CN102228007B

CN102228007B - 一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法

Info

Publication number: CN102228007B
Application number: CN 201110160999
Authority: CN
Inventors: 黄其满; 王晓红; 王岚; 王连铮
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2011-06-15
Filing date: 2011-06-15
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2031-06-15
Also published as: CN102228007A

Abstract

本发明涉及作物种植领域，具体地，涉及一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法。本发明的方法包括以下步骤：1)种子消毒；2)种子萌发；3)制备子叶外植体；4)将得到的外植体置于含有浓度为4～400mg/L碳纳米管的诱导培养基上，诱导其分化；5)将分化好的大豆子叶节外植体转入含有浓度为4～400mg/L碳纳米管的伸长生根培养基；6)分离组培苗。本发明提供了一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法，其易于操作，效果明显，能够建立高效的组培体系，而且并不加大组培工作量，对大豆组培效率的提高具有重要意义。

Description

一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法

技术领域

本发明涉及作物种植领域，具体地，涉及一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法。

背景技术

大豆是我国重要的六大作物之一。在大豆生产中，常受到病害、虫害、杂草及干旱等逆境因素的影响，产量很不稳定；虽然常规育种技术在培育高产、稳产、优质、抗逆性强的新品种中发挥了重要作用，但由于受物种杂交不亲和性及与不良基因性状连锁等因素的影响，在引进外源优良基因的同时也带入了某些不需要的不良基因，因而较难进一步利用。基因工程技术在这一方面开辟了一条全新的途径，它可以打破物种界限，按照人类预先设计，实现不同物种间遗传物质重新组合，使某一物种的优良品种引入其它物种优良基因，实现遗传改良简单易行，因此基因工程育种是大豆品质改良和优秀品种选育最直接有效的方法，基因工程技术成为解决农业问题的一条新出路。然而，大豆的遗传转化效率低，体系不稳定限制了大豆基因工程育种的发展，成为急待解决的难题。相关研究数据表明，大豆遗传转化的受体主要有胚轴，胚芽尖，未成熟子叶，子叶节，胚性悬浮培养物，原生质体和子房。其中子叶节法因其相对成熟、易行，而得到了广大专家学者的关注和研究。子叶节的再生过程简单只需经过分化、伸长和生根即可得到再生苗。但是，子叶节法也存在很多弊端，目前报道其转化效率仅为1％-5％，且转化周期较长，工作量大。大豆子叶节转化效率低主要是由于分化频率低，伸长，生根困难两个关键问题造成的。因此找到解决这两个关键问题的方法，建立一套具有较高分化频率，生根容易的组培体系，成为解决大豆遗传转化问题的前提和关键。

碳纳米管(NM)是一种应用较广的纳米材料，具有一些特殊的力学，电学和化学性能。近年来，某些研究表明纳米材料在水稻、玉米、番茄、豌豆等作物的种子萌发及生长中起到了促进作用。

CN101822140中公开使用碳纳米管促进干旱胁迫条件下促进大豆种子萌发的方法，但并未研究碳纳米管对大豆子叶节外植体分化和生长的影响，而种子萌发和子叶分化生长是两种机理不同的生理过程。随着研究的深入，本发明发现将碳纳米管应用于大豆子叶节的组织培养体系，可以提高大豆的再生频率，为大豆分子遗传转化效率的提高提供基础，具有重要的理论意义和实际应用价值。

因此，本发明的发明人首先提出并通过一系列试验，验证了“一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法”，利用本发明的方法可以建立重要大豆品种的高效再生组织培养体系，本发明同时也发现了纳米材料的新用途。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法。

根据本发明的使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法包括以下步骤：

1)种子消毒；

2)种子萌发；

3)制备子叶外植体；

4)将得到的外植体置于含有浓度为4mg/L～400mg/L碳纳米管的诱导培养基上，诱导其分化；

5)将分化好的大豆子叶节外植体转入含有浓度为40mg/L碳纳米管的伸长生根培养基；

6)分离组培苗。

优选地，根据本发明的方法，其中，将得到的外植体置于含有浓度为40mg/L～400mg/L、更优选含有浓度为40mg/L碳纳米管的诱导培养基上，诱导其分化，然后移至含有浓度为40mg/L碳纳米管的伸长生根培养基。

在本发明的具体实施例中，使用大豆品种为中黄35，该品种为王连铮等培育的高产高油早熟广适应性的大豆优良品种，2008年推广面积为1118万亩，为目前国内推广面积最大的大豆品种，具有重要的研究价值。因此建立高效的大豆中黄35组培体系，将为该品种优良性质的分子遗传转化研究奠定基础，具有重要的理论意义和应用价值。

本发明提供了一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法，其易于操作，效果明显，能够建立高效的组培体系，而且并不加大组培工作量，对大豆组培效率的提高具有重要意义。

附图说明

图1显示大豆中黄35在种子萌发培养基上及子叶节外植体在诱导分化培养基上，A为中黄35大豆在种子萌发培养基上；B为切割中黄35大豆种子制备的子叶节外植体在诱导培养基上。

图2显示碳纳米管处理对大豆中黄35子叶节外植体分化频率的影响，其中A为外植体在SINM0培养基上，B为外植体在SINM4培养基上，C为外植体在SINM40培养基上，D为外植体在SINM400培养基上。

图3显示碳纳米管处理对大豆中黄35子叶节外植体再生植株形成的影响，其中A为外植体在SENM0再生培养基上，B为外植体在SENM4再生培养基上，C为外植体在SENM40再生培养基，D为外植体在SENM400再生培养基上的生长情况。

图4显示大豆中黄35再生植株移栽温室及结荚情况的照片，A为大豆中黄35再生植株移栽温室照片；B为再生植株结荚形成种子的情况。

具体实施方式

结合以下具体实施例说明本发明，但不用于限定本发明的保护范围。

实施例1

供试种子：大豆品种中黄35，1500粒。

纳米材料：碳纳米管(NM)(单壁)

培养基配方：

种子萌发培养基：B5+蔗糖20g/L+琼脂7.5g/L

诱导分化培养基

SINM0：B5+6-BA1.50mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L

SINM4：B5+6-BA1.50mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+NM 4mg/L

SINM40：B5+6-BA1.50mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+NM 40mg/L

SINM400：B5+6-BA1.50mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+NM 400mg/L

再生培养基

SENM0：

B5+ZT1mg/L+IAA0.1mg/L+GA₃0.5mg/L+L-pyrogltamicacid100mg/L+asparagines

50mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L

SENM4：

B5+ZT1mg/L+IAA0.1mg/L+GA₃0.5mg/L+L-pyrogltamicacid100mg/L+asparagines

50mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+NM 4mg/L

SENM40：

B5+ZT1mg/L+IAA0.1mg/L+GA₃0.5mg/L+L-pyrogltamicacid100mg/L+asparagines

50mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+NM 40mg/L

SENM400：

B5+ZT1mg/L+IAA0.1mg/L+GA₃0.5mg/L+L-pyrogltamicacid100mhg/L+asparagines

50mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+NM 400mg/L

1、实验方法

1.1、种子消毒

挑选饱满的大豆种子1000粒，装于灭菌的三角瓶中，用75％酒精洗1分钟，10％次氯酸钠灭菌20分钟，蒸馏水洗3次，然后将大豆种子置于超净台风干多余水分，备用。

1.2、种子萌发

将消毒好的大豆种子种脐向下种于种子萌发培养基中，每皿10粒，置于26℃培养箱中，16/8光暗培养，五天后将萌发好的大豆种子切割子叶节，制备外植体。

1.3、制备外植体

种子萌发五天后，在下胚轴靠近子叶节3mm处横切，去掉下胚轴及胚根，然后沿两片子叶中间纵切，在子叶节部位分别纵向横向切3-5刀，备用。

1.4、诱导分化

将切割好的外植体分别斜插入诱导分化培养基SINM0，SINM4，SINM40，SINM400中，置于26℃培养箱，16/8光暗培养，约两周后外植体分化出丛生芽，统计分化出丛生芽的外植体数，随后切去子叶，转至再生培养基中。

1.5、获得再生植株

将已分化的带有丛生芽的外植体，转至再生培养基SENM0，SENM4，SENM40，SENM400中，25℃培养箱，16/8光暗培养，两周继代一次，继代转苗时注意将外植体上枯黄以及老死的组织切割下来，待分化的丛生芽伸长成为小植株并且生根后，统计得到再生植株的外植体数。然后逐渐松开瓶盖或者封口膜壮苗，壮苗约一周后，洗掉琼脂，转入盆钵中，移栽温室。

2、实验结果

2.1、种子消毒、萌发、制备外植体

将消毒好的大豆中黄35种子种于种子萌发培养基上，五天后萌发，切割制备外植体(如图1)。

2.2、诱导分化

大豆中黄35子叶节外植体，在不同的诱导分化培养基SINM0，SINM4，SINM40，SINM400上，分化频率存在明显差异(如图2)，统计可产生3-30个丛生芽的分化外植体数，结果显示SINM4，SINM40，SINM400培养基诱导分化效果要明显好于SINM0；且以SINM40效果最佳，与SINM0相比差异极显著，SINM4，SINM400的诱导分化频率略高于SINM0(见表一)。将SINM40与SINM0的分化频率进行多次重复比较，结果显示SINM40培养基中外植体分化频率比SINM0高出12.5％(见表二)。实验结果表明在此培养基配方中，加入纳米材料可明显促进大豆中黄35子叶节外植体的分化，且纳米材料的最佳使用浓度为40mg/L。

表一：大豆中黄35子叶节外植体在含有不同浓度纳米材料的诱导分化培养基中分化频率比较(三次重复汇总)

表二：大豆中黄35子叶节外植体在SINM0和SINM40诱导分化培养基中培养一周时分化频率比较(12次重复，每次每个处理约43个外植体，汇总结果)

2.3、获得再生植株

将已分化的大豆中黄35子叶节外植体转入再生培养基SENM0、SENM4、SENM40、SENM400，两周后可见，SENM40培养基中的外植体率先长出大芽同时长出须根(如图3)，能分化生长形成再生植株的外植体达到48.1％(见表三)，且每个外植体可产生1-7个再生植株。这明显提高了大豆中黄35子叶节外植体再生频率，缩短了从分化到成苗的时间。将分离得到的大豆再生植株壮苗一周，然后移栽至土壤里，温室培养，植株生长正常(如图4)。

Claims

1.一种使用纳米材料促进大豆子叶节外植体分化和再生的组织培养方法，所述大豆品种为大豆中黄35，所述方法包括以下步骤：

1）种子消毒；

2）种子萌发；

3）制备子叶节外植体；

4）将得到的外植体置于含有浓度为4mg/L～400mg/L碳纳米管的诱导培养基上，诱导其分化，其中所述诱导培养基的配方为：B5+6-BA1.50mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L；

5）将分化好的大豆子叶节外植体转入含有浓度为40mg/L碳纳米管的伸长生根培养基，其中，所述伸长生根培养基的配方为：

B5+ZT1mg/L+IAA0.1mg/L+GA₃0.5mg/L+L-pyrogltamicacid100mg/L+asparagines50mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L；

6）分离组培苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤4）中，所述碳纳米管的浓度为40mg/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤4）中，所述碳纳米管的浓度为40mg/L～400mg/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，种子消毒方法为：用75%酒精洗1分钟，10%次氯酸钠灭菌20分钟，蒸馏水洗3次。