CN103749160A

CN103749160A - 一种解决麻疯树转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法

Info

Publication number: CN103749160A
Application number: CN201410015733.2A
Authority: CN
Inventors: 杨跃生; 刘颖; 刘振兰; 庄楚雄; 李静; 惠文凯; 陈晓阳
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2014-01-14
Filing date: 2014-01-14
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2034-01-14
Also published as: CN103749160B

Abstract

本发明属于作物遗传工程领域。具体涉及一种解决麻疯树转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法。本发明采用无菌微嫁接方法，将经筛选得到的麻疯树阳性再生转化芽条作为接穗，嫁接到作为砧木的带有部分胚根原基的下胚轴上，嫁接后的接穗和砧木愈合程度良好。应用本发明可以很好地解决麻疯树转化再生不定芽条难以生根的问题，对获得更多的麻疯树转化苗并提高其质量具有重要的作用。

Description

一种解决麻疯树转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术和作物遗传育种领域，具体地，涉及一种解决麻疯树转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法。

背景技术

植物遗传转化是一种重要和先进的育种技术。麻疯树由于其种子中含油量较高（40-60%），可以开发为“生物柴油”，因而成为一种非常具有应用前景的能源植物，但其分布区域较窄，种子结实率较低，种子油的质量也还有待于进一步改良，为了扩大麻疯树的种植区域，培育出了高产、优质的麻疯树新品种，可以利用遗传转化技术达到这些目的。目前，植物遗传转化的技术已经基本成熟，而最为通常的转化是应用农杆菌介导法将外源基因导入到受体植物的细胞并整合到染色体基因组中以实现外源基因稳定的遗传。由于在遗传转化过程中同时还需要应用培养基培养诱导转化的细胞再生成为芽体，而农杆菌在完成转化后不能够从转化系统中被清除掉，因此需要在完成转化后的植物培养基中添加抗生素以抑制农杆菌的增殖，避免转化的细胞由于农杆菌的过旺增殖而腐烂死亡。然而，抗生素除了能够抑制农杆菌的增殖外，在麻疯树的组织培养系统中，抗生素的添加还严重地抑制了麻疯树芽条的生根，导致麻疯树外植体在遗传转化处理后很难得到能够栽培成活的完整植株。麻疯树芽条在含有抗生素的培养基中难以生根成了麻疯树遗传转化工作效率很低的一个重要原因。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中麻疯树转化不定芽条生根难、以及现有无菌嫁接技术不成熟的缺陷，提供了一种解决麻疯树转化不定芽条难生根的无菌嫁接方法。

本发明通过以下技术方案予以实现上述目的：

一种解决麻疯树转化不定芽条难生根的无菌嫁接方法，包括如下步骤：

S1.将经过转基因操作和抗性筛选的芽体或由芽体伸长而成的芽条从外植体上切下，作为接穗；

S2.应用无菌萌发的麻疯树幼苗，切除下胚轴顶端及以上部分，利用带有部分胚根原基的下胚轴作为砧木；

S3.在无菌条件下，将S1获得的接穗嫁接到S2获得的砧木上；

S4.将嫁接有接穗的砧木转移到诱导培养基上进行培养；

S5.培养结束后，取出嫁接苗进行洗根和炼苗，然后即可进行常规的栽培管理；

所述诱导培养基包括：0mg/l抗生素、0mg/l硝普钠、0.3mg/l吲哚丁酸、2 mg/l谷氨酰胺、1/2 MS培养基成分。

在解决植物转化不定芽条生根难的技术问题中，无菌嫁接技术开始显示强大的作用。如专利号为201210368585.3的发明专利“一种解决大豆转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法”公开了一种适用于大豆的无菌嫁接方法。理论上，无菌嫁接方法可适用于多种不同植物的生根培养，但是不同植物生长发育的特点不同，决定了其能采用的无菌嫁接技术的具体步骤和细节可能存在差异。本发明的发明人在最初的探索过程中，也试着采用专利号为201210368585.3公开的技术方案进行麻疯树的无菌嫁接，效果很差。最后，发明人通过不断的研究发现：麻疯树无菌嫁接技术的关键点在于接穗和砧木的愈合、以及嫁接苗的生长。发明人通过不断地对比，最终得出了一种最优的诱导培养基，该培养基可以促进接穗和砧木良好的愈合，而且使嫁接苗健康生长，使培育的嫁接苗在株高、芽长、根数、根长都呈现明显的增加。

砧木来源对嫁接苗的生长效果有显著的影响，为了获得优秀的砧木材料，优选地，步骤S2所述无菌萌发的麻疯树幼苗的苗龄为5天。

本发明所述无菌嫁接的方式为插接法，接穗的优选制备方法为：将经过转基因操作和抗性筛选的芽体或由芽体伸长而成的芽条从外植体上切下，将芽体或芽条的切口处部分茎的表皮刮除，使其形态学下端形成楔形切面。

砧木的优选制备方法为：：从幼苗子叶以下5毫米的位置切断，取带有部分胚根原基的下胚轴作为嫁接用的砧木材料，砧木的长度约为1.5厘米。

无菌嫁接的优选方法为：用解剖刀在砧木形态学上端横切面的中部竖着向下切0.5厘米，把接穗小心插入砧木切口中完成嫁接。

在无菌嫁接过程中，要避免接穗与作为砧木的下胚轴根系接触，以免接穗上残留的农杆菌传染到根系，在没有抗生素的培养基上过旺增殖，影响嫁接苗的生长。

S2所述无菌萌发的麻疯树幼苗是用无激素MS培养基培养获得的。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用无菌微嫁接方法，将经筛选得到的麻疯树阳性再生转化芽条作为接穗，嫁接到作为砧木的带有部分胚根原基的下胚轴上，嫁接后的接穗和砧木愈合程度良好。应用本发明可以很好地解决麻疯树转化再生不定芽条难以生根的问题，对获得更多的麻疯树转化苗并提高其质量具有重要的作用。

本发明通过不断的研究发现：麻疯树无菌嫁接技术的关键点在于接穗和砧木的愈合、以及嫁接苗的生长。发明人通过不断地对比，最终得出了一种最优的诱导培养基，该培养基可以促进接穗和砧木良好的愈合，而且使嫁接苗健康生长，使培育的嫁接苗在株高、芽长、根数、根长都呈现明显的增加。

说明书附图

图1.砧木和接穗示意图；A：麻疯树种子萌发培养5天后获取的砧木，从左到右依次是带有完整胚根的砧木、带有部分胚根原基的砧木、完全不带胚根的砧木（bar=1 cm）；B：麻疯树种子萌发培养5天后获取的接穗（bar=0.5 cm）；C：麻疯树种子萌发培养15天后获取的接穗（bar=0.5 cm）。

图2.两种类型接穗的麻疯树无菌嫁接苗生长效果图；A:麻疯树种子无菌萌发培养5天后获取的芽接穗和带有胚根的砧木进行微嫁接后获得的嫁接苗，在未添加抗生素和SNP的MS培养基上培养0 天的效果；B:麻疯树种子无菌萌发培养5天后获取的芽接穗和带有胚根的砧木进行微嫁接后获得的嫁接苗，在未添加抗生素和SNP的MS培养基上培养30天的效果；C:麻疯树种子无菌萌发培养5天后获取带有胚根的砧木和15天后获取的芽条接穗进行微嫁接后获得的嫁接苗，在未添加抗生素和SNP的MS培养基上培养0 天的效果；D:麻疯树种子无菌萌发培养5天后获取带有胚根的砧木和15天后获取的芽条接穗进行微嫁接后获得的嫁接苗，在未添加抗生素和SNP的MS培养基上培养30天的效果（bar=1 cm）。

图3.麻疯树无菌嫁接苗生长发育过程图；A:麻疯树种子萌发培养5天后获取的接穗和带有部分胚根原基砧木进行微嫁接后获得的嫁接苗，在添加0.3 mg/l IBA的1/2 MS培养基上培养0 天的效果；B:麻疯树种子萌发培养5天后获取的接穗和带有部分胚根原基砧木进行微嫁接后获得的嫁接苗，在添加0.3 mg/l IBA的1/2 MS培养基上培养30天的效果（bar=1 cm）。

图4.麻疯树无菌嫁接苗在添加了谷氨酰胺的培养基上的生长效果图；A：麻疯树种子无菌萌发培养5天后获取的芽作为接穗，和带有部分胚根原基的砧木进行微嫁接所得的嫁接苗，将其接种至添加了2 mg/l Gln和0.3 mg/l IBA的1/2 MS培养基上培养30 d的效果；B：麻疯树种子无菌萌发培养15天后获取的芽条作为接穗，和带有部分胚根原基的砧木进行微嫁接所得的嫁接苗，将其接种至添加了2 mg/l Gln和0.3 mg/l IBA的1/2 MS培养基上培养30 d的效果（bar=1 cm）。

图5. 麻疯树转化芽条嫁接苗生长效果图；A：以麻疯树转化芽条为接穗进行微嫁接后获取的嫁接苗，将其接种至添加了2 mg/l Gln和0.3 mg/l IBA的1/2 MS培养基上培养0天的效果；B：以麻疯树转化芽条为接穗进行微嫁接后获取的嫁接苗，将其接种至添加了2 mg/l Gln和0.3 mg/l IBA的1/2 MS培养基上培养30天的效果（bar=1 cm）。

图6.麻疯树无菌嫁接苗驯化移栽后生长效果图；A:麻疯树无菌嫁接苗在培养基质（沙砾：土壤=1:1）中培养20天后的效果；B：嫁接苗移栽到土壤中继续生长的效果（bar=1 cm）。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，实施例中采用的试剂和方法为本领域常规使用的试剂和方法。

实施例1：抗生素对麻疯树嫁接苗生长效果的影响

本次研究通过在培养基中添加抗生素，来探讨抗生素对麻疯树嫁接苗生长发育情况的影响。本试验将嫁接苗接种到不添加抗生素、添加200 mg/l羧苄青霉素或者添加200 mg/l头孢霉素的MS培养基上，培养0天和30天后分别观察记录嫁接苗生长情况，结果如表1所示。

表1 抗生素对嫁接苗生长效果的影响

注：数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（P ≦ 0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。嫁接成活率（%）=（成活的嫁接苗数/总嫁接苗数）× 100%；株高增加量（cm）=嫁接苗株高增加量的平均值；芽长增加量（cm）=嫁接苗接穗长度增加量的平均值；根数增加量(条)=嫁接苗上根数增加量的平均值；根长增加量(cm)= 嫁接苗上根长度增加量的平均值。砧木和接穗均来自麻疯树种子无菌萌发培养5 d后种子苗，砧木带有完整胚根；芽来自麻疯树种子无菌萌发培养5 d后种子苗，去除子叶叶和子叶叶柄，以及下胚轴下端，只保留下胚轴形态学上端一小段为接穗（0.5 cm左右），并将接穗的形态学下端切成楔形。

从表1中的数据可知，嫁接苗在含有抗生素的培养基中的生长状态较差，抗生素对嫁接苗的芽条和根的生长发育有明显的抑制作用。嫁接苗在添加200 mg/l的羧苄青霉素上的生长效果最差，嫁接成活率、株高增加量、芽长增加量、根数增加量和根长增加量都为最小值，分别为69.33%、0.53 cm、0.14 cm、0.21条和0.17 cm；嫁接苗在不添加抗生素的培养基上的生长状态显著优于添加了抗生素实验组的生长状态，嫁接成活率、株高增加量、芽长增加量、根数增加量、根长增加量都为最大值，分别为86.67%、0.74 cm、0.52 cm、0.78条、1.95 cm。因此，嫁接苗适宜在不添加抗生素的培养基上生长。

实施例2不同萌发天数所获得的砧木对嫁接苗生长效果的影响

麻疯树去壳种子经过常规灭菌后，接种至无激素MS培养基上培养5天，15天，30天后分别对种子苗进行切割，从幼苗子叶以下5 mm左右的位置切断，取带有完整胚根的下胚轴作为嫁接用的砧木材料，将接穗嫁接到砧木上，培养0天和30天后分别观察记录嫁接苗生长情况，结果如表2所示。

表2萌发天数对嫁接苗生长发育的影响

注：数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（P ≦ 0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。嫁接成活率（%）=（成活的嫁接苗数/总嫁接苗数）× 100%；株高增加量（cm）=嫁接苗株高增加量的平均值；芽长增加量（cm）=嫁接苗接穗长度增加量的平均值；根数增加量(条)=嫁接苗上根数增加量的平均值；根长增加量(cm)= 嫁接苗上根长度增加量的平均值。接穗：芽来自麻疯树种子无菌萌发培养5 d后种子苗，去除子叶叶和子叶叶柄，以及下胚轴下端，只保留下胚轴形态学上端一小段为接穗（0.5 cm左右），并将接穗的形态学下端切成楔形。砧木带有完整胚根。

从表2中的实验结果可知，来源于不同苗龄种子苗上的砧木对嫁接苗的生长效果有显著的影响。来源于培养5天后的种子苗上所获取的砧木，将其用于微嫁接，获得的嫁接苗的生长效果最佳，嫁接成活率、株高增加量、芽长增加量、根数增加量、根长增加量都为最大值，分别为86.67%、0.74 cm、0.52 cm、0.78条、1.95 cm。随着培养时间的延长，所获得砧木用于微嫁接的效果将变差，选用从培养30天后种子苗上切割获取的砧木，将其用于微嫁接所获得的嫁接苗的生长效果最差，嫁接成活率、株高增加量、芽长增加量、根数增加量、根长增加量都为最小值，分别为32.00%、0.27 cm、0.22 cm、0.14条、0.22 cm。

实施例3 硝普钠（SNP）对麻疯树嫁接苗生长发育的影响

有文献报道表明，SNP对一些植物生根和叶片的生长有一定的促进作用（Han et al, 2009和Xu et al, 2009）。本次实验探讨SNP对麻疯树嫁接苗的生长效果的影响。麻疯树去壳种子经过常规灭菌后，接种至无激素MS培养基上培养5天后，对种子苗进行切割，从幼苗子叶以下5 mm左右的位置切断，取带有胚根的下胚轴作为嫁接用的砧木材料（长度为1.5 cm左右），将两种类型的接穗（芽和芽条）嫁接到砧木上，将嫁接苗接种至添加了0，1，3 mg/l SNP的MS培养基上，培养0天和30天后分别观察记录嫁接苗生长情况，结果如表3所示。

表3 SNP对嫁接苗生长发育的影响

注：数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（P ≦ 0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。差（%）=（株高小于2 cm的嫁接苗的数量/总嫁接苗的数量）×100%；一般（%）=（株高株高大于2 cm小于3 cm的嫁接苗的数量/总嫁接苗的数量）×100%；好（%）=（株高株高大于3 cm的嫁接苗的数量/总嫁接苗的数量）×100%。接穗：芽来自麻疯树种子无菌萌发培养5 d后种子苗，去除子叶叶和子叶叶柄，以及下胚轴下端，只保留下胚轴形态学上端一小段为接穗（0.5 cm左右），并将接穗的形态学下端切成楔形；芽条来自麻疯树种子无菌萌发培养15 d后种子苗，去除子叶叶和子叶叶柄，以及下胚轴下端，只保留第一颗顶芽和下胚轴形态学上端一小段为接穗，并将接穗的形态学下端切成楔形。砧木带有胚根。

从表3中的数据可知，SNP对嫁接苗的生长发育有一定的抑制作用，不添加SNP的实验组的嫁接苗生长效果最佳，其中属于“好”这一级别的嫁接苗的数量最多，最高可达占总嫁接苗数中的41.33%，属于“一般”这一级别的嫁接苗数占总嫁接苗数中的38.33%，属于“差”这一级别的嫁接苗数占总嫁接苗数中的20.33%；而添加了3 mg/l SNP中的嫁接苗生长效果最差，其中属于“好”这一级别的嫁接苗的数量最低仅占总嫁接苗数中的24.27%，属于“一般”这一级别的嫁接苗数占总嫁接苗数中的37.23%，属于“差”这一级别的嫁接苗数占总嫁接苗数中的38.50%。两种类型接穗的嫁接苗在添加了不同浓度的SNP的培养基中，均可生长，在不添加SNP的实验组的嫁接苗生长效果最佳，其中属于“好”这一级别的嫁接苗的数量最多，其中接穗为芽的嫁接苗最高可达占总嫁接苗数中的41.33%，接穗为芽条的嫁接苗最高可达占总嫁接苗数中的35.71%，但是两者没有显著差异，因此接穗类型对嫁接苗的生长效果没有显著的影响。

实施例4：不同类型的基本培养基对麻疯树嫁接苗生长的影响

本次实验探讨基本培养基对麻疯树嫁接苗的生长效果的影响。麻疯树去壳种子经过常规灭菌后，接种至无激素MS培养基上培养5天后，对种子苗进行切割，从幼苗子叶以下5 mm左右的位置切断，取带有完整胚根的下胚轴作为嫁接用的砧木材料（长度为1.5 cm左右），将接穗嫁接到砧木上，将嫁接苗接种至MS，B5，1/2MS三种基本培养基上，培养0天和30天后分别观察记录嫁接苗生长情况，结果如表4所示。

表4 基本培养基对嫁接苗生长发育的影响

从表4中的数据可知，基本培养的类型对嫁接苗的生长发育有显著的影响。在MS，B5，1/2MS三种培养基中，嫁接苗都可以成活，成活率为84.00-86.67%；但是嫁接苗在1/2MS培养基中的株高增加量、芽长增加量、根数增加量、根长增加量都为最大值，分别为0.86 cm、0.67 cm、1.08条、2.08 cm；嫁接苗在B5培养基上的生长状态最差，株高增加量、芽长增加量、根数增加量、根长增加量都为最小值，分别为0.61 cm、0.47 cm、0.54条、1.59 cm。因此，适合嫁接苗生长的基本培养基为1/2MS培养基。

实施例5：不同类型的砧木对麻疯树嫁接苗生长发育的影响

本次实验探讨不同类型的砧木对麻疯树嫁接苗的生长效果的影响。麻疯树去壳种子经过常规灭菌后，接种至无激素MS培养基上培养5天后，对种子苗进行切割，从幼苗子叶以下5 mm左右的位置切断，取三种类型的砧木（带有完整胚根的下胚轴切段，只带有部分胚根原基的下胚轴切段，完全不带胚根的下胚轴切段）作为嫁接用的砧木材料（长度为1.5 cm左右），将接穗嫁接到砧木上，将嫁接苗接种至1/2MS基本培养基上，培养0天和30天后分别观察记录嫁接苗生长情况，结果如表5所示。

表5 砧木类型对嫁接苗生长效果的影响

注：数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（P ≦ 0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。嫁接成活率（%）=（成活的嫁接苗数/总嫁接苗数）× 100%；株高增加量（cm）=嫁接苗株高增加量的平均值；平芽长增加量（cm）=嫁接苗接穗长度增加量的平均值；根数增加量(条)=嫁接苗上根数增加量的平均值；根长增加量(cm)= 嫁接苗上根长度增加量的平均值。接穗：芽来自麻疯树种子无菌萌发培养5 d后种子苗，去除子叶叶和子叶叶柄，以及下胚轴下端，只保留下胚轴形态学上端一小段为接穗（0.5 cm左右），并将接穗的形态学下端切成楔形。

从表5中的数据可知，不同类型的砧木对嫁接苗的生长效果有显著的影响。三种类型砧木中，带有部分胚根原基的砧木所获得嫁接苗的生长发育状态最佳，株高增加量、芽长增加量、根数增加量、根长增加量都为最大值，分别为0.92 cm、0.74 cm、1.74条、2.54 cm；而完全不带胚根的砧木所获得嫁接苗的生长发育状态最差，株高增加量、芽长增加量、根数增加量、根长增加量都为最小值，分别为0.66 cm、0.38 cm、1.36条、1.73 cm。因此，以带有部分胚根原基的下胚轴切段为砧木所获得的嫁接苗的生长效果最好。

实施例6：吲哚丁酸（IBA）对麻疯树嫁接苗生长发育的影响

本次实验探讨在培养基中添加不同浓度的IBA对麻疯树嫁接苗的生长效果的影响。麻疯树去壳种子经过常规灭菌后，接种至无激素MS培养基上培养5天后，对种子苗进行切割，从幼苗子叶以下5 mm左右的位置切断，取砧木（带有部分胚根原基的下胚轴切段）作为嫁接用的砧木材料（长度为1.5 cm左右），将接穗嫁接到砧木上，将嫁接苗接种至添加不同浓度的IBA的1/2MS培养基上，培养0天和30天后分别观察记录嫁接苗生长发育状况，结果如表6所示。

表6 IBA对嫁接苗生长效果的影响

注：数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（P ≦ 0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。嫁接成活率（%）=（成活的嫁接苗数/总嫁接苗数）× 100%；株高增加量（cm）=嫁接苗株高增加量的平均值；芽长增加量（cm）=嫁接苗接穗长度增加量的平均值；根数增加量(条)=嫁接苗上根数增加量的平均值；根长增加量(cm)= 嫁接苗上根长度增加量的平均值。移栽成活率（%）=（将嫁接苗从培养瓶中移栽到土壤中后成活的数量/总嫁接苗数）× 100%；接穗：芽来自麻疯树种子无菌萌发培养5 d后种子苗，去除子叶叶和子叶叶柄，以及下胚轴下端，只保留下胚轴形态学上端一小段为接穗（0.5 cm左右），并将接穗的形态学下端切成楔形。砧木带有部分胚根原基。

从表5中的数据可知，不同浓度的IBA对嫁接苗的生长效果有显著的影响。随着培养基中添加的IBA的浓度的增加，嫁接苗的生长状态也越来越好，到3 mg/l时，嫁接苗的生长发育情况最佳，株高增加量（1.54 cm）、芽长增加量（1.27 cm）、根数增加量（5.83条）和根长增加量（3.23cm）都为最大值，嫁接苗的移栽成活率也为最大值（70.58%）；继续增加IBA的浓度，嫁接苗的生长状态将会变差，当增加IBA浓度到1 mg/l时，嫁接苗的生长效果最差，不仅株高增加量（0.66 cm）、芽长增加量（0.53 cm）、根数增加量（1.07条）、根长增加量（1.26 cm）都为最小值，嫁接苗的移栽成活率也为最小值（42.78%）。因此，适宜在生根培养基中添加的IBA的浓度为0.3 mg/l。

实施例7：谷氨酰胺（Gln）对麻疯树嫁接苗生长发育的影响

本次实验探讨在培养基中添加Gln对麻疯树嫁接苗的生长效果的影响。麻疯树去壳种子经过常规灭菌后，接种至无激素MS培养基上培养5天后，对种子苗进行切割，从幼苗子叶以下5 mm左右的位置切断，取砧木（带有部分根原基的下胚轴切段）作为嫁接用的砧木材料（长度为1.5 cm左右），将两种类型的接穗嫁接到砧木上，将嫁接苗接种至添加0.3 mg/l IBA和不同浓度Gln（0，2 mg/l）的1/2MS培养基上，培养0天和30天后分别观察记录嫁接苗生长发育状况，结果如表7所示。

表7 谷氨酰胺（Gln）对嫁接苗生长发育的影响

注：数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（P ≦ 0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。嫁接成活率（%）=（成活的嫁接苗数/总嫁接苗数）× 100%；株高增加量（cm）=嫁接苗株高增加量的平均值；芽长增加量（cm）=嫁接苗接穗长度增加量的平均值；根数增加量(条)=嫁接苗上根数增加量的平均值；根长增加量(cm)= 嫁接苗上根长度增加量的平均值。移栽成活率（%）=（将嫁接苗从培养瓶中移栽到土壤中后成活的数量/总嫁接苗数）× 100%；接穗：芽来自麻疯树种子无菌萌发培养5 d后种子苗，去除子叶叶和子叶叶柄，以及下胚轴下端，只保留下胚轴形态学上端一小段为接穗（0.5 cm左右），并将接穗的形态学下端切成楔形；芽条来自麻疯树种子无菌萌发培养15 d后种子苗，去除子叶叶和子叶叶柄，以及下胚轴下端，只保留第一颗顶芽和下胚轴形态学上端一小段为接穗（0.5 cm左右），并将接穗的形态学下端切成楔形。

从表7中的数据可知，Gln对嫁接苗的生长效果有显著的影响。在培养基中添加2 mg/l Gln后，嫁接苗的生长发育效果显著优于未添加Gln的实验组的效果，不仅株高增加量（1.86 cm）、芽长增加量（1.48 cm）、根数增加量（8.13条）、根长增加量（3.72 cm）显著大于未添加Gln实验组的结果，嫁接苗的移栽成活率也为最大值（76.40%），显著大于未添加Gln实验组的结果。因此，在生根培养基中适宜添加2 mg/l Gln。另外，两种接穗类型的嫁接苗均可正常发育生长，在同等实验条件下，5 d苗龄接穗嫁接苗的生长效果与15 d苗龄接穗嫁接苗的生长效果相比，各项测量数据之间没有显著性差异。

Claims

1.一种解决麻疯树转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于包括如下步骤：

S3.在无菌条件下，将S1获得的接穗嫁接到S2获得的砧木上；

S4.将嫁接有接穗的砧木转移到诱导培养基上进行培养；

2.根据权利要求1所述的解决麻疯树转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于，S2所述无菌萌发的麻疯树幼苗的苗龄为5天。

3.根据权利要求1所述的解决麻疯树转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于，S1所述接穗的制备为：将经过转基因操作和抗性筛选的芽体或由芽体伸长而成的芽条从外植体上切下，将芽体或芽条的切口处部分茎的表皮刮除，使其形态学下端形成楔形切面。

4.根据权利要求1所述的解决麻疯树转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于，S2所述砧木的制备过程为：从幼苗子叶以下5毫米的位置切断，取带有部分胚根原基的下胚轴作为嫁接用的砧木材料，砧木的长度为1.5厘米。

5.根据权利要求1所述的解决麻疯树转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于，S4所述嫁接步骤为：用解剖刀在砧木形态学上端横切面的中部竖着向下切0.5厘米，把接穗小心插入砧木切口中完成嫁接。

6.根据权利要求1所述的解决麻疯树转化不定芽条难以生根的无菌嫁接方法，其特征在于，S2所述无菌萌发的麻疯树幼苗是用无激素MS培养基培养获得的。