KR100711144B1

KR100711144B1 - 수세미 형질전환체의 제조방법 및 형질전환 수세미

Info

Publication number: KR100711144B1
Application number: KR20040064713A
Authority: KR
Inventors: 이선교; 유제근
Original assignee: (주)넥스젠
Priority date: 2004-08-17
Filing date: 2004-08-17
Publication date: 2007-04-24
Also published as: WO2006019205A1; KR20060016313A

Abstract

본 발명은 아그로박테이움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 수세미 형질전환체의 제조방법 및 이로부터 제조되는 수세미 형질전환체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (i) 수세미 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 수세미의 절단되지 않은 자엽 전체를 감염시키는 단계: (a) 수세미 세포 내에서 작동하는 복제 원점; (b) 수세미 세포 내에서 전사를 촉진할 수 있는 포로모터; (c) 상기 프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (d) 수세미 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열; (ⅱ) 상기 감염된 수세미 자엽을 BAP (6-Benzylaminopurine)가 함유된 배지에 삽입 방법으로 치상하여 재분화시켜 신초를 형성시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 재분화된 신초를 NAA (α-Naphtalene acetic acid) 가 함유된 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 수세미를 형성시키는 단계를 포함하는 수세미 형질전환체이 제조방법 및 이로부터 제조되는 수세미 형질전환체에 관한 것이다.

수세미, 형질전환체, 아그로박테리움

Description

수세미 형질전환체의 제조방법 및 형질전환 수세미 {Method for Preparing Transformed Lufa cylindrica Roem}

도 1은 본 발명에 따른 수세미 자엽의 재분화를 나타내는 사진;

도 2는 본 발명에 이용된 바이너리 벡터 pRD320의 유전자 지도;

도 3은 본 발명에 따른 형질전환체 (패널 A) 및 비형질 전환체 (패널 B)를 비교한 사진;

도 4a는 본 발명에 따라 제조된 형질전환체를 확인하기 위한 GUS 분석 결과를 나타낸 사진; 및

도 4b는 본 발명의 수세미 형질전환체를 확인하는 PCR 결과를 나타내는 전기영동 사진

본 발명은 수세미의 형질전환체의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아그로박테리움 튜머페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 수세미 형 질전환체의 제조방법 및 이로부터 제조되는 수세미 형질전환체에 관한 것이다.

수세미 (Lufa cylindrica Roem.)는 박과 (Cucurbitaceae)에 속하는 작물로 열대 아시아가 원산지이며 현재는 국내 각지에서 재배하고 있다.

수세미의 잎은 호생하며 엽병이 있고 장상으로 갈라지며, 길이와 너비가 각각 13-30 ㎝로서 열편 끝이 뾰족하며 털이 없고 가장자리에 톱니가 있다. 꽃은 황색으로 8-9 월에 피며 자웅동주로 수꽃 화서는 총상이며 암꽃은 1 개씩 달린다. 과실은 박과로서 녹색인데 큰 원통형으로 바깥 면은 세로로 주름이 있고 안쪽에는 과육 속에 망상조직이 발달한다.

수세미는 일년초로 길이가 12 ㎝ 정도 자라며, 줄기는 녹색으로 오각형이고, 덩굴 줄기를 내어 다른 물체를 감으면서 자란다.

어린 과실은 식용으로도 사용하며 성숙한 섬유는 주로 철도차량의 차축급유(車軸給油)의 버트, 선박기관 및 갑판의 세척용, 신바닥의 깔개, 여성용 모자의 속, 슬리퍼 또는 바구니 등을 만드는 데 쓰인다. 한방에서는 열병신열·유즙불통·장염·정창 등의 치료에 이용한다. 살아 있는 덩굴에서 추출되는 수액은 화장품용 및 약용에도 쓰인다. 종자는 40 % 내외의 기름을 함유하므로 기름을 짜고 깻묵은 비료 또는 사료로 쓰인다.

식물유전공학을 이용한 작물의 유전자조작은 괄목한 발전을 이루어 현재는 거의 대부분의 농작물을 시험관내에서 조직배양할 수 있을 뿐만 아니라 외래유전자의 형질전환도 가능하다. 이러한 작물들을 이용하여 용이하게 유용 단백질을 생 산할 수 있으나 이들 농작물들은 모두 특허 등록이 되어있어 상업적으로 이용하는 경우에는 매우 곤란한 문제가 야기된다.

박과 작물 중 수박, 메론 및 오이에 대한 형질전환은 이미 보고 되어 있지만 (Choi et al., Genetic transformation and plant regeneration of watermelon using Agrobacterium tumefaciens, Plant Cell Reports 13:344-348, 1994; Dong et al., Transformation of melon (Cucumis Melo L.) and expression from the cauliflower mosaic verus 35S promoter in transgenic melon plants, Biotechnology 9:858-863, 1991; Lee et al., Agrobacterium tumefaciens의 Binary Vector System을 이용하여 형질 전환된 담배와 오이에서의 담배 모자이크 바이러스 외피 단백질 유전자의 발현, 식물조직배양학회지 23(4):205-210, 1996), 수세미에 대한 형질전환 보고는 아직 없다.

이에 본 발명자들은 상업적으로 이용할 수 있는 농작물로 수세미에 대한 연구를 수행하여 수세미의 조직배양 조건을 확립하여 식물체 재분화 및 형질전환을 통해 형질전환체를 제조하였다.

본 발명은 유용단백질 생산의 호스트로 사용될 수 있는 수세미의 발아 조건, 아그로박테리움 튜머페이션스와의 공동배양 방법 및 옥신 성장제를 사용하지 않는 재분화 배지의 조성 등을 새롭게 구축하고, 이에 따르는 경우에는 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 수세미 형질전환체의 제조가 보다 단시간에 효율적으로 발생하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 수세미 형질전환체의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 수세미 형질전환체의 제조방법에 의해 제조된 수세미 형질전환체를 제공하는데 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 수세미 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 수세미의 자엽을 감염시키는 단계: (a) 수세미 세포 내에서 작동하는 복제 원점; (b) 수세미 세포 내에서 전사를 촉진할 수 있는 프로모터; (c) 수세미 세포 내에서 작동하여 RNA의 3'말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열; (ⅱ) 상기 감염된 수세미 자엽을 성장 조절제로서 BAP (6-Benzylaminopurine) 가 함유된 재분화 배지에서 재분화시켜 신초를 형성하는 단계; 및 (ⅲ) 상기 재분화된 신초를 NAA (α-Naphtalene Acetic Acid) 가 함유된 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 수세미를 형성시키는 단계를 포함하는 수세미 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

본 발명자들은 수세미에 대한 효율적인 형질전환법을 개발하기 위하여 자엽절편에서 부정아를 유도하고 높은 빈도로 재분화 개체를 얻을 수 있는 재분화 조건 및 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용한 효율적인 수세미의 형질전환 조건을 얻었다.

이와 같은 본 발명을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

I. 형질전환 재료의 준비

수세미의 형질전환 재료로서 이용될 수 있는 것은 잎, 줄기 및 엽병 등이다. 이러한 재료는 식물의 다양한 부분에서 얻을 수 있으나, 가장 바람직한 재료는 종자를 이용하는 것이다. 종자는 사용하기 전에 미리 염소 (특히, 소듐 하이포클로라이드) 등과 같은 소독제를 이용하여 멸균하는 것이 바람직하다.

Ⅱ. 종자의 발아

본 발명의 바람직한 실시 예에 있어서, 종자의 발아 시 이용되는 배지는 MA, B5, LS, N6 및 화이트'스 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 비타민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 또한, 상기 비타민은 보다 바람직하게는 니코틴산, 티아민 및 피리독신 등을 포함한다. 한편, 본 발명의 발아배지는 pH 변화를 완충시키는 역할을 하는 MES (2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Monohydrate)를 추가적으로 포함할 수 있고, 고체 지지체로서 아가를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 발아배지에는 식물 성장 조절제는 첨가하지 않는다.

Ⅲ. 형질전환 조직의 준비

본 발명에서는 종자의 발아에서 생성된 모든 조직이 이용될 수 있으나, 바람직하게는 자엽 및 배축을 이용할 수 있고, 가장 바람직하게는 자엽을 이용한다. 발아된 종자에서 자엽을 얻는 경우에는 생장점을 완전히 제거하고 채취하는 것이 바람직하다. 또한, 자엽은 절단되지 않은 자엽 전체를 이용하는 것이 바람직하다.

Ⅳ. 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 감염

수세미 세포의 형질전환은 Ti 플라스미드가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 실시한다 (Depicker et al., Plant cell transformation by Agrobacterium plasmids. In Genetic Engineering of Plants, Plenum Press, New York, 1983). 보다 바람직하게는 바이너리 (binary) 벡터 시스템을 이용하는 것이다 (An et al., Binary vectors. In Plant Gene Res. Manual, Martinus Nijhoff Publisher, New York, 1986). 상기한 바이너리 벡터는 예컨대, pBin19, pRD400, pRD320 등이 있다.

본 발명에 이용되는 바이너리 벡터는 기본적으로 (a) 수세미 세포 내에서 작용하는 복제 원점; (b) 수세미 세포 내에서 전사를 촉진할 수 있는 프로모터; (c) 상기 프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (d) 수세미 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열을 포함한다.

본 발명에 있어서, 용어 "프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열"에서 용어 "기능적으로 연결된"은 유전자의 발현이 프로모터에 의해 조절되는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 용어 "폴리아데닐 시그널 서열"은 진핵세포에서 생성되는 mRNA의 3'의 폴리아데닐레이션을 조절하는 서열이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바람직한 폴리아데닐 시그널 서열은 아크로박테리움의 플라즈미드 종양-유발 (Ti) 유전자들 예컨대, 노팔린 신타아제 (NOS) 유전자 및 (2) 식물 유전자들 예컨대, 7s 콩 저장 단백질 유전자 및 RuBP 카복실라제 유전자의 완두콩 E9 스몰 서브유닛의 폴리아데닐 시그널이다.

또한, 바람직하게는 상기 벡터에는 선택 표지로서 항생제 (카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자를 포함한다. 한편, 상기 벡터는 추가적으로 리포터 물질 (루시퍼라아제, β-글루쿠로니다아제 등)을 인코딩 하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 바이너리 벡터 내에 이용될 수 있는 포로모터는 예컨대, 콜리플라우어 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 1' 프로모터, 2' 프로모터 도는 노팔린 합성효소 (nos) 프로모터를 포함한다. 한편, 상기 외래 단백질을 인코딩 하는 구조 유전자 서열은 얻고자 하는 바람직한 형질에 따라 결정된다. 예컨대, 제초제 (글라이포세이트, 설포닐우레아 등) 저항성 유전자, 바이러스 저항성 유전자, 해충 저항성 유전자 (예; Bt 유전자), 악조건 (가뭄, 기온, 염 도) 저항성 유전자, 품질향상을 위한 유전자 (당도 증가, 과숙 지연 등), 의료용 단백질 생산 관련 유전자 (EGF, 각종 질병의 항원 또는 항체, 인슐린 등), 기능성 화장품 생산 관련 유전자 (알부민, 항균성 펩타이드 등)가 있다.

상기한 벡터를 내재하고 있는 아그로박테리움에 의한 식물 세포의 감염은 당 업계에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 예컨대. 생장점이 배제되도록 채취한 자엽을 아그로박테리움의 배양액에 침지시켜 공동 배양함으로써 아그로박테리움이 자엽에 감염되도록 하는 것이다. 공동배양액에는 바람직하게는 아세토시링곤이 포함되는데, 이는 아그로박테리움의 식물로의 형질전환을 돕기 위한 것이다.

V. 재분화

상기 아그로박테리움에 의해 형질 전환된 식물 조직의 재분화는 엄격하게 조절된 성분과 성분 양을 포함하는 재분화 배지에서 실시되어야 한다.

본 발명에 따르면, 재분화 배지는 MS, B5, LS, N6 및 화이트'스 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 비타민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 상기 비타민은 바람직하게는 니코틴산, 티아민 및 피리독신 등을 포함한다. 한편, 본 발명의 재분화 배지는 pH 완충 역할을 하는 MES를 추가적으로 포함할 수 있고, 고체 지지체로서 아가를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 재분화 배지에는 식물 성장 조절제가 포함된다. 식물 성장 조절 제 중 함유되는 시토키닌은 6-벤질아미노퓨린 (BAP), 키네틴, 제아틴, 이소펜틸아데노신 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 6-벤질아미노퓨린이 이용된다. 한편, 옥신계 성장 조절제 (α-나프탈렌아세트산(NAA), 인돌아세트산 및 2,4-디클로로페녹시 아세트산)는 본 발명의 재분화 배지에는 포함되지 않으며, 이는 종래의 재분화 배지와 크게 구별되는 측면이다.

재분화 배지에 포함되는 시토키닌의 양, 특히 BAP의 양은 1-4 ㎎/ℓ가 바람직하고, 그 함량이 1 ㎎/ℓ 미만 및 4 ㎎/ℓ을 초과하는 경우에는 재분화율이 크게 감소된다. 보다 바람직하게는 BAP의 양은 1.0-2.5 ㎎/ℓ이며, 가장 바람직하게는 2.0 ㎎/ℓ이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 형질전환된 조직을 선별할 수 있도록 항생제 (카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등)를 추가적으로 포함한다.

예컨대, 항생제로서 카나마이신을 이용하는 경우에는 그 양을 70-150 ㎎/ℓ으로 조절하는 것이 바람직하며, 그 함량이 70 ㎎/ℓ미만인 경우에는 재분화율이 높게 나타나기는 하지만 최종적인 형질전환율은 거의 0 %에 근접하는 문제점이 있고, 150 ㎎/ℓ을 초과하는 경우에는 재분화율이 크게 감소되는 문제점이 있다.

재분화 배지에서의 배양온도는 25℃ ± 1℃ 가 가장 바람직하고, 광배양 : 암배양의 비율은 16시간:8시간이 가장 바람직하다. 배양 기간은 가변적이나, 바람직하게는 약 3주-6주이다. 상기한 조건에 따라 재분화 배지에서 형질전환된 수세미 조직을 배양하면 캘러스 상태를 거쳐 재분화되어 신초가 형성된다.

Ⅵ. 발근

재분화된 조직은 본 발명의 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 수세미를 얻는다. 본 발명의 발근 배지는 MA, B5, LS, N6 및 화이트'스 등과 같은 영양 기본 배지, 에너지원 그리고 비타민을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 에너지원은 보다 바람직하게는 당류이고, 가장 바람직하게는 수크로스이다. 상기 비타민은 니코틴산, 티아민 및 피리독신 등을 포함한다. 한편, 본 발명의 발근 배지는 pH 완충 역할을 하는 MES를 추가적으로 포함할 수 있고, 고체 지지체로서 아가를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 발근 배지에는 식물 성장 조절제로서 시토키닌은 거의 이용되지 않고, 옥신이 주로 이용된다. 상기 옥신계 성장 조절제로서는 1-나프탈렌아세트산(NAA), 인돌아세트산, 2, 4-디클로로 페녹시 아세트산 등이 이용될 수 있고, 가장 바람직하게는 1-나프탈렌아세트산이다. 본 발명의 발근배지에서 1-나프탈렌아세트산의 바람직한 함량은 0.001-0.08 ㎎/ℓ이고, 그 함량이 0.001 ㎎/ℓ미만인 경우에는 발근에 소요되는 시간이 상대적으로 길고 뿌리털이 없는 가늘고 긴 뿌리가 다수 생기는 문제점이 있고, 0.08 ㎎/ℓ를 초과하는 경우에는 배지에 접한 줄기가 비대해 지면서 발근하지 않는 문제점이 있다. 보다 바람직한 NAA의 양은 0.005-0.03 ㎎/ℓ이다.

또한, 본 발명이 발근 배지가 고체 지지체로서 아가를 포함하는 경우에는 0.2-0.7% (w/v)의 함량이 바람직하다. 아가의 함량이 0.2% 미만인 경우에는 고체 지지체로서의 기능을 하지 못하고 0.7%를 초과하는 경우에는 뿌리 신장이 지연되고 짧고 굵은 뿌리가 형성되며 배지 밖으로 발근되는 양상을 나타내는 문제점이 발생한다.

Ⅶ. 형질전환체의 확인

본 발명에 의해 제조된 수세미 형질전환체는 당 업계에 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 예컨대, 형질전환 수세미의 조직에서 분리한 DNA 시료를 이용하여 PCR을 실시함으로서 형질전환에 의해 수세미의 지놈에 삽입된 외래 유전자를 용이하게 확인할 수 있다. 또한 서던 블롯팅 방법과 노던 블롯팅 방법 (Maniatis et al., Molecular Cloning, L Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989) 에 의해서도 형질전환체를 확인할 수 있다.

한편, 형질전환 시 이용되는 벡터에 β-글루쿠로니다아제 (glucuronidase) 유전자가 있는 경우에는 재분화된 자엽 조직의 일부를 X-gluc (5-Bromo-4-Chloro-3-Indole-β-D-Glucuronic Acid) 등의 기질 용액에 침지시켜 발색되는 양상을 육안으로 관찰함으로써 형질전환 여부를 용이하게 확인할 수 있다.

본 발명의 가장 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명은 (i) 수세미 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 수세미의 절단되지 않은 자엽 전체를 감염시키는 단계: (a) 수세미 세포 내에서 작동하는 복제 원점; (b) 수세미 세포 내에서 전사를 촉진 할 수 있는 포로모터; (c) 상기 프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (d) 수세미 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열; (ⅱ) 상기 감염된 수세미 자엽을 BAP (6-Benzylaminopurine) 1.5-2.5 ㎎/ℓ 가 함유된 배지에 삽입 방법으로 치상하여 재분화시켜 신초를 형성시키는 단계; 및 (ⅲ) 상기 재분화된 신초를 NAA (α-Naphtalene acetic acid) 0.005-0.03 ㎎/ℓ 가 함유된 발근배지에서 발근시켜 형질전환 수세미를 형성시키는 단계를 포함하는 수세미 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법에 의해 제조된 수세미 형질전환체를 제공한다.

상술한 본 발명의 수세미 형질전환체의 제조방법은 하기의 실시예에서 확인할 수 있듯이, 형질전환 효율 및 재분화 효율이 매우 높으며, 수세미 형질전환체 제조의 재현성이 매우 우수하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서는 자명할 것이다.

실시예 1: 식물 조직의 준비

수세미 (Lufa cylindrica Roem)종자를 5% NaOCl 용액에서 15분 동안 소독한 후 멸균 증류수로 15분씩 3회 수세하였다. 이어, 1/2 MSMS (Murashige & Skoog medium including Minimal Salts), 2% 수크로스 및 0.6% 아가를 함유한 발아배지에 치상하여 암상태 조건에서 25± 1℃ 조건에서 4일동안 배양하여 발아시켰다. 그런 다음, 본엽이 생기지 않은 유묘만을 선택하고, 자엽 절편과 배축을 채취하여 하기의 재분화 조건 확립 실험에 이용하였다.

실시예 2: 식물조직의 재분화에 적합한 배지 조성의 확립

자엽 또는 배축의 재분화 조건 확립을 위하여, 시토키닌으로서 BAP (6-Benzylaminopurine)를, 옥신계 생장조절제로 NAA (α-Naphtalene Acetic Acid)를 각 농도별로 조합하여, 16종의 배지를 제조하였다 (참조: 표 1). 재분화를 위한 기본배지 조성은 MSB5 (Murashige & Skoog medium including Gamborg B5 vitamins), 500 ㎎/ℓ의 MES (2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid Monohydrate), 3% 수크로스와 0.6% 아가를 사용하였다.

구분	BAP (㎎/ℓ)	NAA(㎎/ℓ)
배지 1	1.00	0.00
배지 2	1.00	0.01
배지 3	1.00	0.10
배지 4	1.00	1.00
배지 5	2.00	0.00
배지 6	2.00	0.01
배지 7	2.00	0.10
배지 8	2.00	1.00
배지 9	4.00	0.00
배지 10	4.00	0.01
배지 11	4.00	0.10
배지 12	4.00	1.00
배지 13	8.00	0.00
배지 14	8.00	0.01
배지 15	8.00	0.10
배지 16	8.00	1.00

이어, 상기 배지에 각각 12 개체를 치상하고 25± 1℃ 및 8,000 룩스, 16 시간/8 시간 (day/night)의 조건에서 광배양하여 30일 동안 배양한 후 재분화율 및 평균 신초 수를 조사하였다. 재분화율은 치상한 총 절편 수에 대한 재분화된 절편 수를 백분율로 환산하여 얻었고, 평균 신초 수는 재분화한 절편 수에 대하여 발생한 신초의 총 수를 백분율로 환산하여 얻었다. 그 결과는 다음 표 2와 같다.

배지 No	재분화 절편 수	재분화율	평균 신초수
1	4.20	35.00	0.49
2	0.00	0.00	0.00
3	0.00	0.00	0.00
4	0.00	0.00	0.00
5	4.80	40.00	1.00
6	0.00	0.00	0.00
7	0.00	0.00	0.00
8	0.00	0.00	0.00
9	4.40	36.67	0.81
10	0.00	0.00	0.00
11	0.00	0.00	0.00
12	0.00	0.00	0.00
13	0.80	6.67	0.58
14	0.00	0.00	0.00
15	0.00	0.00	0.00
16	0.00	0.00	0.00

상기 표 2에서 알 수 있듯이, 실험에 사용한 수세미는 배지 종류에 따라 6.67-40%의 다양한 재분화율 및 0.49-1.0의 신초 형성능을 나타냈다. 호르몬 조합 실험에 의해 BAP 1-4 ㎎/ℓ 에서는 높은 재분화율 및 신초 형성능을 나타낸 반면, 4 ㎎/ℓ 이상에서는 오히려 재분화율이 감소하는 경향을 보였다. 또한, NAA가 첨가되지 않은 경우에 놓은 재분화율 및 신초 형성능을 보였다. 특히, NAA가 첨가되지 않은 BAP 2.0 ㎎/ℓ 처리된 배지에서 재분화율이 가장 높게 나타났으며, 평균 신초수도 절편 당 1.0 개로 가장 높았고, 재분화에 필요한 최소일수도 20일 정도로 가장 우수하였다.

상기한 실험 결과는 자엽에 대한 것으로서, 배축의 경우에는 자엽에 비해 재분화율이 매우 낮고, 신초가 거의 형성되지 않았으며, 처리구의 대부분이 재분화하지 않고 캘러스가 형성되다가 고사하거나 생장을 멈추는 양상을 나타내었다.

일반적으로 암배양상에서 4-5일된 자엽을 재분화 배지에 치상했을 때, 약 7일이 지나면 배지 접촉면을 중심으로 캘러스가 생성되었으며, 약 15일이 경과한 후에 비대해진 캘러스에서 신초가 재분화 하면서 다신초를 형성하기 시작하였다 (도 1).

도 1에서 A 패널은 배지 치상 후 10일된 자엽, B 패널은 20 일된 자엽의 기저부에서 재분화된 신초를 나타낸다.

결과적으로, 수세미의 재분화를 위해서는 자엽이 우수한 재료가 되고, 재분화 조건은 시토키닌으로 BAP (2 ㎎/ℓ) 만을 포함하는 배지를 이용하는 경우가 가장 최적의 조건임을 알 수 있다.

실시예 3: 식물 조직 시료의 상태에 따른 재분화율 조사

식물 조직 시료의 상태에 따른 재분화율을 조사하기 위하여, 가장 적합한 시료로 선택된 자엽을 시료로 하고 생장점에서 2 mm 정도 위를 자른 자엽을 상기한 배지 중 가장 적합한 배지로 선발된 배지 5에 치상하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 재분화율 및 평균 신초 수를 조사하였다.

실험 결과, 자엽 절편 전체를 치상한 처리구의 재분화율이 높았으며 평균 신초수도 높았다. 따라서 수세미 자엽의 신초 재분화를 위해서는 자엽의 상부를 제거하지 않고 자엽 절편 전체를 이용하는 것이 바람직한 것으로 나타났다.

실시예4: 치상 방법에 따른 재분화율 조사

치상 방법에 따른 재분화율을 조사하기 위하여, 상기 실시예 3에서 재분화율이 가장 높은 것으로 나타난 자엽 절편 전체를 배지면에 삽입하는 방법과 자엽을 배지면에 눕혀두는 방법으로 상기 실시예 2의 배지 5에 치상하여 실시예 2와 동일한 방법으로 재분화율을 조사하였다.

실험 결과, 자엽 절편은 잎 절편과는 달리 가장자리에 상처를 유기한 후 배지면에 눕혀 치상하는 경우는 거의 재분화되지 않았으며 캘러스 형성율도 극히 저조하였다. 이러한 결과는 잎 절편을 재분화하는 경우와 반대되는 것으로서, 자엽 절편체의 치상은 삽입하여 치상하는 것이 가장 효율적임을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 형질전환 조건의 확립

가장 적합한 형질전환 조건을 확립하기 위하여, 상기 실시예에서 선발된 BAP 2 ㎎/ℓ를 포함하는 MSB5 배지를 이용하여 공동 배양방법 및 배양기간, 공동 배양시의 처리 온도 등을 다르게 하여 형질전환을 시도하였다.

우선, 수세미의 종자를 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 발아시키고 이로부터 자엽 절편을 얻었다. 또한, 도 2에 도시된 gus::npt II 융합 유전자와 pat (phosphinothricin acetyl transferase) 유전자를 가진 pRD320 벡터 (Omirulleh et al., Activity of a chimeric promoter with the doubled CaMV 35S enhancer element in protoplast-derived cells and transgenic plants in maize. Plant Mol. Biol. 21(3):415-428, 1993)로 형질 전환된 아그로박테리움 튜머페이션스 GV3101(Mp90) (Hamid et al., Transgenic plant production from leaf discs of Moricandia arvensis using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports 15(11):799-803, 1996)을 수퍼 브로스 (super broth: 37 g/l Brain heart infusion broth(Difco), 0.2% 수크로스, pH 5.6)에서 18시간 동안 배양한 다음, 이 배양액에 상기 자엽 절편을 침지시켜 10 분간 혼합하였다.

그런 다음, 2일 동안 25℃에서 광배양 조건으로 공동배양 배지 (BAP 2 ㎎/ℓ 가 함유된 MSB5)에서 3 일 동안 아그로박테리움 튜머페이션스 및 자엽을 공동배양 하였다. 그리고 나서, 기존의 방법과는 달리 세균을 제거하는 클린 업 (clean up) 단계를 거치지 않고, 자엽을 MSB5, MES 0.5 g/l, 3% 수크로스 및 0.4% 피타겔을 기본으로 하는 배지에 BAP 2 ㎎/ℓ 와 카르베니실린 500 ㎎/ℓ, 그리고 카나마 이신을 농도별로 추가하여 4 주 동안 25±1℃ 및 8,000 룩스, 16시간/8시간 (day/night)의 조건에서 배양하였다.

이어, 재분화된 신초를 일정량의 NAA (0, 0.01 및 0.1 ㎎/ℓ), 카나마이신 100 ㎎/ℓ 및 일정량의 아가 (0.4%, 0.6% 및 0.8%)를 포함하는 발근 배지에 옮겨 25±1℃ 및 8,000 룩스, 16시간/8시간 (day/night)의 조건으로 배양하여 발근한 개체를 형질전환체로 추정하여 하기 실시예 6의 방법을 이용하여 분석하였다.

비형질전환체로서 발근 배지에서 발근하지 못하고 황화되면서 괴사되는 자엽 및 정상적인 형질전환체의 비교는 도 3에 잘 나타나 있다. 도 3에서 A 패널은 정상적인 형질전환체, B 패널은 비형질전환체를 각각 나타낸 것이다.

구분	카나마이신 농도 (㎎/ℓ)	절편수	재분화		형질전환
구분	카나마이신 농도 (㎎/ℓ)	절편수	개체수	재분화율(%)	개체수	형질전환율(%)
1차	50	40	38	95.0	0	0.0
	100	40	10	25.0	2	5.0
	200	40	1	2.5	0	0
	300	40	0	0	0	0
2차	5	100	37	95.0	0	0.0
	25	100	38	95.0	0	0.0
	50	100	36	90	0	0.0
	100	100	1.5	3.5	2	5.0

상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, 선택배지의 카나마이신 농도가 50 ㎎/ℓ의 경우에는 재분화율은 높게 나타났으나, 형질전환율이 거의 0%에 근접하게 나타났으며, 카나마이신 농도가 100 ㎎/ℓ의 경우에는 약 30%의 재분화율 및 약 5%의 형질전환율을 나타냈고, 카나마이신 농도가 200 ㎎/ℓ의 경우에는 약 3%의 재분화율 및 0%의 형질전환율을 나타내었다. 따라서, 선택배지에서의 카나마이신 농도는 약 100 ㎎/ℓ 가 적합하다는 것을 알 수 있다.

한편, 발근 배지에서 NAA의 농도가 증가할수록 굵고 짧은 뿌리에 뿌리털이 많이 발생하며 발근 소용일 수도 짧았으나 NAA의 농도가 0.1 ㎎/ℓ 인 경우에는 일부에서 배지에 접한 줄기가 비대해지면서 발근하지 않는 경우도 관찰되었다. 반면 NAA를 처리하지 않은 경우에는 발근에 소요되는 시간이 상대적으로 길고 뿌리털이 없는 가늘고 긴 뿌리가 다수 생기는 현상을 관찰할 수 있었다. 따라서, 발근 배지에서의 적합한 NAA의 농도는 약 0.01 ㎎/ℓ 임을 알 수 있다.

실시예 6: 형질전환체의 확인

상기 실시예 5에서 형질전환체의 확인은 다음과 같이 실시하였다:

실시예 6-1. GUS 분석

β-글루쿠로니다아제 활성을 측정하기 위하여 재분화된 자엽 조직의 일부를 X-glu (5-Bromo-4-Chloro-3-Indole-β-D-Glucuronic Acid) 용액에 침지시키고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 발색(청색) 정도를 육안으로 관찰함으로써 형질전환체를 확인하였다 (도 4a).

실시예 6-2. PCR 분석

PCR 분석을 위한 식물 지놈 DNA의 분리는 Edwards 방법 (Edward et al., A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research 19(6):1349, 1991)에 의하여 추출하였다. PCR 분석에서 사용된 프라이머는 아그로박테리움 튜머페이션스에 있는 벡터의 pat 유전자의 염기 서열에 대응하는 것으로서, 전방향 프라이머는 5'-AGA CCA GTT GAG ATT AGG CCA G-3' 이고, 역방향 프라이머는 5'-GCC TCA TGC AAC CTA ACA GA-3'이다 PCR 반응은 Taq 중합효소를 이용하여, 96℃에서 2분간 전변성한 후, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 연결반응, 72℃에서 2분간의 중합반응을 35회 반복하였고, 추가로 72℃에서 10분간 연장 반응을 한 후 반응산물은 1.0% 아가로스 겔에서 분석하였다 (참조: 도 4b). 도 4b에서 M 열은 분자량 마커, 1열은 pat 유전자를 포함하는 양성 표준 플라스미드의 PCR 산물, 2열은 야생종 수세미의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR 산물, 3열부터 10열까지는 선발된 수세미 형질전환체의 DNA를 주형으로 한 PCR 산물들을 나타낸 것이다. 도 4b에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 형질전환체에서 pat 유전자에 해당하는 0.5 kb DNA 밴드가 관찰되어 형질전환되었음을 확인할 수 있었다.

박과류에 대해 대단히 많은 조직배양 연구가 수행되었지만 현재까지 수세미의 재분화에 대한 연구는 전무한 실정이다. 상기 실시예 5 및 6의 결과로부터, 본 발명에 따른 가장 적합한 재분화 조건 및 형질전환 조건에서 수세미 자엽을 대상으로 실험을 한 경우 약 20-30%의 재분화율 및 약 4%의 형질전환율을 나타내어 성공적으로 수세미의 재분화 및 형질전환이 이뤄졌음을 알 수 있다.

본 발명은 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 수세미 형질전환체의 제조방법 및 그로부터 제조되는 수세미 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 수세미 형질전환체 제조방법의 특징은 수세미의 재분화시 옥신 성장제를 사용하지 않는 것에 있으며, 본 발명에 의하면 수세미의 형질전환 효율 및 재분화 효율이 매우 높고, 형질전환체 제조의 재현성이 매우 우수하다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 수세미 형질전환의 제조방법:

(i) 수세미 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 수세미의 절단되지 않은 자엽을 감염시키는 단계: (a) 수세미 세포 내에서 작동하는 복제 원점; (b) 수세미 세포 내에서 전사를 촉진할 수 있는 포로모터; (c) 상기 프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (d) 수세미 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열;

(ⅱ) 상기 감염된 수세미 자엽을 BAP (6-Benzylaminopurine) 가 함유된 배지에 삽입 방법으로 치상하여 재분화시켜 신초를 형성시키는 단계; 및

(ⅲ) 상기 재분화된 신초를 NAA (α-Naphtalene acetic acid) 가 함유된 발근 배지에서 발근시켜 형질전환 수세미를 형성시키는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (i)의 자엽은 절단되지 않은 자엽 전체인 것을 특징으로 하는 수세미 형질전환체의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (ⅱ)에서의 치상은 자엽 전체를 배지면에 삽입 하여 실시됨을 특징으로 하는 수세미 형질전환체의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (ⅱ)의 BAP의 양은 1.0-4.0 ㎎/ℓ 인 것을 특징으로 하는 수세미 형질전환체의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (ⅱ)의 BAP의 양은 1.5-2.5 ㎎/ℓ 인 것을 특징으로 하는 수세미 형질전환체의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (ⅲ)의 발근 배지의 NAA의 양은 0.001-0.08 ㎎/ℓ 인 것을 특징으로 하는 수세미 형질전환체의 제조 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 단계 (ⅲ)의 발근 배지의 NAA의 양은 0.005-0.03 ㎎/ℓ 인 것을 특징으로 하는 수세미 형질전환의 제조방법
다음의 단계를 포함하는 수세미 형질전환체의 제조방법:

i) 수세미 세포의 지놈 DNA에 삽입될 수 있고 다음과 같은 서열을 갖는 벡터가 내재되어 있는 아그로박테리움 튜머페이션스로 수세미의 절단되지 않은 자엽 전체를 감염시키는 단계: (a) 수세미 세포 내에서 작동하는 복제 원점; (b) 수세미 세포 내에서 전사를 촉진할 수 있는 포로모터; (c) 상기 프로모터에 기능적으로 연결된 외래 단백질을 코딩하는 구조 유전자 서열; 및 (d) 수세미 세포 내에서 작동하여 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐을 형성시키는 폴리아데닐 시그널 서열;

(ⅱ) 상기 감염된 수세미 자엽을 BAP (6-Benzylaminopurine) 1.0 - 2.5 ㎎/ℓ 가 함유된 배지에 삽입 방법으로 치상하여 재분화시켜 신초를 형성시키는 단계; 및

(ⅲ) 상기 재분화된 신초를 NAA (α-Naphtalene acetic acid) 0.005-0.03 ㎎/ℓ 가 함유된 발근배지에서 발근시켜 형질전환 수세미를 형성시키는 단계
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 수세미 형질전환체.