CN102870604A

CN102870604A - 一种解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法

Info

Publication number: CN102870604A
Application number: CN2012103685853A
Authority: CN
Inventors: 杨跃生; 刘颖; 于磊; 金亚红; 郭振飞; 年海
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2013-01-16

Abstract

本发明公开了一种解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法。本发明以无菌萌发的大豆幼苗的下胚轴作为砧木，将经过遗传转化的大豆芽条作为接穗嫁接到砧木上，接穗芽条利用下胚轴下方的胚根而不需要重新形成根系，嫁接时在无菌条件下进行，不需要繁琐的捆绑固定接穗和砧木操作，接穗芽条经过嫁接后能够和砧木愈合成为一棵完整和能够移栽成活的植株，能够正常地生长发育、开花和结实，其嫁接苗成活率为100%，有效解决了大豆转化不定芽条难以生根的技术难题。

Description

一种解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法

技术领域

本发明属于作物遗传育种技术领域，具体涉及一种解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法。

背景技术

大豆(Glycine max L. Merrill)是属于豆科、蝶形花亚科、大豆属的二倍体(2n=40)植物。它起源于中国，后相继传入日本、欧洲、美国等地。它是人类主要植物性蛋白质来源之一，又是重要的家畜饲料和许多工业的原料，在医学上也有很大价值。因而是一种非常重要的农作物。当生物学进入分子生物学时代以后，有关大豆的科学研究也进入快速发展的时期，尤其大豆的基因工程研究工作给生产上带来了巨大的经济效益。

植物遗传转化是一种重要和先进的育种技术，利用遗传转化技术已经培育出了抗除草剂的大豆品种，在几个大豆主产国的生产上得到了大面积的推广。目前，植物遗传转化的技术已经基本成熟，而最为通常的转化是应用农杆菌介导法将外源基因导入到受体植物的细胞并整合到染色体基因组中以实现外源基因稳定的遗传。由于在遗传转化过程中同时还需要应用培养基培养诱导转化的细胞再生成为芽体，而农杆菌在完成转化后不能够从转化系统中被清除掉，因此需要在完成转化后的植物培养基中添加抗生素以抑制农杆菌的增殖，避免转化的细胞由于农杆菌的过旺增殖而腐烂死亡。然而，抗生素除了能够抑制农杆菌的增殖外，在大豆的组织培养系统中，抗生素的添加还严重地抑制了大豆芽条的生根，导致大豆在遗传转化处理后很难得到能够栽培成活的完整植株。大豆芽条在含有抗生素的培养基中难以生根成了大豆遗传转化工作效率很低的一个重要原因。

目前关于大豆嫁接技术的研究仅有极少数报道，申请号为200610017107.2的发明专利“应用嫁接技术提高转基因大豆的遗传转化效率的方法”，通过农杆菌介导大豆子叶节转化系统和胚尖转化系统获得的不定芽，不定芽不经过生根、炼苗过程，直接作成接穗，采用劈接的方法嫁接到大豆实生苗砧木上。该嫁接过程属于常规嫁接（非无菌嫁接）。另外，上述嫁接切口是在砧木子叶节以上的上胚轴。嫁接切口在上胚轴，由于有两片子叶，嫁接操作麻烦；移栽田间后，砧木子叶腋芽会长出第一对侧芽，由于此处具有分化原基，去除侧芽后还会不断再长，因此需经常去侧芽，增加了工作量，并且还会影响接穗的生长和结果。

发明内容

针对现有技术中大豆转化不定芽条生根难、移栽成活率低的不足以及上述现有大豆嫁接技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种大豆不定芽条的无菌嫁接方法，解决了现有技术中导致大豆在遗传转化处理后很难得到能够栽培成活的完整植株的技术难题。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明将无菌萌发的大豆幼苗的下胚轴作为嫁接用的砧木，将经过遗传转化的大豆芽条作为接穗，嫁接到砧木上，接穗芽条利用下胚轴下方的胚根而不需要重新形成根系，嫁接时在无菌条件下进行，不需要繁琐的捆绑固定接穗和砧木操作。接穗芽条经过嫁接后能够和砧木愈合成为一棵完整和能够移栽成活的植株，能够正常地生长发育、开花和结实，其嫁接苗成活率为100 %。

具体地，本发明提供一种解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，包括以下步骤：

（a）将经过常规农杆菌介导的遗传转化处理和筛选的大豆芽条从母体上分割开，作为接穗；

（b）大豆种子经常规方法灭菌后接种到培养基上，25℃黑暗培养，取3~8天龄小苗，在子叶下方5mm处横切，弃除上方的子叶和上胚轴，得到带有胚根的下胚轴，作为砧木；

其中所述培养基为含有0~2mg/L BA（苄氨基腺嘌呤）的 MSB₅培养基，包括MS配方的无机成分+B5配方的有机成分+25 g/L蔗糖+100 mg/L肌醇+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂，pH5.8~6.0。培养基在121 ℃、0.1 MPa的条件下灭菌20分钟；

（c）在无菌条件下，将步骤（a）获得的接穗嫁接到步骤（b）获得的砧木上；

（d）将嫁接有接穗的砧木转移到与步骤（b）相同成分的培养基上，光照培养；

（e）待接穗和砧木接口愈合，接穗芽条有明显的伸长生长后，取出嫁接苗，进行栽种。

在优选的实施方式中，所述步骤（b）中培养基为无激素的MSB₅培养基。

在优选的实施方式中，所述步骤（b）中小苗的苗龄为5天。

在优选的实施方式中，所述步骤（b）横切位置应在子叶下方5mm左右处。

在优选的实施方式中，步骤（c）所述嫁接可以采用插接法或者劈接法：

（c1）插接法：在下胚轴切口中央挖一5毫米深小孔，刮掉芽条的茎基部的表皮，然后插到小孔中完成嫁接；

（c2）劈接法：在砧木形态学上端横切面的中部竖着向下切出深0.5厘米的切口，把芽条基部切成“V”型，小心插入砧木切口中完成嫁接。

本发明的有益效果是：

本发明创造性地设计将无菌萌发的大豆幼苗的下胚轴作为嫁接用的砧木，将经过遗传转化的大豆芽条作为接穗，嫁接到砧木上，通过一种无菌嫁接的方法客服现有技术中大豆转化不定芽条生根难、移栽成活率低的不足。接穗芽条利用下胚轴下方的胚根而不需要重新形成根系，嫁接时在无菌条件下进行，不需要繁琐的捆绑固定接穗和砧木操作。接穗芽条经过嫁接后能够和砧木愈合成为一棵完整和能够移栽成活的植株，能够正常地生长发育、开花和结实，其嫁接苗成活率为100 %，有效解决了现有大豆转化不定芽条难以生根的技术难题，克服了嫁接成活率低的技术缺陷。

附图说明

图1插接法砧木（左）和接穗（右）

图2插接法嫁接完成时的情况

图3劈接法砧木（左）和接穗（右）

图4劈接法嫁接完成时的情况

图5嫁接后开始培养的情况

图6嫁接后培养20天的情况

图7嫁接苗移栽成活的情况

具体实施方式：

下面结合附图和具体实施例以及比较实施例进一步详细说明本发明。

实施例1

（a）用锋利的小刀将经过常规农杆菌介导的遗传转化处理和筛选的大豆芽条从母体上分割开0.7cm，然后再轻轻刮去芽条的茎的基部的表皮，作为接穗，如附图1右；

（b）选取干净饱满的成熟大豆种子，经常规灭菌后接种到不含激素MSB₅的培养基上，25℃黑暗培养，分别取5天龄小苗，在子叶下方5mm处横切，弃除上方的子叶和上胚轴，得到带有胚根的下胚轴，作为砧木，如图1左。所述不含激素MSB₅的培养基组成为MS配方的无机成分+B5配方的有机成分+25 g/L蔗糖+100 mg/L肌醇+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂，pH 6.0；

（c）用合适粗细的针状物（牙签、竹签、针等）垂直插入下胚轴切口中央5 毫米后拔出，然后小心将上述接穗准确稳妥地插入到针状物拔出后产生的小孔中，完成嫁接，见附图2所示；

（d）用镊子夹住已经嫁接有接穗的砧木下胚轴，小心地将胚根朝下转移到不含激素的MSB₅培养基上（同步骤（b）），用镊子夹住下胚轴根茎处往下轻压稍作固定，在光照时间每天12小时的组织培养室内条件下培养；

（e）待接穗和砧木接口愈合，接穗芽条有明显的伸长生长后，即可将嫁接苗取出培养瓶，洗净根上的培养基后，即可栽种到干净的细砂基质中，并在栽种的早期进行常规方法的组培苗保湿。

实施例2

（a）用锋利的小刀将经过常规农杆菌介导的遗传转化处理和筛选的大豆芽条从母体上分割开0.7cm，将芽条基部切成“V”型，作为接穗，如附图3右所示；

（b）选取干净饱满的成熟大豆种子，经常规灭菌后接种到不含激素的MSB₅培养基上，25℃黑暗培养，分别取5天龄小苗，在子叶下方5mm处横切，弃除上方的子叶和上胚轴，得到带有胚根的下胚轴，作为砧木，如附图3左所示；所述不含激素MSB₅的培养基组成为MS配方的无机成分+B5配方的有机成分+25 g/L蔗糖+100 mg/L肌醇+300 mg/L蛋白胨+7 g/L琼脂，pH 6.0；

（c）用解剖刀在砧木形态学上端横切面的中部竖着向下切0.5厘米，再把所述接穗小心插入砧木切口中完成嫁接，如附图4所示；

（d）用镊子夹住已经嫁接有接穗的砧木下胚轴，小心地将胚根朝下转移到不含激素的MSB₅培养基上，用镊子夹住下胚轴根茎处往下轻压稍作固定，在光照时间每天12小时的组织培养室内条件下培养；

下表1给出了实施例1~2两种方法获得的嫁接苗生长情况结果，

表1 插接法和劈接法的嫁接效果比较

嫁接方法	嫁接成活率/%	苗高增加量/cm	根数增加量/条	根长增加量/cm	鲜重增加量/g
						插接法	100	0.80	68	13.77	0.54
劈接法	100	0.73	64.43	11.39	0.46

实施例3

为了比较不同萌发天数所获得的砧木对嫁接苗生长的影响，本实施例分别取3、4、5、8天龄小苗，在子叶下方5mm处横切，弃除上方的子叶和上胚轴，得到带有胚根的下胚轴，作为砧木，其他方法同实施例1。所获得嫁接苗的生长状况见表2。从表2中可以看出，对不同萌发天数所获得的砧木进行嫁接，其嫁接苗成活率均可达100 %。取用萌发5天的砧木用于微嫁接，其根数增加量为68条，明显多于萌发天数为3天的15.67条、4天的26.33条和8天的4条，且差异显著；根长增加量在第5天达最大值，为13.77 cm，显著大于8天的0.43 cm；鲜重增加量也是在第5天达最大值，为0.54 g，显著大于3天的0.14 g和4天的0.32 g

表2 不同萌发天数所获得的砧木对嫁接苗生长的影响

萌发天数/天	成活率/%	根数增加量/条	根长增加量/cm	苗高增加量/cm	鲜重增加量/g
						3	100	15.67	6.70	0.33	0.14
4	100	26.33	8.97	0.37	0.32
						5	100	68.00	13.77	0.80	0.54
8	100	4.00	0.43	0.60	0.44

实施例4

为了比较不同BA浓度的萌发培养条件下所获得的砧木对嫁接苗生长效果的影响，本实施例分别采用0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L的MSB₅培养基萌发大豆种子所获得砧木进行嫁接，其他操作方法同实施例1。所获得嫁接苗的生长状况见表3。从表3中可以看出，用BA浓度为0 mg/L的MSB₅培养基萌发大豆种子所获得砧木进行嫁接，其嫁接苗根数增加量和根长增加量为68条和13.77 cm，均显著多于在BA浓度为1 mg/L萌发条件下的33.33条和4.00 cm与2 mg/L的萌发条件下的24.33条和2.93 cm；试验数据表明，三种萌发条件下所获取的砧木，其嫁接苗的苗高增加量和鲜重增加量虽无显著差异，但都有所增加，嫁接苗都在生长；其嫁接苗成活率均为100 %。试验过程中观察发现，从萌发的BA浓度为1 mg/L和2 mg/L所获得砧木，要比无激素条件下获取的砧木粗壮；且前两者嫁接结合部位形成的愈伤组织，也要比后者的要多；同时培养一段时间后，前两者嫁接苗上的叶片，有一部分小叶片会发黄，甚至脱落，而后者嫁接苗叶片还是鲜绿色；还可以观察到前两者嫁接苗的根，其靠近茎的一端，开始有一段并无不定根的发生，只有在靠近根尖的一端有较少、较短毛发状的侧根发生，而后者从靠近茎的一段开始处就有较多、较长的侧根发生，且其发生部位一直延伸至根尖。

表3 不同BA浓度的萌发条件下所获得的砧木对嫁接苗生长效果的影响

萌发BA浓度（mg/L）	成活率/%	根数增加量/条	根长增加量/cm	苗高增加量/cm	鲜重增加量/g
						0	100	68.00	13.77	0.80	0.54
1	100	33.33	4.00	0.40	0.45
						2	100	24.33	2.93	0.50	0.49

本发明实施例嫁接后开始培养的情况如附图5所示，接穗朝上将胚根插入到无激素的MSB₅培养基中；嫁接后培养20天的情况如附图6所示，这时候接穗已经成活生长，并形成正常的根系，达到可以移栽的状态；嫁接苗移栽成活的情况如附图7所示，移栽成活的嫁接苗能够正常开花。

对比例

本试验将芽条不嫁接而直接接种到含有羧苄青霉素和头孢霉素各200 mg/L的培养基上，定期观察记录生根情况，结果如表4所示。芽条在含有抗生素的培养基中的生根效率极为低下，添加通常条件下有利于生根的NAA对提高大豆芽条的生根率的效果也不够理想。虽然随着时间的延长生根率有所提高，但芽条的生长速度极为缓慢，芽条上的叶片容易发黄甚至脱落，出甁移植后很难复壮，成活率很低。

表4 大豆芽条在含有200 mg/L的羧苄青霉素和头孢霉素的培养基中的生根情况以及NAA的作用

NAA浓度（mg/L）	10天	20天	30天	60天
					0.0	0.07	0.07	0.07	0.13
0.5	0.17	0.17	0.33	0.58

注：表中数据为生根率(%)。

Claims

1.一种解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于包括如下步骤：

（a）将经过常规遗传转化处理和筛选的大豆芽条从母体上分割开，作为接穗；

其中所述培养基为含有0~2mg/L BA的MSB₅培养基；

（d）将嫁接有接穗的砧木转移到与步骤（b）相同组成的培养基上，光照培养；

2.如权利要求1所述的解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于步骤（b）所述MSB₅培养基含有0mg/L 的BA。

3.如权利要求1所述的解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于步骤（b）所述小苗的苗龄为5天。

4.如权利要求1所述的解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于步骤（c）所述嫁接是采用插接法，在下胚轴切口中央挖一小孔，所述小孔深5毫米；刮掉芽条的茎基部的表皮，然后插到小孔中完成嫁接。

5.如权利要求1所述的解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于步骤（c）所述嫁接是采用劈接法，在砧木形态学上端横切面的中部竖着向下切出切口，所述切口深0.5厘米，把芽条基部切成“V”型，插入砧木切口中完成嫁接。