CN104885938A - 一种快速获得日本结缕草组培苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明具体提供一种快速获得日本结缕草组培苗的方法，包括如下步骤：1)灭菌种子浸种3天；2)浸种后的种子吹干，以水培养至萌发出1-2mm的芽；3)萌芽后的种子接种到固体MS培养基上，培养至幼苗地上部高3cm，此时幼苗叶鞘底部出现表面粗糙的节点；4)剥去种皮，去除节点上方的茎叶，将余下的植株以ZJ-SM培养基培养至茎端长出芽；5)去除茎端长出的芽，放回ZJ-SM培养基上继续培养至根端长出芽；6)将根端长出的芽切下放到固体1/2MS培养基上培养至长出根，得到完整的植株；7)将完整的植株炼苗后移植，得到组培苗。相比于愈伤组织再生体系的方法，本发明将4个月缩到了50天，大大缩短了日本结缕草的繁殖周期。

Description

一种快速获得日本结缕草组培苗的方法

技术领域

本发明属于植物的组织培养领域，具体涉及一种快速获得日本结缕草组培苗的方法。

背景技术

结缕草为多年生草本植物，隶属于禾本科虎耳草亚科。一般认为有11个种及部分变种，而作为草坪草种质资源被研究利用的有5个种。其中的日本结缕草是重要的草坪草，它很多的优良特性，如适应性广、抗旱性强、耐磨耐践踏、耐热耐盐碱等，使得它被广泛运用于城市运动场、城市绿化、公路护坡及水土保持。

然而绿色期短的缺点限制了日本结缕草进一步的扩大应用。并且结缕草为四倍体植株，授粉方式为雌雄同株异花型。传统育种的方式很难改良绿色期短的性状，并且也难于获得品系较纯，遗传背景一直的日本结缕草种子。应用转基因的技术筛选培育符合生产需求的品种就有着巨大的优势。

应用转基因手段改良物种的基础是建立高效优质的再生体系，在这方面已经有很多的学者进行了研究。Al-khayri等用日本结缕草成熟胚诱导了愈伤组织，从而得到再生植株；Inokuma通过培养日本结缕草悬浮细胞系，进而纯化得到原生质体再生株系；Noh等人以结缕草的幼穗、茎尖为外植体材料诱导愈伤组织，并获得了再生植株。但这些办法的周期过长，诱导出胚性愈伤组织通常需要3个月以上的时间，再由胚性愈伤组织长成植株可能要半年左右的时间，这增大了分子育种工作者筛选和选育优良植物品系的周期。Yaxin Ge等人用日本结缕草的匍匐茎做的再生体系，大大缩短了时间，在报道中，2月左右的时间就能获得转基因植株。但植物体内的内生菌难以消除，从而大大影响了基因转化的效率。本课题组构建的再生体系，能保证快速获得再生植株(50天左右)，也同时避免了染菌的问题。

发明内容

为加快日本结缕草组培苗的建成过程，提高生产效益，本发明的目的在于提供一种快速获得日本结缕草组培苗的方法。

本发明提供的快速获得日本结缕草组培苗的方法，包括如下步骤：

1)将灭菌的日本结缕草种子以水浸种3天；

2)浸种后的种子吹干至表面发白，以刚没过种子的水培养至萌发出1-2mm的芽；

3)将萌芽后的种子接种到固体MS(Murashige and Skoog)培养基上，培养至幼苗地上部高3cm，此时幼苗叶鞘底部出现表面粗糙的节点；

4)剥去幼苗上的种皮，沿节点上沿切断幼苗，注意保留节点，去除节点以上的茎叶，将余下的植株放到ZJ-SM培养基上，培养至茎端长出芽；

5)去除茎端长出的芽，将植株放回ZJ-SM培养基上继续培养至根端长出芽；

6)将根端长出的芽切下放到固体1/2MS培养基上培养至长出5cm长的根，得到完整的植株；

7)将完整的植株炼苗后移植，得到日本结缕草组培苗。

其中，所述的水优选为无菌水。

其中，步骤1)所述灭菌的方法为：将种子加入灭菌液后搅拌40min，用水漂洗3-5次后去除表面水分。

所述去除表面水分，为吹干或用无菌滤纸吸干水分。

所述灭菌液为Tween-20含量为2.500ml/L、次氯酸钠原液含量为250ml/L的水溶液。

其中，所述ZJ-SM培养基为含激动素(kinetin)的浓度为1.0-8.0μmol/L、含2,4-D的浓度为0.1μmol/L、蔗糖质量百分含量为2％、植物凝胶的含量为0.3％(w/v)的固体MS培养基。

所述激动素的浓度优选为4.0-6.0μmol/L，最优选为4.0μmol/L。

其中，步骤2)所述培养至萌发出1-2mm的芽，所需时间为3天。

其中，步骤3)所述培养至幼苗株高3cm，所需时间为12天。

其中，步骤4)所述培养至茎端长出芽，所需的时间为4天。

其中，步骤5)所述培养至根端长出芽，所需的时间为15天。

其中，步骤6)所述培养至长出根，所需的时间为10天。

其中，步骤7)所述炼苗，所需时间为3天。

其中，所述培养的培养条件为白天温度28-30℃，夜间温度24-26℃，光照时间16小时/天，光照强度3000lx。

本发明还提供所述快速获得日本结缕草组培苗的方法在日本结缕草良种繁育中的应用。

本发明的有益效果在于提供了一种结缕草快速再生的办法，传统的通过愈伤而获得再生植株的办法一般需要4个月左右，而本发明只需要50天，大大缩短了获得再生植株的周期，为结缕草的转化体系研究提供了基础。以本发明的方法能快速制备结缕草无性系的植株，以便转基因工作者能有遗传背景一致的外植体进行基因研究。本发明的方法还能完成日本结缕草的快速扩繁。

3)能将转基因结缕草进行快速的扩繁。

本发明的关键点如下：

1)制备无菌外植体时，一般用于消毒的酒精，次氯酸等消毒的化学药剂会对植株造成很大的伤害，甚至可能发生诱变而影响植株的再生。本发明是在种子时期进行灭菌的，此时的种子有坚硬厚实的种皮保护而抵挡了清毒处理时，化学药剂对植物的伤害。

2)本发明的灭菌过程保留种子的种皮且灭菌液中需加入少量表面活性剂，这样可以延长灭菌的时间，且充分去除种子表面附着的菌而达到了消毒的效果。

3)ZJ-SM培养基中的激动素及2,4-D的含量为微量，使得结缕草长芽而又不会诱导出愈伤组织。

4)在切除节点时，保留切口处有小绿点的部分，因为小绿点是能分化成整个植株的生长点。

5)除芽，外植体在ZJ-SM培养基上培养时，第一次冒出的芽要去除(一般从外植体顶端冒出)。此时得芽并不是新长出的，而是植物本身含有。

附图说明

图1为实施例4萌发出1-2mm小芽的种子的照片。

图2为实施例4幼苗叶鞘底部节点的照片。

图3为实施例4幼芽生根的照片。

图4为实施例4炼苗和移植的照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1ZJ-SM培养基配方浓度筛选

ZJ-SM培养基中，激动素的作用是促进组织分化、生芽，2,4-D起着生长素的作用，促进不定根形成，促进生长。ZJ-SM培养基中激动素(kinetin)浓度和2,4-D浓度的筛选实验如下：

筛选激动素浓度：

在含蔗糖质量百分含量为2％、植物凝胶的含量为0.3％(w/v)的固体MS培养基上梯度设置含激动素的浓度为1.0μmol/L、2.0μmol/L、3.0μmol/L、4.0μmol/L、5.0μmol/L、6.0μmol/L、7.0μmol/L、8.0μmol/L及0.0μmol/L(对照)。在上述培养基上接种日本结缕草外植体，并统计出芽率。

所述外植体的获得方法如下：将灭菌的日本结缕草种子萌芽后在固体MS培养基培养至地上部高3cm，此时幼苗叶鞘底部出现表面粗糙的节点，剥去幼苗上的种皮，沿节点上沿切断幼苗，注意保留节点，去除节点以上的茎叶，余下的含有节点的部分为外植体。

培养19天后得到的出芽率结果如下：

表1激动素浓度对出芽率的影响

从上述结果来看，加入激动素能大大增加植物出芽的数量。1.0μmol/L-8.0μmol/L浓度的激动素，诱导芽的效果都较好。在4.0μmol/L-6.0μmol/L间，诱导出芽的效率稳定，并且效率很高，三次重复都在55％以上。4.0μmol/L的效果最好，三次重复实验都有最高的出芽率。

筛选2,4-D浓度：

在含激动素(kinetin)的浓度为4.0μmol/L，蔗糖质量百分含量为2％、植物凝胶的含量为0.3％(w/v)的固体MS培养基上接种日本结缕草外植体筛选2,4-D的浓度，发现在0.1μmol/L的时候，没有愈伤组织的形成，在含1μmol/L 2,4-D的情况下，会有部分外植体形成了愈伤组织，而在10μmol/L及以上时，外植体基本都诱导出了愈伤组织。植物诱导出了愈伤组织，不利于芽的诱导。因此我们用0.1μmol/L 2,4-D来分析它对不定根形成的影响：

设置培养基为含激动素的浓度为4.0μmol/L、含2,4-D的浓度为0.1μmol/L、蔗糖质量百分含量为2％、植物凝胶的含量为0.3％(w/v)的固体MS培养基和对照(不含2,4-D，即含激动素的浓度为4.0μmol/L、蔗糖质量百分含量为2％、植物凝胶的含量为0.3％(w/v)的固体MS培养基)在其上接种日本结缕草外植体，培养至茎端长出芽，去除茎端长出的芽，将植株放回ZJ-SM培养基上继续培养至根端长出芽；将根端长出的芽切下放到固体1/2MS培养基上培养至第10天，结果见表2，我们发现添加2,4-D后生根的效率得到了显著提高。

表2添加2,4-D对生根情况的影响

实施例2种子培养方式筛选

将灭菌的日本结缕草种子以4℃的水浸种3天(72小时)，将种子吹干至表面发白，之后设置直接接种到MS培养基上培养和以刚没过种子的水培养两种方式，培养温度均为室温培养。

据观察发现，种子泡在水中，会有少量种子在2天内发芽，在第3天，大部分种子都能发芽了。而直接播在MS培养基中的种子，发芽的最快时间是第3天，大量的种子会在4-5天发芽。

实施例3播种密度筛选

配置固体MS培养基，分装于直径8cm的组培瓶中，每瓶约30ml。

将4℃浸种72小时后的种子吹干至表面发白，以刚没过种子的水培养至萌发出1-2mm的芽，按每瓶10粒、20粒、30粒、40粒、50粒的播种密度接种到上述装有固体MS培养基的组培瓶中，培养15天，观察后没有发现播种密度对日本结缕草的生长情况有明显影响。

实施例4快速获得日本结缕草组培苗的方法

1)2015年1月23日，将日本结缕草种子(品种：zenith)放入50ml离心管中，加入40ml灭菌液(含有100ul Tween-20，10ml次氯酸钠原液)，在双向磁力搅拌器上搅拌40min后，用无菌水漂洗种子3-5次，之后去除表面水分(将种子吹干或用无菌滤纸充分吸干水分的效果一样)以保障有效地杀菌，并侵泡在无菌水中，4℃放置72小时。

2)1月26号，将水倒掉，之后将种子吹干至种子表面发白，这样有利于种子萌发。将种子转入灭菌的培养皿中，加入少量无菌水，使其刚好没过种子，置于室温，无菌条件下培养。

3)1月29日，大部分种子开始萌发出1-2mm小芽，具体见图1。将萌发的种子转入固体MS培养基中(事先配置固体MS培养基，分装于直径8cm的组培瓶中，每瓶约30ml)，一个组培瓶放10粒种子(放20粒的培养效果与放10粒一样)，温室，无菌培养。

4)2月8日，幼苗地上部高3cm，此时幼苗叶鞘底部(根与茎相连处)出现表面粗糙的节点，参见图2，这一节点具有分化成完整植株的能力。将幼苗取出，剥去幼苗上的种皮，沿节点上沿切断幼苗，注意保留节点，去除节点以上的茎叶，将余下的植株放到ZJ-SM培养基上，培养至茎端长出芽；所述ZJ-SM培养基为含激动素(kinetin)的浓度为4.0μmol/L、含2,4-D的浓度为0.1μmol/L，蔗糖(sucrose)质量百分含量为2％、植物凝胶(phytagle)的含量为0.3％(w/v)的固体MS培养基。

5)2月12日，外植体顶端长出芽(这一步的芽是植株本身就有的)，将芽切除，放回ZJ-SM培养基上。

6)2月27日，外植体底部长出了新芽(这一步的芽则是从生长点开始完全新长出来的)。将芽完整取下，转移到1/2固体MS培养基中。

7)3月9日，幼芽生根并且长到5cm左右，见图3，将植株进行炼苗，见图4左侧。

8)3月12日，将植株移植到土中种植，见图4右侧。移栽到土里后很有可能出现萎蔫的现象，在植株适应了外界环境之前，土壤一定要注意保持充足水量。

各步骤的培养条件为白天温度28-30℃，夜间温度24-26℃，光照时间16小时/天，光照强度3000lx。

Claims (10)

1.一种快速获得日本结缕草组培苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将灭菌的日本结缕草种子以水浸种3天；

2)浸种后的种子吹干至表面发白，以刚没过种子的水培养至萌发出1-2mm的芽；

3)将萌芽后的种子接种到固体MS培养基上，培养至幼苗地上部高3cm，此时幼苗叶鞘底部出现表面粗糙的节点；

4)剥去幼苗上的种皮，沿节点上沿切断幼苗，注意保留节点，去除节点以上的茎叶，将余下的植株放到ZJ-SM培养基上，培养至茎端长出芽；

5)去除茎端长出的芽，将植株放回ZJ-SM培养基上继续培养至根端长出芽；

6)将根端长出的芽切下放到固体1/2MS培养基上培养至长出5cm长的根，得到完整的植株；

7)将完整的植株炼苗后移植，得到日本结缕草组培苗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水为无菌水。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述灭菌的方法为：将种子加入灭菌液后搅拌40min，用水漂洗3-5次后去除表面水分。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述去除表面水分，为吹干或用无菌滤纸吸干水分。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述灭菌液为Tween-20含量为2.500ml/L、次氯酸钠原液含量为250ml/L的水溶液。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ZJ-SM培养基为含激动素的浓度为1.0-8.0μmol/L、含2,4-D的浓度为0.1μmol/L，蔗糖质量百分含量为2％、植物凝胶的含量为0.3％(w/v)的固体MS培养基。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ZJ-SM培养基为含激动素的浓度为4.0-6.0μmol/L、含2,4-D的浓度为0.1μmol/L，蔗糖质量百分含量为2％、植物凝胶的含量为0.3％(w/v)的固体MS培养基。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ZJ-SM培养基为含激动素的浓度为4.0μmol/L、含2,4-D的浓度为0.1μmol/L，蔗糖质量百分含量为2％、植物凝胶的含量为0.3％(w/v)的固体MS培养基。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述培养至萌发出1-2mm的芽，所需时间为3天；步骤3)所述培养至幼苗株高3cm，所需时间为12天；步骤4)所述培养至茎端长出芽，所需的时间为4天；步骤5)所述培养至根端长出芽，所需的时间为15天；步骤6)所述培养至长出根，所需的时间为10天；步骤7)所述炼苗，所需时间为3天。

10.权利要求1-9任一项所述的方法在日本结缕草良种繁育中的应用。