CN113598054B - 一种粉葛茎尖组织培养快速育苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种粉葛茎尖组织培养快速育苗方法，包括以下步骤：S1.外植体的准备：挑取粉葛幼苗的顶端茎尖分生组织，将其纵切，一分为二得到外植体；S2.诱导和分化：将所述外植体转入诱导分化培养基中进行培养，培养15～25d得丛生芽；S3.丛生芽再生：将所述丛生芽转入生根培养基中进行生根培养。该粉葛茎尖组织培养快速育苗方法，将茎尖纵切一分为二作为外植体，并将愈伤组织诱导及分化工艺简化为一步进行，不仅提高了愈伤组织诱导率和分化率，还减少了获得再生植株的时间。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种粉葛茎尖组织培养快速育苗方法。
【背景技术】
粉葛(Pueraria thomsoniiBenth)为豆科葛属(Pueraria DC.)植物中资源较为丰富的一类，为中国卫生部首批批准的药食同源两用植物，素有“北参南葛”、“亚洲人参”之美誉。粉葛除富含淀粉外，还含有钙、铁、锌等多种微量以及氨基酸、维生素等，具有较高的营养价值。粉葛全身是宝，茎皮纤维可拧绳，织葛布，也可做食用菌栽培，块茎富含淀粉，可加工成保健食品，也可酿葛酒。可作为天然的保健食品，市场需求量大。
粉葛传统繁殖方式为扦插繁育，这一繁殖方式不仅成活率和繁殖系数较低，且受自然条件影响较大。另外，生产上粉葛若长期通过葛藤进行连续无性繁殖，受连续多年无性繁殖和病虫害危害等因素的影响，必然会出现优良品种种性退化等问题，从而造成产量和品质下降。组织培养离体繁殖技术是在无菌环境下，通过选择高产健康优良无病株系作为起始材料，进行优良品种的快速繁育，可达到提纯复壮、提高产量和品质的效果。获得高效的粉葛愈伤组织诱导及再生技术体系不仅有利于粉葛优良品种(系)快速繁育，同时也为粉葛开展分子生物学研究和新品种选育奠定重要的技术基础。
申请号为CN202010901257.X的发明专利公开了一种葛根组培苗叶片愈伤组织诱导及再生方法，采用以葛根组培苗的叶片进行愈伤组织的诱导并再生植株。申请号为CN201310585519.6的发明专利公开了一种粉葛组织培养快速育苗方法，采用带腋芽的茎段进行组织培养，达到快速繁殖育苗的目的。叶片、茎段取材方便，常作为作为外植体材料，但是存在着分化率低的问题，而且愈伤组织培养和分化需要分开采用不同的培养基分步培养，培养时间长，效率低。因此，本专利拟建立一种粉葛茎尖组织培养快速育苗方法，提高分化率并减少培养时间，提高效率。
【发明内容】
有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种粉葛茎尖组织培养快速育苗方法，不仅提高了愈伤组织分化率，还减少了获得再生植株的时间。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：
一种粉葛茎尖组织培养快速育苗方法，包括以下步骤：
S1.外植体的准备：挑取粉葛幼苗的顶端茎尖分生组织，将其纵切，一分为二得到外植体。
S2.愈伤组织诱导和分化：将所述外植体转入诱导分化培养基中进行培养，培养15～25d得丛生芽。
诱导分化培养基为：MS+0.5～1.5mg/L KT+0.2～1.0mg/L 6-BA+0.05～0.2mg/LNAA+25.0～35.0g/L蔗糖+5.0～7.0g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
S3.丛生芽再生：将所述丛生芽转入生根培养基中进行生根培养。
优选的，步骤S2中，将粉葛丛生芽转入预处理培养基上黑暗培养5～7天得到所述粉葛幼苗，培养温度为25±1℃；所述预处理培养基为MS+0.05mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
优选的，步骤S2中，培养温度为25±1℃，暗培养。
优选的，诱导分化培养基为：MS+1.0mg/L KT+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
改进的，将所述丛生芽转接到继代增殖培养基中进行增殖培养，25～30d后用相同培养基进行继代培养2-3次，然后再进行丛生芽再生；所述继代增殖培养基为：MS+0.02mg/L6-BA+0.02mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
优选的，培养条件为：培养温度25±1℃，光照强度1500～2000lx，光照时间16h·d-1。
优选的，步骤S3中，培养温度为25±1℃、光照时间为16h/d，光照强度为18.75～25μmol·m-2·s-1。
优选的，步骤S3中，生根培养基为：MS+0.02mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明的粉葛茎尖组织培养快速育苗方法，将茎尖纵切一分为二作为外植体，并将愈伤组织诱导及分化工艺简化为一步进行，不仅提高了愈伤组织分化率，还减少了获得再生植株的时间。
常规粉葛愈伤组织诱导及再生技术将愈伤组织诱导和分化分步进行，通过不同的培养基分步进行培养，不仅增加了培养时间，还增大了人为因素和外界条件对愈伤分化组织的不利影响，影响分化率，本申请发明专利采用纵切的茎尖作为外植体，采用特定配方的诱导分化培养基培养可以实现一步进行，从而大大减少了培养时间。
【附图说明】
图1为在诱导分化培养基上获得的丛生芽。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种粉葛茎尖组织培养快速育苗方法，包括以下步骤：
S1、外植体的准备
将粉葛幼苗，在体式显微镜下挑取顶端茎尖分生组织，将其纵切，一分为二作为外植体。
S2、愈伤组织诱导和分化
将所述外植体转入诱导分化培养基MS+1.0mg/L KT+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，(pH，5.8)中，20天后即得丛生芽。培养条件：培养温度为(25±1)℃、暗培养。
S3、丛生芽再生
在无菌条件下，将丛生芽伸长后转入生根培养基MS+0.02mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH，5.8)中进行生根培养，培养温度为(25±1)℃、光照时间为16小时/天，光照强度为18.75μmol·m-2·s-1。
实施例2
一种粉葛茎尖组织培养快速育苗方法，包括以下步骤：
S1、外植体的准备
在超净工作台上，将粉葛丛生芽转入预处理培养基MS+0.05mg/L 6-BA+0.02mg/LNAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH，5.8)上黑暗培养6天。培养温度为(25±1)℃。然后将暗培养预处理的粉葛组培苗，在体式显微镜下挑取顶端茎尖分生组织，将其纵切，一分为二作为外植体。
S2、愈伤组织诱导和分化
将所述外植体转入诱导分化培养基：MS+1.0mg/L KT+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，(pH，5.8)中，20天后即得丛生芽。利用该培养基，愈伤组织诱导和分化一步完成。培养条件：培养温度为(25±1)℃、暗培养。
S3、丛生芽再生
待丛生芽伸长后转入生根培养基MS+0.02mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH，5.8)中进行生根培养。培养温度为(25±1)℃、光照时间为16小时/天，光照强度为25μmol·m-2·s-1。
实施例3
一种粉葛茎尖组织培养快速育苗方法，包括以下步骤：
S1、外植体的准备
在超净工作台上，将粉葛丛生芽转入预处理培养基MS+0.05mg/L 6-BA+0.02mg/LNAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH，5.8)上黑暗培养6天。培养温度为(25±1)℃。然后将暗培养预处理的粉葛组培苗，在体式显微镜下挑取顶端茎尖分生组织，将其纵切，一分为二作为外植体。
S2、愈伤组织诱导和分化
将所述外植体转入诱导分化培养基：MS+1.0mg/L KT+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，(pH，5.8)中，20天后即得丛生芽。利用该培养基，愈伤组织诱导和分化一步完成。培养条件：培养温度为(25±1)℃、暗培养。
S3、丛生芽继代增殖
在无菌条件下，将丛生芽转接到继代增殖培养基MS+0.02mg/L 6-BA+0.02mg/LNAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH，5.8)中进行增殖培养。28d后用相同培养基进行继代培养2次。培养条件：培养温度为(25±1)℃，光照强度为1700lx，光照时间16h·d-1。
S4、丛生芽再生
待丛生芽伸长后转入生根培养基MS+0.02mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH，5.8)中进行生根培养。培养温度为(25±1)℃、光照时间为16小时/天，光照强度为20μmol·m-2·s-1。
对比例
一种粉葛叶片组织培养育苗方法，包括以下步骤：
S1、外植体的准备
在超净工作台上，将粉葛丛生芽转入预处理培养基MS+0.05mg/L 6-BA+0.02mg/LNAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH，5.8)上培养20天后。取幼嫩叶片作为外植体。
S2、愈伤组织诱导
将所述外植体转入愈伤组织诱导培养基在黑暗条件下培养2周，培养温度为25℃；所述愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，还包括以下质量浓度的组分：6-苄氨基嘌呤1.2mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1.6mg/L、蔗糖30.0g/L、琼脂6.0g/L；所述愈伤组织诱导培养基pH为5.8。
S3、愈伤组织分化
将步骤S2诱导得到的愈伤组织切成小块，所取的愈伤组织为结构紧密的的愈伤组织，切成小块后转接至分化培养基中培养，诱导愈伤组织分化得到丛生芽。所述分化培养基以MS为基础培养基，还包括以下质量浓度的组分：6-苄氨基嘌呤2.5mg/L、NAA0.03mg/L、蔗糖30.0g/L、琼脂6.0g/L；所述分化培养基pH为5.8。
S4、丛生芽继代增殖
在无菌条件下，将丛生芽转接到继代增殖培养基MS+0.02mg/L 6-BA+0.02mg/LNAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH，5.8)中进行增殖培养。28d后用相同培养基进行继代培养2次。培养条件：培养温度为(25±1)℃，光照强度为1700lx，光照时间16h·d-1。
S5、丛生芽再生
待丛生芽伸长后转入生根培养基MS+0.02mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂(pH，5.8)中进行生根培养，培养温度为(25±1)℃、光照时间为16小时/天，光照强度为20μmol·m-2·s-1。
实验例
一、验证茎尖不同处理方式对愈伤组织分化率的影响
采用实施例3的方法进行培养，不同的是外植体处理方式不同，并计算愈伤组织分化率，结果见下表1。
表1愈伤组织分化效果对比表
由表1结果可知，将茎尖直接转入诱导分化培养基，愈伤组织分化率仅41.4％，如若将茎尖一切为4，愈伤组织诱导分化率仅32.2％，而如将茎尖一切为2，愈伤组织诱导分化率可达96.8％。
二、验证不同外植体处理粉葛再生技术效果对比
分别采用以下方法培养，并计算愈伤组织分化率和获得再生植株的时间，结果见下表2。
第一组：采用实施例3的方法。
第二组，外植体采用叶片，其余步骤同实施例3。
第三组，外植体采用茎段，其余步骤同实施例3。
第四组，外植体采用带腋芽的嫩茎，其余步骤同实施例3。
第五组：采用对比例的方法。
第六组：以茎段为外植体，培养方法同对比例。
第七组：带腋芽的嫩茎为外植体，培养方法同对比例。
表2愈伤组织分化效果对比表
由表2可知，相对第一组，第二组到第四组实验，如果将外植体材料换为叶片、茎段、带腋芽的嫩茎做为外植体，单一培养基仅诱导产生愈伤组织，愈伤组织不分化，因而愈伤组织分化率为0，无法形成再生植株；相对第一组，第五组到第七组实验，采用常规方法，愈伤组织诱导和分化均需要二步完成，即先诱导愈伤组织诱导，然后再将愈伤组织转入分化培养基诱导分化，才能获得再生植株，且分化率降低，获得再生植株的时间延长。
三、验证不同诱导分化培养基配方再生技术效果对比
采用实施例3的方法进行培养，不同的是诱导分化培养基配方不同，并计算愈伤组织分化率，结果见下表3。
表3愈伤组织分化效果对比表
由表3可以看出，本申请的诱导分化培养基可以更好的催化诱导组织分化，通过特定浓度的植物生长调节剂和生长素作用，能够达到诱导分化一步完成，且分化率达到98.4。第二组和第四组实验，虽然愈伤组织诱导及分化一步完成，但是分化率低，而第三组和第五组实验，仅形成愈伤组织，但愈伤组织不分化。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.一种粉葛茎尖组织培养快速育苗方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.外植体的准备：将粉葛丛生芽转入预处理培养基上黑暗培养5～7天得到粉葛幼苗，培养温度为25±1℃；所述预处理培养基为MS + 0.05 mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA +30.0 g/L蔗糖 + 6.0 g/L琼脂，pH为5.8～6.0；挑取粉葛幼苗的顶端茎尖分生组织，将其纵切，一分为二得到外植体；
S2.愈伤组织诱导和分化：将所述外植体转入诱导分化培养基中进行培养，培养15～25d得丛生芽；
所述诱导分化培养基为：MS + 0.5～1.5mg/L KT+0.2～1.0 mg/L 6-BA + 0.05～0.2mg/L NAA + 25.0～35.0 g/L蔗糖 + 5.0～7. 0 g/L琼脂，pH为5.8～6.0；
S3.丛生芽继代增殖：将所述丛生芽转接到继代增殖培养基中进行增殖培养，25～30d后用相同培养基进行继代培养2-3次；所述继代增殖培养基为：MS + 0.02 mg/L 6-BA +0.02 mg/L NAA + 30.0 g/L蔗糖 + 6.0 g/L琼脂，pH为5.8～6.0；
S4.丛生芽再生：待丛生芽伸长后转入生根培养基中进行生根培养，生根培养基为：MS+ 0.02 mg/L NAA + 30.0 g/L蔗糖 + 6.0 g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
2.根据权利要求1所述的一种粉葛茎尖组织培养快速育苗方法，其特征在于，步骤S2中，培养温度为25±1℃，暗培养。
3.根据权利要求1所述的一种粉葛茎尖组织培养快速育苗方法，其特征在于，步骤S2中，所述诱导分化培养基为：MS + 1.0mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA + 30.0g/L蔗糖 + 6.0 g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
4.根据权利要求1所述的一种粉葛茎尖组织培养快速育苗方法，其特征在于，步骤S3中，培养条件为：培养温度25±1℃，光照强度1500～2000lx，光照时间16 h·d−1。
5.根据权利要求1所述的一种粉葛茎尖组织培养快速育苗方法，其特征在于，步骤S4中，培养温度为25±1℃、光照时间为16h/d，光照强度为18.75~25 μ mol·m−2·s−1。
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