JPS62190075A - ウリ科植物の組織培養物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ウリ科植物の組織培養により、増殖の速いカ
ルスを誘導し、培養物を製造する方法に関する。

（従来の技術〉 従来から、ウリ科植物の果実の絞り汁または茎から浸出
する液汁を用いて化粧水にすることはよく知られている
。特に、ヘチマの茎から浸出する液汁はヘチマ水として
、そのまま化粧水として使用されていた。その他、ウリ
科植物の化粧料への利用については種々性なわれており
、例えば、ウリ科植物の果実や種子から採取した油の利
用（特公昭５３−４６８９２）、果実抽出粗苦味エキス
にチロシナーゼ活性阻害効果が見られること（特開昭５
７−７７６１０）等が挙げられる。

（発明の解決しようとする問題点） しかしながら、化粧料基材として優れているウリ科植物
の栽培は、季節、気候、温度等の自然環境の制約を受は
易いため、栽培品か゛らの採取では安定した供給が得ら
れないという問題があった。

最近、植物成分を生産する手段として、植物細胞培養の
研究が行なわれている。植物細胞培養は天然植物、・栽
培植物に比べ、生育速度が速く、短期間に目的とする成
分を生産することができ、また、天然栽培とは異なり気
象条件等に左右されず、しかも工業的に計画生産するこ
とができるという利点を有している。

本発明の目的は、上記の問題を解決するため、ウリ科植
物の細胞培養を検討し、天然植物、あるいは栽培植物に
相当する増殖の速い組織培養物を得ることにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、この目的を達成するため、ウリ科植物体
からのカルス誘導を検討し、本発明を完成した。

本発明で使用するウリ科植物は、ウリ科（Ｏｕ−ｃｕｒ
ｂｉｔａｃｅａｅ　）　、キュウリ属（Ｏｕａｕｍｉｓ
　）のメロン（Ｏｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ　Ｌ、）およ
び１チマ属（Ｉ、ｕ−ｆｆａ　）のヘチマ（Ｌｕｆｆａ
　ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ　Ｒｏｅｍ、　）が例示される
。さらに、メロンとしては、ネットメロン（Ｏｕｃｕｍ
ｉａ　！！ｌ＠１１０　Ｌ、　（ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕ
ｓ　ｇｒｏｕｐ　）〕、マクワウリ（Ｏｕｃｕｍｉｓ　
ｍｅｍｏ　Ｌ、　（ｍａｋｕｗａｇｒｏｕｐ　）　）、
ウィンターメロン（Ｏｕｃｕｍｉｅ　ｍｅｌｏ　Ｌ。

（ｉｎｏｄｏｒｏｕｓ　ｇｒｏｕｐ　）　）、シロウリ
（ｏｕｃｕｍｌｓ　ｍｅ−１ＯＬ、　（ｃｏｎｏｍｏｎ
　ｇｒｏｕｐ））、および交配種のプリンスメロン等が
挙げられる。上記の分類は、牧野富太部著「原色牧野植
物大圓鑑Ｊ５４１−５頁、１９８２年、北隆館発行、同
続編１９０−１頁、１９８３年、北隆館発行および高嶋
四部著「原色日本野菜図鑑Ｊ１４３−１６２頁、１９８
２年、保育社発行によるものである。

本発明で使用する植物組織培養カルスは、ウリ科キュウ
リ属のメロンまたはウリ科ヘチマ属のヘチマなどを原料
とする。これらの原料からカルスを誘導する場合につい
て、メロンを例にとり、具体的操作手順を示す。

先ず、メロン種子を１晩水道水に浸漬後、２５％沈亜塩
素酸す）　ＩＪウム溶液に１０〜１５分間浸漬して表面
に付いている雑菌を殺菌した後、無菌蒸留水で洗浄する
。ペーパータオルで水を吸い取った後、０，８％寒天上
で無菌的に発芽させる。暗所、２８℃で培養し、発芽し
て５闘程度の大きさになったところで、１００ｍ１のム
ラシゲ−スクーグ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　
Ｓｋｏｏｇ培地あるいはＭＳ培地）を入れた３００ｍ＋
／のトールビーカーに移し、明所にて育てる。発芽１０
〜２０日目の植物体を材料とする。次に、植物体を適当
な大きさに滅菌メスで切断して小片（例えば、子葉、胚
軸は３闘角程度、根は３〜５ｍｍ程度の長さ）とし、ａ
−ナフタレン酢酸などのオーキシン類およびカイネチン
などのサイトカイニン類を含む合成培地（ＭＳ培地）上
に置床し培養する。培養は、２０〜３５℃の一定条件下
の明所または暗所において、好ましくは２８℃前後の明
所で行なうのがよい。

かかる培養により、−週間目には、切断面からカルスが
形成されるので、無菌的にこれを新しい合成寒天培地上
に移植し、前記と同様な培養法により、継代培養を行な
うと、生育速度がしだいに高まり安定したカルスが得ら
れる。

カルスの培養に用いられる培地組成としては、通常の植
物組織培養において多く用いられる前記のＭＳ培地、ホ
ワイト培地、ヒルデブランド培地、リンスマイヤー−ス
クーグ培地（Ｌｓ培地）等いずれの培地でも良いが、Ｍ
Ｓ培地の様な比較的高濃度の培地が好ましい。このよう
な基本培地に、ビタミン、アミノ酸等の有機物、炭素源
、植物ホルモン、および天然抽出物を添加したものを用
いる。

上記有機物としては、チアミン塩酸塩、ニコチン酸、ピ
リドキシン、ビオチン等のビタミン、グルタミン、アス
パラギン、アラニン等のアミノ酸が挙げられるが、これ
ら微量有機物は必ずしも培地に添加する必要はない。

炭素源としては、ショ糖、ブドウ糖、麦芽糖、ソルビト
ール等の糖類が挙げられ、糖類を添加したほうが生育も
早く望ましい。特に、ショ糖の添加が好ましく、培地に
１〜６％（Ｗ／Ｖ）添加するのが良い。

植物ホルモンとしては、α−ナフ・メロン酢酸（ＮＡＡ
）、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、
２，４．５−トリクロロフェノキシ酢酸（２゜４、５−
　Ｔ　）　、インドール−３＝酢酸（工ｈｈ）、ビクロ
ラム（ｐｉｅ）等のオーキシン、カイネチン（ｘ　１ｎ
）　、ベンジルアデニン（ＥＡ）等のサイトカイニンが
挙げられ、これらは単独または組合せて用いる。培地に
オーキシン０．００１〜１０ｐｐ”％サイトカイニン０
〜１０ｐｐｍ程度添加するのが好ましい。

天然抽出物としては、ココナツツミルク（０〜２５％Ｗ
／ｖ）、カゼイン加水分解物（０〜２％ｗ　／　Ｖ　）
　、酵母エキス（０〜２％Ｗ／Ｖ　）等があり、これら
は単独または組み合せて使用することができる。なお、
寒天固型培地での培養では、上記の培地組成成分の他、
寒天（０，５〜２％Ｗ／Ｖ）を加え、培地を固めるのが
好ましい。

培地は、最終的に、０．１〜１Ｎの水酸化す）　ＩＪウ
ム（または水酸化カリウム）と塩酸によりｐＨ５、４−
６，０の間に調整する。

明所培養は、１００〜１０，０００ルツクスの光照射下
において行なうのが好ましく、光源としては螢光灯、水
銀灯、白熱電灯、太陽光等を用いることができる。

なお、工業的にカルスを得るには、上記カルスを一般微
生物の培養と同じ操作で静置培養法、液体培養法（振盪
培養、通気培養）などを用いて大量増殖させればよい。

本発明によれば、前記のように植物体の外植片から直接
カルス化する方法の他、まず、植物体から酵素処理によ
ってプロトプラストを単離した後、このプロトプラスト
からカルス化する方法も用いることができる。

このようにして培養したカルスから、化粧料基材として
優れている成分を分離採取するには、公知の方法、例え
゛ば溶媒抽出法によって行なうことができる。

すなわち、本発明で用いるウリ科植物の組織培養カルス
の抽出物は、ウリ科植物の組織培養カルスを、例えば、
水、エタノール、メタノール、プロピレングリコール等
の水溶性溶媒、あるいは、これらの混合溶媒で抽出した
ものであり、必要に応じて濃縮あるいは希釈して化粧料
基材として用いることができる。抽出操作は、通常、熱
水で、好ましくは、加圧条件下で、例えば、１２０〜２
００℃の温度で約３０〜１２０分熱水抽出する方法がよ
い。また、低温での抽出法も用いることができる。抽出
溶媒の使用量には特別な制約はないが、通常、ウリ科植
物の組織培養カルスの重量に対して、約１〜１００培量
の溶媒を使用して抽出を行なうとよい。また、抽出は繰
り返し行なうことも可能である。

次に、実施例を示しつつ本発明の培養法について説明す
る。

実施例１．　メロンの組織培養 メロン種子を１晩水道水に浸漬後、２．５％次亜塩素酸
ナトリウム溶液に１０〜１５分間浸漬して表面に付着し
ている雑菌を殺菌した後、無菌蒸留水で洗浄する。ペー
パータオルで水を吸い取った後、０．８％（Ｗ／Ｖ　）
寒天上で無菌的に発芽させる。２８℃の暗所で培養し、
発芽後５ｗｔ程度の大きさになったところで、ＭＳ培地
１００ｇ／を入れた５　００　ｍｌ　）−ルビーカーに
移し、白色帯光灯をつけた室内で育てる。発芽１０〜２
０日目の芽ばえを適当な大きさに滅菌メスで切断して小
片（子葉、胚軸は３闘角程度、根は３〜５ｍｍ程度の長
さ）とし、シラ糖３％、Ｎ　Ａ　Ａ　Ｏ，５ｐ　ｐｍ　
Ｎカイネチン１．０　ｐ　ｐ　ｍを含有し、寒天０．８
％加えたＭＳ培地（ｐ　Ｈ５，７、オートクレーブ（１
２０℃、１、２　ｋｇ／ｃｒｌ　）　テ２０分間域ｍシ
ｔ、−モノ〕ニ置床シ、２８℃、４週間培養室内（明所
）で静置培養してカルスを誘導する。さらに得られたカ
ルスを細かく分割し、前記培養条件で、カルスの増殖を
行なう。このような操作を４〜６週間毎に繰り返す。

このようにして増殖したメロンの組織培養カルスを固形
培地から分離し、凍結乾燥する。収量１５ｇ。

上記培養条件では、子葉、胚軸、根切片のいずれもから
増殖の速いカルスを得ることができた。

また、工ＡＡ、２．４−Ｄ％ピクロデムとカイネチンの
組み合せでは、特に胚軸切片からのカルス誘導が良好で
あった。さらに、胚軸由来のカルスを０．８％寒天のみ
を含まない前記Ｍ８培地で、細胞懸濁培養を行なったと
ころ、寒天を含む前記ＭＳ培地のときと同様、増殖の速
いカルスが得られた。

実に例２．　　メロンプロトプラストからの組織培養実
施例１と同様にしてメロンの種子を無菌的に発芽させ、
発芽１０〜２０日目の芽ばえの子葉（虫垂０．２〜０．
３ｇ）を、０１％ペクトリアーゼＹ−２３，１，５％セ
ルラーゼオノヅカＲ−１０，０、４Ｍマンニトール、０
５％デキストラン硫酸カリウム、および０１％塩化カル
シウムを加えた酵素液中に入れ、１〜１５時間、５０℃
で振盪（５０回／分）した。得られたプロトプラストを
、５０μのナイロンメツシュで一過後、８００ｒｐｍ。

２分間遠心分離を行なって酵素液を除き、０．４Ｍマン
ニトール液に懸濁した。この条件では、子葉Ｉｇ（虫垂
）当り約５Ｘ１０’のプロトプラストが単離された。得
られたプロトプラストを、２Ｍｔの液体培地に懸濁し、
３５酩のファルコン（１００８）プラスチックシャーレ
に入れて培養した。培地としては、１％（Ｗ　／　Ｖ　
）　シ、糖、Ｑ、　４　Ｍ　Ｔ　ンニトール％　０．５
　ｐ　ｐ　ｍ　Ｎ　Ａ　Ａ　％　Ｉ　Ｐ　Ｐ　！ＩＩカ
イネチンを加えたｙｓ培地を用いた。この培地で、１Ｘ
１０５個／　ｍｌのプロトプラストを２８℃での静置培
養すると、培養５日以内に、生存しているプロトプラス
トの８０％以上が細胞壁を再生する。培養１４〜２０日
目にマンニトール濃度を０．４Ｍから０．２Ｍに下げ、
約１カ月後に約０．５〜１．０闘のコロニーを形成した
ところで、マンニトールを含まない寒天培地にコロニー
を移す。３〜５鰭の大きさになったコロニーを３％ショ
糖、０．５　ｐ　ｐ　ｍ　Ｎ　Ａ　Ａ、　。

ｌｐｐｍカイネチンを加えたＭＳ培地に置床し、２８℃
、４週間培養室内で静置培養してカルスを誘導する。さ
らに、実施例１と同様にして、メロンプロトプラストか
らのカルスを得た。収量５０ｇ（凍結乾燥品）。

実施例５．　ヘチマの組織培養 ヘチマの種子を実施例１のメロンの場合と同様にして、
乾燥カルス２１ｇｆｒ：得た。

なお、添加する植物ホルモンは、どの部位においても、
２．４−Ｄのみか、あるいは、２．４−　Ｄとカイネチ
ンを添加した培地が特に適しており、増殖の速いカルス
が得られた。それらのホルモンの最適濃度を表３に示す
。

表３．　ヘチマ切片からのカルス誘導に最適な植物ホル
モンの濃度 （発明の効果） 本発明のウリ科植物の組織培養カルスの水抽出成分につ
いて、平井らの報告〔生薬学雑誌、３７．３７４−３８
０（１９８３））に従ってラット腹腔内から採取した肥
満細胞に対するヒスタミン遊離抑制作用を測定した。い
ずれもヒスタミン遊離作用は認められず、逆に、フンカ
ナバリンＡ　（ＣｏｎＡ）あるいはフンパウンド４８　
／　８０　（Ｏｏｍｐ　４８／８０）によるヒスタミン
遊離を抑制する作用が認められ、抗炎症剤（泪炎剤）と
しても優れていることを見出した（表１．２）。

※１．遊離阻止率１％ ※２、乾燥品５．０ｇを熱水抽出（９５℃、３時間。

ｓ　ｏ　ｏ　ｍｌ　）後、一過し、Ｐ液を凍結乾燥した
もの。

表２．　　ヘチマのヒスタミン遊離抑制効果　　※１※
１．遊離阻止率１％ ※２．乾燥品５．０ｇを熱水抽出（９５℃、３時間。

３００　ｍｌ　）後、瀝過し、ｐ液を凍結乾燥したもの
。

※３．メンブランフィルタ−を用いて除菌後、凍結乾燥
したもの（収量１ｇ／ｌ）。

表１．２からも明らかなように、本発明のメロンおよび
ヘチマの組織培養カルスの水抽出物は、メロンおよびヘ
チマの果実または全草の水抽出物、ヘチマ水等と同様な
抗炎症作用が認められた。

以上のことから、本発明によれば、天然あるいは栽培の
ウリ科植物体に相当する組織培養物を、天然植物あるい
は栽培植物よりも短期間に、また天然栽培とは異なり気
象条件などに左右されず、しかも、工業的に計画生産す
ることができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ウリ科植物の組織培養により、増殖の速いカルス
   を誘導し、培養物を製造する方法。
2. （２）ウリ科植物が、ウリ科キュウリ属のメロンである
   特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
3. （３）ウリ科植物が、ウリ科ヘチマ属のヘチマである特
   許請求の範囲第（１）項記載の方法。