CN102047842A - 一种采用西瓜子叶节直接再生植株的方法 - Google Patents

一种采用西瓜子叶节直接再生植株的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102047842A
CN102047842A CN2009100731699A CN200910073169A CN102047842A CN 102047842 A CN102047842 A CN 102047842A CN 2009100731699 A CN2009100731699 A CN 2009100731699A CN 200910073169 A CN200910073169 A CN 200910073169A CN 102047842 A CN102047842 A CN 102047842A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bud
watermelon
indefinite bud
cultivation
cotyledon
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009100731699A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102047842B (zh
Inventor
刘宏宇
陈磊
怀凤涛
秦智伟
周秀艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northeast Agricultural University
Original Assignee
Northeast Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northeast Agricultural University filed Critical Northeast Agricultural University
Priority to CN2009100731699A priority Critical patent/CN102047842B/zh
Publication of CN102047842A publication Critical patent/CN102047842A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102047842B publication Critical patent/CN102047842B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Abstract

本发明公开了一种通过西瓜子叶节离体培养直接再生植株的方法，属于生物技术领域。包括以下步骤：(1)采用西瓜品种傲龙早蜜龙的种子为材料培育无菌苗。(2)在生长点下3-4mm处切去下胚轴，纵向切开胚轴，刮除顶芽、然后切除2/3子叶，获得西瓜子叶节。(3)将子叶节种于不定芽诱导培养基Ms5上，经过14d的培养，出现不定芽；继续培养20-25d，即可获得0.5-1.0cm不定芽。(4)将不定芽移入伸长培养基中继续培养25～30d，不定芽可长到3-4cm。(5)将获得的不定芽移入生根培养基，获得再生植株。通过本发明的实施，可以直接获得完整的西瓜再生植株，为西瓜的基因工程提供的培养技术。

Description

一种采用西瓜子叶节直接再生植株的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域。是一种以西瓜子叶节为外植体直接进行西瓜植株再生的方法。
技术背景
西瓜(Citrullus lanatus)是一种重要的蔬菜作物，其果实汁多味甜，富含番茄素和维生素。据联合国粮农组织(FAO)2002年统计，西瓜在世界10大果品中居第5位。在春节早熟栽培时，西瓜容易遭受冷害、病害等各种不利因素的影响，导致其产量和品质的降低。随着人民生活水平的提高，人们对西瓜种类和品质的要求越来越高，希望一年四季不断有高品质、不同品种的西瓜产品上市。通过离体培养、遗传转化和体细胞无性系突变体筛选获得多抗、高品质的西瓜品种已成为重要的育种手段之一。西瓜离体培养已经有几十年的历史，并且从茎尖培养、不定芽诱导和体细胞胚胎发生等各种途径对西瓜离体培养进行了研究。
国内外研究人员以西瓜的茎尖、幼胚、子叶和胚轴等多种类型的外植体，采用不同浓度的植物生长调节物质的配比，建立了西瓜的器官发生再生系统。不同的外植体再生频率差异较大，其中以子叶的再生频率较高，是进行西瓜植株再生培养最有效的途径和方法。目前，已有很多关于西瓜子叶再生植株的报道，但以西瓜子叶节为外植体直接诱导不定芽进行西瓜植株再生的方法还未见报道。同时，在组织培养过程中，对种子消毒、器官发生过程中各种培养基的应用还比较混乱，对植株再生频率也产生了很大的影响。无菌苗的获得离不开有效的种子消毒方法，常用的消毒剂有次氯酸钠、过氧化氢和升汞等，在西瓜组织培养中以应用升汞和次氯酸钠居多。在组织培养过程中，尤其重要的是培养基的选择及其激素的添加，这对外植体不定芽的诱导、伸长和生根都有重要的影响，是决定外植体器官发生和植株再生的关键环节。因此，要建立简便、高效的西瓜子叶节直接再生系统，必须在相应培养基中添加必要的生长激素，并确定合理添加浓度。
为此，我们针对上述问题，提供一种利用西瓜子叶节直接再生植株的方法，使其建立一个简便、高效的繁殖体系，阵低成本，达到获得优良种苗的目的，也为西瓜转基因研究提供一种新技术手段。
参考文献
1.京欣一号西瓜子叶组织培养的研究.王春霞，简志英，刘愚，邹琦.园艺学报.1996，23(4)：401-403
2.西瓜组织培养的研究与应用.任春梅，董延瑜.长江蔬菜，2001，(12)：30-32.
3.西瓜高频再生系统的研究.张志忠，吴著华，吕柳新.中国农学通报，2004，20(2)：151-153.
4.西瓜子叶组织培养及植株再生的研究.常尚连，张立宾，于德花，徐化凌.湖北农业科学.2009，48(3)：533-535.
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供了一种西瓜子叶节直接再生植株的方法。本发明是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤：
(1)无菌苗的培育。
挑选成熟饱满的西瓜品种傲龙早蜜龙的种子，用1％H2O2浸泡7-8hr后，去除种皮，在超净工作台上，先75％的酒精消毒60s，用无菌水冲洗2-3次，再用15％NaClO消毒15min，无菌水冲洗4-5次，接到萌发培养基上，萌发培养基为0.8％琼脂。接种后，置于28±2℃连续黑暗条件下，培养3d，再置于培养温度为26±2℃，16hr、3000Lux光照条件下培养2-3d。
(2)子叶节的获得。
播种后5-6d，当无菌苗子叶由黄转呈浅绿色时，在生长点下3-4mm处切去下胚轴，然后纵向切开胚轴，刮除顶芽、再切除2/3子叶，获得西瓜子叶节。
(3)不定芽的诱导。
诱导培养基Ms5是按照每升MS基本培养基加入30g蔗糖、8g琼脂、5.0mgAgNO3、1.0mg6-BA和0.1mg IBA配制而成，并用0.1M的KOH溶液将pH调整为5.8。
将子叶节(子叶的近轴面朝上)接种于不定芽诱导培养基Ms5上，在温度为26±2℃，16hr、3000Lux光照条件下培养，14d后出现不定芽。不定芽出现后，再经过20-25d的培养，即可获得0.5-1.0cm不定芽。每2周更换一次培养基。
(4)不定芽的伸长
伸长培养基是按照每升MS基本培养基加入30g蔗糖、8g琼脂、0.2mg KT配制而成，并用0.1M的KOH溶液将pH调整为5.8。
将0.5-1cm不定芽移入伸长培养基中继续培养。经过25-30d培养后，不定芽可长到3-4cm。每2周更换一次培养基。
(5)生根培养。
将3-4cm的不定芽移入生根培养基中。培养10-14d即可生根。
生根培养基是按照每升MS基本培养基加入30g蔗糖、8g琼脂和0.5mg NAA配制而成，并用0.1M的KOH溶液将pH调整为5.8。
(6)再生植株的驯化。
当再生植株根长至2cm左右时，揭去封口膜，使无菌苗适应有菌的外界环境，2-3d后向培养瓶中注入清水，用镊子将生根苗取出，流动水冲洗净根部培养基，移栽于灭菌的营养土中，并用透明的塑料薄膜覆盖保湿，放在培养室中。2周左右揭去薄膜并进行炼苗，4周后即可与实生苗长势相同。西瓜再生苗在东北农业大学园艺试验站进行种植，结果表明：西瓜再生苗与实生苗长势相同。
本发明在研究过程中，具体考虑了以下几种因素在本发明中所起的作用：
(1)种子处理对西瓜无菌苗的影响
无菌萌发是植物组织培养中最基础的一环，对发芽率和以后不定芽的分化有着直接的影响。用1％H2O2浸泡西瓜种子7-8h，能明显提高发芽率，而且无菌苗整齐度高，长势好，有利于再生出不定芽(见表1)。
表1  不同处理方式对西瓜种子萌发的影响
Figure B2009100731699D0000021
(2)不同激素配比对不定芽的诱导和植株再生的影响
在每升MS基本培养基中加入30g蔗糖、8g琼脂和5.0mg AgNO3的基础上，添加不同配比的激素，并调节pH到5.8，制成相应的不定芽诱导培养基。具体见表2。
表2  不同芽诱导培养基的激素配比及诱导效率
Figure B2009100731699D0000031
将西瓜品种傲龙早蜜龙的子叶节接种于不同激素配比的不定芽诱导培养基上，在培养温度为26±2℃，16hr、3000Lux光照条件下，诱导不定芽。
结果表明：采用Ms5培养基(每升MS基本培养基中加入30g蔗糖、8g琼脂及5.0mg AgNO3基础上，再添加1.0mg 6-BA和0.1mg IBA)诱导西瓜不定芽的效果最好，不仅诱导效率高，而且质量好，因次，确定Ms5培养基为不定芽诱导的最适培养基。
具体实施方式
结合本发明的内容提供以下实施例，具体实施如下：
(1)无菌苗的培育。
挑选成熟饱满的西瓜品种傲龙早蜜龙的种子，用1％H2O2浸泡7-8hr后，去除种皮，在超净工作台上，先75％的酒精消毒60s，用无菌水冲洗2-3次，再用15％NaClO消毒15min，无菌水冲洗4-5次，接到萌发培养基上，萌发培养基为0.8％琼脂。接种后，置于28±2℃连续黑暗条件下，培养3d，再置于培养温度为26±2℃，16hr、3000Lux光照条件下培养2-3d。
(2)子叶节的获得。
播种后5-6d，当无菌苗子叶由黄转呈浅绿色时，在生长点下3-4mm处切去下胚轴，然后纵向切开胚轴，刮除顶芽、再切除2/3子叶，获得西瓜子叶节。
(3)不定芽的诱导。
按每升MS基本培养基中加入30g蔗糖、8g琼脂、5.0mg AgNO3、1.0mg 6-BA和0.1mg IBA配制成不定芽诱导培养基，并用0.1M的KOH溶液将pH调整为5.8。
将子叶节(子叶的近轴面朝上)接种于不定芽诱导培养基上，在温度为26±2℃，16hr、3000Lux光照条件下培养，14d后出现不定芽。不定芽出现后，再经过20-25d的培养，即可获得0.5-1.0cm不定芽。每2周更换一次培养基。
(4)不定芽的伸长
将0.5-1cm不定芽移入伸长培养基(按照每升MS基本培养基加入30g蔗糖、8g琼脂、0.2mg KT配制而成，并用0.1M的KOH溶液将pH调整为5.8。)中继续培养。经过25-30d培养后，不定芽可长到3-4cm。每2周更换一次培养基。
(5)生根培养。
将3-4cm的不定芽移入生根培养基(按照每升MS基本培养基加入30g蔗糖、8g琼脂和0.5mg NAA配制而成，并用0.1M的KOH溶液将pH调整为5.8)中。培养10-14d即可生根。
(6)再生植株的驯化。
当再生植株根长至2cm左右时，揭去封口膜，使无菌苗适应有菌的外界环境，2-3d后向培养瓶中注入清水，用镊子将生根苗取出，流动水冲洗净根部培养基，移栽于灭菌的营养土中，并用透明的塑料薄膜覆盖保湿，放在培养室中。2周左右揭去薄膜并进行炼苗，4周后即可与实生苗长势相同。西瓜再生苗在东北农业大学园艺试验站进行种植，结果表明：西瓜再生苗与实生苗长势相同。

Claims (4)

1.一种采用西瓜子叶节为外植体直接进行西瓜植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)无菌苗的培育。
挑选成熟饱满的西瓜种子，用1％H2O2浸泡7-8h后，去除种皮，先75％的酒精消毒60s，用无菌水冲洗2-3次，再用15％NaClO消毒15min，无菌水冲洗4-5次，接到萌发培养基上，萌发培养基为0.8％琼脂。接种后，置于28±2℃连续黑暗条件下培养3d，再置于培养温度为26±2℃，16hr、3000Lux光照条件下培养2-3d。
(2)子叶节的获得。
播种后5-6d，当无菌苗子叶由黄转呈浅绿色时，在生长点下3-4mm处切去下胚轴，纵向切开胚轴，刮除顶芽、然后切除2/3子叶，获得西瓜子叶节。
(3)不定芽的诱导。
将子叶节接种于不定芽诱导培养基Ms5上，在温度为26±2℃，16hr、3000Lux光照条件下培养14d后可出现不定芽。不定芽出现后，再经过20-25d的培养，即可获得0.5-1.0cm不定芽。每2周更换一次培养基。
所述的诱导培养基Ms5是按照每升MS基本培养基加入30g蔗糖、8g琼脂、5.0mgAgNO3、1.0mg 6-BA和0.1mg IBA配制而成，并用0.1M的KOH溶液将pH调整为5.8。
(4)不定芽的伸长
将0.5-1cm不定芽移入伸长培养基中继续培养。经过25-30d培养后，不定芽可长到3-4cm。每2周更换一次培养基。
所述的伸长培养基是按照每升MS基本培养基加入30g蔗糖、8g琼脂、0.2mg KT配制而成，并用0.1M的KOH溶液将pH调整为5.8。
(5)生根培养。
将3-4cm的不定芽移入生根培养基中。培养10-14d即可生根。
所述的生根培养基是按照每升MS基本培养基加入30g蔗糖、8g琼脂和0.5mg NAA配制而成，并用0.1M的KOH溶液将pH调整为5.8。
(6)再生植株的驯化。
当再生植株根长至2cm左右时，揭去封口膜，进行驯化，2的后，用镊子将生根苗取出，移栽于灭菌的营养土中，并用透明的塑料薄膜覆盖保湿，放在培养室中。
2.根据权利要求1所述的西瓜子叶节直接再生植株的方法，其特征是所述无菌苗培育的步骤为：
挑选成熟饱满的西瓜种子，用1％H2O2浸泡7-8hr后，去除种皮，先75％的酒精消毒60，用无菌水冲洗2-3次，再用15％NaClO消毒15min，无菌水冲洗4～5次，接到萌发培养基上，萌发培养基为0.8％琼脂。接种后，置于28±2℃连续黑暗条件下培养3d，再置于培养温度为26±2℃，16hr、3000Lux光照培养2-3d。
3.根据权利要求1所述的西瓜子叶节直接再生植株的方法，其特征是所述子叶节获得的步骤为：
播种后5-6d，当无菌苗子叶由黄转呈浅绿色时，在生长点下3-4mm处切去下胚轴，纵向切开胚轴，刮除顶芽、然后切除2/3子叶，获得西瓜子叶节。
4.根据权利要求1所述的西瓜子叶节直接再生植株的方法，其特征是所述不定芽诱导的步骤为：
将子叶节接种于不定芽诱导培养基Ms5上，在温度为26±2℃，16hr、3000Lux光照条件下培养，14d后可出现不定芽。不定芽出现后，再经过20-25d的培养，即可获得0.5-1.0cm不定芽。每2两周更换一次培养基。
所述的诱导培养基Ms5是按照每升MS基本培养基加入30g蔗糖、8g琼脂、5.0mg AgNO3、1.0mg 6-BA和0.1mg IBA配制而成，并用0.1M的KOH溶液将pH调整为5.8。
CN2009100731699A 2009-11-10 2009-11-10 一种采用西瓜子叶节直接再生植株的方法 Expired - Fee Related CN102047842B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009100731699A CN102047842B (zh) 2009-11-10 2009-11-10 一种采用西瓜子叶节直接再生植株的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009100731699A CN102047842B (zh) 2009-11-10 2009-11-10 一种采用西瓜子叶节直接再生植株的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102047842A true CN102047842A (zh) 2011-05-11
CN102047842B CN102047842B (zh) 2012-07-25

Family

ID=43952913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009100731699A Expired - Fee Related CN102047842B (zh) 2009-11-10 2009-11-10 一种采用西瓜子叶节直接再生植株的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102047842B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104304032A (zh) * 2014-11-07 2015-01-28 四川农业大学 适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法
CN104871972A (zh) * 2015-05-18 2015-09-02 浙江省农业科学院 有效控制西瓜不定芽水渍化现象发生的高频再生体系建立方法
CN104885938A (zh) * 2015-05-25 2015-09-09 北京林业大学 一种快速获得日本结缕草组培苗的方法
CN107173231A (zh) * 2017-07-03 2017-09-19 甘肃省科学院生物研究所 一种珍稀濒危植物蒙古沙冬青离体快繁的方法
CN108849518A (zh) * 2018-08-01 2018-11-23 谢章春 一种西瓜苗组培方法
CN109136259A (zh) * 2018-10-09 2019-01-04 北京市农林科学院 一种西瓜高效遗传转化及转基因植株鉴定方法
CN109997690A (zh) * 2018-11-15 2019-07-12 齐齐哈尔大学 一种提高西瓜组培苗移栽成活率的方法
CN114431150A (zh) * 2022-03-07 2022-05-06 福建农林大学 一种以子叶节为外植体的黄麻组织培养方法
CN115119749A (zh) * 2022-07-15 2022-09-30 宁夏大学 番茄幼胚的离体培养方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100366145C (zh) * 2006-02-24 2008-02-06 浙江大学 西瓜子叶离体培养间接再生植株的方法

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104304032A (zh) * 2014-11-07 2015-01-28 四川农业大学 适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法
CN104304032B (zh) * 2014-11-07 2016-07-13 四川农业大学 适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法
CN104871972A (zh) * 2015-05-18 2015-09-02 浙江省农业科学院 有效控制西瓜不定芽水渍化现象发生的高频再生体系建立方法
CN104885938A (zh) * 2015-05-25 2015-09-09 北京林业大学 一种快速获得日本结缕草组培苗的方法
CN107173231A (zh) * 2017-07-03 2017-09-19 甘肃省科学院生物研究所 一种珍稀濒危植物蒙古沙冬青离体快繁的方法
CN108849518A (zh) * 2018-08-01 2018-11-23 谢章春 一种西瓜苗组培方法
CN109136259A (zh) * 2018-10-09 2019-01-04 北京市农林科学院 一种西瓜高效遗传转化及转基因植株鉴定方法
CN109997690A (zh) * 2018-11-15 2019-07-12 齐齐哈尔大学 一种提高西瓜组培苗移栽成活率的方法
CN114431150A (zh) * 2022-03-07 2022-05-06 福建农林大学 一种以子叶节为外植体的黄麻组织培养方法
CN115119749A (zh) * 2022-07-15 2022-09-30 宁夏大学 番茄幼胚的离体培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN102047842B (zh) 2012-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102047842B (zh) 一种采用西瓜子叶节直接再生植株的方法
CN105815213A (zh) 一种猕猴桃离体再生体系的建立方法
CN103190347B (zh) 一种茶壶枣组织培养方法
CN107155898A (zh) 一种铁皮石斛利用茎段薄片进行扩繁的方法
CN103385173B (zh) 一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法
CN103070078A (zh) 一种利用芋头茎尖进行组织培养的快繁方法
CN106538382B (zh) 一种以幼穗为外植体建立假俭草高效再生体系的方法
CN101897297B (zh) 一种萱草组织培养两步成苗的快繁方法
CN106106178B (zh) 一种糖果鸢尾的组织培养方法
CN101695280B (zh) 红树莓的组织培养与快速繁殖方法
CN104719158A (zh) 一种以种子为外植体的快速建立中型狼尾草组织培养再生体系的方法
CN100394845C (zh) 东方百合脱毒小籽球的瓶内生成方法
CN104322370A (zh) 一种苦瓜离体快速繁殖的方法
CN101574058A (zh) 麻疯树微苗组培快速繁殖及生根的方法
CN106665367B (zh) 一种黄花风铃木组织培养快速繁殖方法
CN100998318B (zh) 一种高效优质南瓜离体快速繁殖的方法
CN104285816A (zh) 一种文冠果的组织培养快繁方法
CN104429940A (zh) 一种获得草莓脱毒苗的方法
CN105265310A (zh) 一种通过组织培养繁育树莓苗的方法
CN110771512B (zh) 一种溪荪愈伤组织的高效诱导方法
CN104255532B (zh) 一种养心菜的组织培养一步成苗快速繁殖方法
CN107667858A (zh) 一种土人参离体组培快繁方法
CN114586684A (zh) 一种三倍体桉树新品种“京桂一号桉”的组培快繁方法
CN102934613A (zh) 利用60Co r射线辐射诱变红叶石楠体细胞育种的方法
CN103125384A (zh) 南海杜鹃的组织培养与快速繁殖方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120725

Termination date: 20141110

EXPY Termination of patent right or utility model