하였다. PCR 분석을 위한 식물체 지놈 DNA의 분리는 Edwards 방법 (Nucleic Acids Research, 19:1349(1991))에 의하여 추출하였다.

PCR 분석에서 사용된 프라이머는 아그로박테리움 튜머페이션스에 있는 벡터의nptⅡ 유전자 (네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 Ⅱ를 인코딩)에 대한 것으로서, 전방향 프라이머는 5'-GAT GGA GTG CAC GCA GGT-3'이고, 역방향 프라이머는 5'-TCA GAA GAA CTC GTC AAG-3'이다. PCR 반응은 총반응액 25 ㎕당 10x 반응 완충액(베링거만하임사, 2.5 mM Mg²⁺함유, pH7.5) 2.5 ㎕, dNTP's 혼합물(10 mM) 2.0 ㎕, 주형 DNA 1 ㎕ 및 Taq 중합효소(5 U/㎕) 0.25 ㎕를 혼합하여 사용하였다. 반응은 94℃에서 1분간 전변성한 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1분간의 중합반응을 35회 반복하였고, 추가로 72'C에서 10분간 연장반응을 하였고, 반응 산물은 1.0% 아가로스 겔에서 분석하였다 (참조: 도 4). 도 4에서 M 레인은 1 kb 레더, 1 레인-5 레인은 본 발명의 수박 형질전환체의 DNA 그리고6 레인은 야생형 수박의 DNA 시료에 대한 것이다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 실시예 4에서 선별된 형질전환체의 지놈 DNA를 이용한 PCR에서 약 0.8 kb의nptⅡ 유전자가 증폭되었음을 알 수 있다. 따라서, 실시예 4에서 선별된 형질전환체는 본 발명의 형질전환법에 의해 형질전환되어, 그 지놈 DNA 상에 외래 유전자를 갖게 되었음을 확인할 수 있다.

본 발명은 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 수박 형질전환체의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 수박 형질전환체의 제조방법에 의해 제조된 수박 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 수박 형질전환체의 제조방법은 형질전환 효율 및 재분화 효율이 매우 높을 뿐만 아니라, 작업 시간이 크게 단축되는 장점이 있다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 수박 형질전환체의 제조방법:

(ⅰ) 수박 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)로 자엽 또는 배축으로부터 유래된 수박 조직을 감염시키는 단계: (a) 수박 세포 내에서 작동하는 프로모터; (b) 상기 프로모터에 연결되어 발현이 조절되는 외래 단백질의 구조 유전자 서열; 및 (c) 수박 세포 내에서 작동하는 폴리아데닐 시그널 서열; 그리고,

(ⅱ) 상기 감염된 수박 조직을 1.0-6.0 ㎎/ℓ의 시토키닌 및 0-0.2 ㎎/ℓ의 옥신계 성장 조절제를 포함하는 배지에서 재분화시키는 단계.
다음의 단계를 포함하는 수박 형질전환체의 제조방법:

(ⅰ) 수박의 종자를 발아배지에서 2-6일 동안의 암배양 및 12-30 시간 동안의 광배양을 통하여 발아시키는 단계;

(ⅱ) 상기 발아에 의해 형성된 자엽의 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 수박 조직을 감염시키는 단계: (a) 수박 세포 내에서 작동하는 프로모터; (b) 상기 프로모터에 연결되어 발현이 조절되는 외래 단백질의 구조 유전자 서열; 및 (c) 수박 세포 내에서 작동하는 폴리아데닐 시그널 서열; 그리고,

(ⅲ) 상기 감염된 수박 조직을 1.0-6.0 ㎎/ℓ의 시토키닌 및 0-0.1 ㎎/ℓ의 옥신계 성장 조절제를 포함하는 배지에서 재분화시키는 단계.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 시토키닌은 6-벤질아미노퓨린, 키네틴, 제아틴 및 이소펜틸아데노신으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 수박 형질전환체의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 옥신계 성장 조절제는 1- 나프탈렌아세트산, 인돌아세트산 및 (2,4-디클로로페녹시) 아세트산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 수박 형질전환체의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 시토키닌의 함량은 1.5-4.0 ㎎/ℓ이고, 상기 옥신계 성장 조절제의 함량은 0-0.02 ㎎/ℓ인 것을 특징으로 하는 수박 형질전환체의 제조방법.
제 5 항에 있어서, 상기 시토키닌의 함량은 2.0 ㎎/ℓ이고, 상기 옥신계 성장 조절제의 함량은 0 ㎎/ℓ인 것을 특징으로 하는 수박 형질전환체의 제조방법.
제 2 항에 있어서, 상기 발아시키는 단계는 3-4일 동안 암배양하고, 16-24 시간 광배양하여 실시하는 것을 특징으로 하는 수박 형질전환체의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 식물 세포는 자엽으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 수박 형질전환체의 제조방법.
제 8 항에 있어서, 상기 아그로박테리움 튜머페이션스로 수박 조직을 감염시키는 단계는 채취한 자엽의 절편을 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양액에 침지시켜 5분-1시간 동안 공동배양하여 실시됨을 특징으로 하는 수박 형질전환체의 제조방법.
제 9 항에 있어서, 상기 아그로박테리움 튜머페이션스로 수박 조직을 감염시키는 단계는 자엽의 절편을 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양액에 침지시켜 7분-20분 동안 공동배양하여 실시됨을 특징으로 하는 수박 형질전환체의 제조방법.
제 10 항에 있어서, 상기 아그로박테리움 튜머페이션스로 수박 조직을 감염시키는 단계는 자엽을 두 개의 절편으로 절단한 다음, 상기 절편들을 아그로박테리움 튜머페이션스의 배양액에 침지시켜 7분-20분 동안 공동배양하여 실시됨을 특징으로 하는 수박 형질전환체의 제조방법.
다음의 단계를 포함하는 수박 형질전환체의 제조방법:

(ⅰ) MS, B5, LS, N6 및 화이트'스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 영양 기본 배지, 당을 포함하는 에너지원 그리고 비타민을 포함하는 발아배지에서 3-5일 동안의 암배양 및 20-28 시간 동안의 광배양을 통하여 발아시키는 단계;

(ⅱ) 상기 발아에 의해 형성된 자엽의 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 수박 조직을 감염시키는 단계: (a) 수박 세포 내에서 작동하는 프로모터; (b) 상기 프로모터에 연결되어 발현이 조절되는 외래 단백질의 구조 유전자 서열; 및 (c) 수박 세포 내에서 작동하는 폴리아데닐 시그널 서열; 및 (d) 항생제 내성 유전자;

(ⅲ) 상기 감염된 수박 조직을 6-벤질아미노퓨린, 키네틴, 제아틴 및 이소펜틸아데노신으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 시토키닌 1.5-4.0 ㎎/ℓ; MS, B5, LS, N6 및 화이트'스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 영양 기본 배지; 에너지원인 당; 그리고 비타민을 포함하는 재분화 배지에서 재분화시키는 단계; 그리고,

(ⅳ) 상기 재분화 단계에서 형성된 신초를 1- 나프탈렌아세트산, 인돌아세트산 및 (2,4-디클로로페녹시) 아세트산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 옥신계 성장 조절제; MS, B5, LS, N6 및 화이트'스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 영양 기본 배지; 에너지원인 당; 그리고 비타민을 포함하는 발근배지에서 발근시키는 단계.
상기 제 1 항, 제 2 항 또는 제 12 항의 방법에 의해 제조된 수박 형질전환체.