CN104938331A - 一种铁皮石斛组培繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁皮石斛组培繁殖的方法，包括如下步骤：(1)外植体的选取和处理；(2)诱导愈伤组织培养；(3)分化培养；(4)壮苗培养；(5)生根培养；(6)炼苗与移栽。本发明提供了一种铁皮石斛组培繁殖的方法具有能缩短生产培养单周期和生长周期，而且能提高育苗成活率，从而减少投资资金，降低生产成本，提高工业化生产的利润的优点。
Description
技术领域
本发明属于农业技术领域，特别涉及一种铁皮石斛组培繁殖的方法。
背景技术
铁皮石斛(Musa balbisiana Colla)是我国南方的重要热带水果之一，同时也是许多地区的重要经济收入来源，并且许多农户依靠种植铁皮石斛脱贫致富。大多数的栽培食用铁皮石斛都是单性三倍体AAA，具有高度的不育特性，主要靠无性繁殖，生产上通常利用吸芽进行繁殖，种苗不足时，也可采用铁皮石斛的地下茎切块来繁殖种苗，但是该方法长期使用会累积许多病毒，如：束顶病、花叶病等。造成严重的危害。另外，不良的铁皮石斛种苗会导致生长不良，果品不佳，收获不统一等问题。铁皮石斛组织培养技术能够在短时间内快速繁殖出大量规格统一的优质的无病虫害的健康种苗，并且，新品种的培育和引进也需要利用脱病毒和组培快繁技术加快名优品种的发展。铁皮石斛组培技术是我国农业科研工作者在20世纪80年代后期研发推广，该技术的应用对我国铁皮石斛产业的迅速发展起到了重大的推进作用，也使得种苗工厂化生产得以实现，在短时间内将优良品种大面积推广，达到大规模商品化铁皮石斛生产。但是该产业经过20多年的应用，我们发现该技术存在不足，在生产应用中主要问题是：
1.生产培养单周期时间长，铁皮石斛组培生产中一般单周期培养(即接种到新培养基到培养)时间为30天以上。
2.由于生产周期长，导致生产场地周转慢，占用大量培养架，从而导致厂房面积增加。
以上缺点是传统组培生产中普遍存在的问题，在中国南方的热带及亚热带地区，铁皮石斛组培苗已经成为大宗种苗品种，每年都有超过上亿株的市场需求，但是由于生产成本在逐年的递增(人工费用，场地租金等)极大的阻了种苗工厂化产业的发展，因此开发一种新的铁皮石斛组培繁殖的技术以克服原有培养方式的缺点，确保铁皮石斛种苗产业的进一步发展。
发明内容
本发明针对上述存在的问题，本发明提供了一种铁皮石斛组培繁殖的方法，不仅能缩短生产培养单周期和生长周期，而且能提高育苗成活率，从而减少投资资金，降低生产成本，提高工业化生产的利润。
本发明的方案是通过这样实现的：
一种铁皮石斛组培繁殖的方法，包括如下步骤：
(1)外植体的选取和处理：
选取直径为0.2-0.5cm的铁皮石斛茎，使用酒精消毒后在无菌超净台下对铁皮石斛茎进行横切，然后纵切得到长0.5-2cm，宽0.1-0.3cm的茎片条待用；
(2)诱导愈伤组织培养
使用镊子将茎片条放入愈伤组织培养基上，轻压茎片条，使茎片条与愈伤组织培养基紧贴，所述愈伤组织培养的培养基配方为：1/2MS+NAA(萘乙酸)0.1～0.2mg/L+KT(激动素)0.3～0.5mg/L+BA(分裂素)0.1～0.3mg/L+5～8g/L琼脂+20～30g/L蔗糖+5～8g/L花生汁，PH为5.0-5.5，在25～30℃下，光暗交替培养20天，得到愈伤组织；
(3)分化培养
将愈伤组织转接到MS+6-BA(6苄基腺嘌呤)0.3～0.6mg/L+NAA(萘乙酸)0.3～0.6mg/L+2,4-D(生长素)0.3～0.5mg/L+10～15g/L琼脂+30～50g/L蔗糖的分化培养基上培养，PH为5.0-5.5，光照强度为1000-1500lx，光培养8-15d，愈伤组织分化得到铁皮石斛苗；
(4)壮苗培养
将铁皮石斛苗转接至壮苗培养基上继续培养，所述壮苗培养基成分为IBA(吲哚乙酸)0.3～0.7mg/L+NAA(萘乙酸)0.3～0.5mg/L+2,4-D(生长素)0.5～0.8mg/L+10～15g/L琼脂+30～50g/L蔗糖+10～15g/L香蕉泥，PH为5.0-5.5，光照强度为1500-1800lx，培养8-15d；
(5)生根培养
将壮苗培育后的铁皮石斛苗转接至生根培养基上培养，所述生根培养基配方为IBA(吲哚乙酸)2～5mg/L+NAA(萘乙酸)2～5mg/L+0.1～0.2g/L活性炭+5～10g/L琼脂+20～30g/L蔗糖+10～15g/L马铃薯泥，光照强度为2500-4500lx，培养3-8d；
(6)炼苗与移栽
选取根系发达及健壮的铁皮石斛幼苗进行闭瓶培养3-5天后，再取出铁皮石斛幼苗洗净根部培养基，在砂床上驯化10-20天后，移栽至种植基质中。
本发明中，作为进一步说明，所述沙床湿度为50～80％；沙床的温度控制在20℃～35℃。
本发明中，作为进一步说明，所述沙床用0.1～0.2％高锰酸钾进行消毒。
本发明中，作为进一步说明，所述种植基质的原料为按树皮、松树皮和泥炭的混合物。
本发明中，作为进一步说明，所述按树皮、松树皮和泥炭按照重量份数比为1:1:2进行混合，堆沤10-15天即可得到种植基质。
本发明的突出的实质性特点和显著进步是：
1、本发明将培养出来的铁皮石斛幼苗先进行闭瓶炼苗，再开瓶炼苗，可以提高炼苗后铁皮石斛幼苗的成活率。
2、本发明采用混合料作为种植基质，选用的混合料，能大幅提高铁皮石斛的产量。
2、本发明针对不同的培养阶段添加不同的激素和外源物质，能缩短生产培养单周期和生长周期；采用本发明方法培养铁皮石斛合适工业化应用，在铁皮石斛苗栽培生产领域中具有极大的推广价值。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明，以使本发明的优点和特征更易于被理解，应该理解的是，本发明的实施例仅仅是用于本发明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
一种铁皮石斛组培繁殖的方法，包括如下步骤：
(1)外植体的选取和处理：
选取直径为0.2cm的铁皮石斛茎，使用酒精消毒后在无菌超净台下对铁皮石斛茎进行横切，然后纵切得到长0.5cm，宽0.1cm的茎片条待用；
(2)诱导愈伤组织培养
使用镊子将茎片条放入愈伤组织培养基上，轻压茎片条，使茎片条与愈伤组织培养基紧贴，所述愈伤组织培养的培养基配方为：1/2MS+NAA(萘乙酸)0.1mg/L+KT(激动素)0.3mg/L+BA(分裂素)0.1mg/L+5g/L琼脂+20g/L蔗糖+5g/L花生汁，PH为5.0，在25℃下，光暗交替培养20天，得到愈伤组织；
(3)分化培养
将愈伤组织转接到MS+6-BA(6苄基腺嘌呤)0.3mg/L+NAA(萘乙酸)0.3mg/L+2,4-D(生长素)0.3mg/L+10g/L琼脂+30g/L蔗糖的分化培养基上培养，PH为5.0，光照强度为1000lx，光培养8d，愈伤组织分化得到铁皮石斛苗；
(4)壮苗培养
将铁皮石斛苗转接至壮苗培养基上继续培养，所述壮苗培养基成分为IBA(吲哚乙酸)0.3mg/L+NAA(萘乙酸)0.3mg/L+2,4-D(生长素)0.5mg/L+10g/L琼脂+30g/L蔗糖+10～15g/L香蕉泥，PH为5.0，光照强度为1500lx，培养8d；
(5)生根培养
将壮苗培育后的铁皮石斛苗转接至生根培养基上培养，所述生根培养基配方为IBA(吲哚乙酸)2mg/L+NAA(萘乙酸)2mg/L+0.1g/L活性炭+5g/L琼脂+20g/L蔗糖+10g/L马铃薯泥，光照强度为2500lx，培养3d；
(6)炼苗与移栽
选取根系发达及健壮的铁皮石斛幼苗进行闭瓶培养3天后，再取出铁皮石斛幼苗洗净根部培养基，在用0.1％高锰酸钾进行消毒后，湿度为50％，温度为20℃的砂床上驯化10天后，移栽至由按树皮、松树皮和泥炭按照重量份数比为1:1:2进行混合，堆沤10天后得到的种植基质中。
实施例2：
一种铁皮石斛组培繁殖的方法，包括如下步骤：
(1)外植体的选取和处理：
选取直径为0.5cm的铁皮石斛茎，使用酒精消毒后在无菌超净台下对铁皮石斛茎进行横切，然后纵切得到长2cm，宽0.3cm的茎片条待用；
(2)诱导愈伤组织培养
使用镊子将茎片条放入愈伤组织培养基上，轻压茎片条，使茎片条与愈伤组织培养基紧贴，所述愈伤组织培养的培养基配方为：1/2MS+NAA(萘乙酸)0.2mg/L+KT(激动素)0.5mg/L+BA(分裂素)0.3mg/L+8g/L琼脂+30g/L蔗糖+8g/L花生汁，PH为5.5，在30℃下，光暗交替培养20天，得到愈伤组织；
(3)分化培养
将愈伤组织转接到MS+6-BA(6苄基腺嘌呤)0.6mg/L+NAA(萘乙酸)0.6mg/L+2,4-D(生长素)0.5mg/L+15g/L琼脂+50g/L蔗糖的分化培养基上培养，PH为5.5，光照强度为1500lx，光培养15d，愈伤组织分化得到铁皮石斛苗；
(4)壮苗培养
将铁皮石斛苗转接至壮苗培养基上继续培养，所述壮苗培养基成分为IBA(吲哚乙酸)0.7mg/L+NAA(萘乙酸)0.5mg/L+2,4-D(生长素)0.8mg/L+15g/L琼脂+50g/L蔗糖+15g/L香蕉泥，PH为5.5，光照强度为1800lx，培养15d；
(5)生根培养
将壮苗培育后的铁皮石斛苗转接至生根培养基上培养，所述生根培养基配方为IBA(吲哚乙酸)5mg/L+NAA(萘乙酸)5mg/L+0.2g/L活性炭+10g/L琼脂+30g/L蔗糖+15g/L马铃薯泥，光照强度为4500lx，培养8d；
(6)炼苗与移栽
选取根系发达及健壮的铁皮石斛幼苗进行闭瓶培养5天后，再取出铁皮石斛幼苗洗净根部培养基，在用0.2％高锰酸钾进行消毒后，湿度为80％，温度为35℃的砂床上驯化20天后，移栽至由按树皮、松树皮和泥炭按照重量份数比为1:1:2进行混合，堆沤15天后得到的种植基质中。
实施例3：
一种铁皮石斛组培繁殖的方法，包括如下步骤：
(1)外植体的选取和处理：
选取直径为0.3cm的铁皮石斛茎，使用酒精消毒后在无菌超净台下对铁皮石斛茎进行横切，然后纵切得到长0.8cm，宽0.15cm的茎片条待用；
(2)诱导愈伤组织培养
使用镊子将茎片条放入愈伤组织培养基上，轻压茎片条，使茎片条与愈伤组织培养基紧贴，所述愈伤组织培养的培养基配方为：1/2MS+NAA(萘乙酸)0.15mg/L+KT(激动素)0.35mg/L+BA(分裂素)0.15mg/L+6g/L琼脂+25g/L蔗糖+6g/L花生汁，PH为5.0，在26℃下，光暗交替培养20天，得到愈伤组织；
(3)分化培养
将愈伤组织转接到MS+6-BA(6苄基腺嘌呤)0.4mg/L+NAA(萘乙酸)0.4mg/L+2,4-D(生长素)0.35mg/L+12g/L琼脂+35g/L蔗糖的分化培养基上培养，PH为5.0，光照强度为1200lx，光培养9d，愈伤组织分化得到铁皮石斛苗；
(4)壮苗培养
将铁皮石斛苗转接至壮苗培养基上继续培养，所述壮苗培养基成分为IBA(吲哚乙酸)0.4mg/L+NAA(萘乙酸)0.4mg/L+2,4-D(生长素)0.6mg/L+12g/L琼脂+35g/L蔗糖+12g/L香蕉泥，PH为5.5，光照强度为1600lx，培养10d；
(5)生根培养
将壮苗培育后的铁皮石斛苗转接至生根培养基上培养，所述生根培养基配方为IBA(吲哚乙酸)3mg/L+NAA(萘乙酸)3mg/L+0.15g/L活性炭+6g/L琼脂+25g/L蔗糖+12g/L马铃薯泥，光照强度为3500lx，培养4d；
(6)炼苗与移栽
选取根系发达及健壮的铁皮石斛幼苗进行闭瓶培养4天后，再取出铁皮石斛幼苗洗净根部培养基，在用0.15％高锰酸钾进行消毒后，湿度为60％，温度为25℃的砂床上驯化12天后，移栽至由按树皮、松树皮和泥炭按照重量份数比为1:1:2进行混合，堆沤12天后得到的种植基质中。
实施例4：
一种铁皮石斛组培繁殖的方法，包括如下步骤：
(1)外植体的选取和处理：
选取直径为0.4cm的铁皮石斛茎，使用酒精消毒后在无菌超净台下对铁皮石斛茎进行横切，然后纵切得到长1cm，宽0.2cm的茎片条待用；
(2)诱导愈伤组织培养
使用镊子将茎片条放入愈伤组织培养基上，轻压茎片条，使茎片条与愈伤组织培养基紧贴，所述愈伤组织培养的培养基配方为：1/2MS+NAA(萘乙酸)0.15mg/L+KT(激动素)0.4mg/L+BA(分裂素)0.2mg/L+7g/L琼脂+28g/L蔗糖+7g/L花生汁，PH为5.5，在28℃下，光暗交替培养20天，得到愈伤组织；
(3)分化培养
将愈伤组织转接到MS+6-BA(6苄基腺嘌呤)0.5mg/L+NAA(萘乙酸)0.5mg/L+2,4-D(生长素)0.4mg/L+13g/L琼脂+40g/L蔗糖的分化培养基上培养，PH为5.0，光照强度为1300lx，光培养13d，愈伤组织分化得到铁皮石斛苗；
(4)壮苗培养
将铁皮石斛苗转接至壮苗培养基上继续培养，所述壮苗培养基成分为IBA(吲哚乙酸)0.6mg/L+NAA(萘乙酸)0.4mg/L+2,4-D(生长素)0.6mg/L+14g/L琼脂+45g/L蔗糖+14g/L香蕉泥，PH为5.0，光照强度为1750lx，培养14d；
(5)生根培养
将壮苗培育后的铁皮石斛苗转接至生根培养基上培养，所述生根培养基配方为IBA(吲哚乙酸)4.5mg/L+NAA(萘乙酸)4.5mg/L+0.15g/L活性炭+9g/L琼脂+29g/L蔗糖+17g/L马铃薯泥，光照强度为3600lx，培养6d；
(6)炼苗与移栽
选取根系发达及健壮的铁皮石斛幼苗进行闭瓶培养5天后，再取出铁皮石斛幼苗洗净根部培养基，在用0.45％高锰酸钾进行消毒后，湿度为75％，温度为26℃的砂床上驯化19天后，移栽至由按树皮、松树皮和泥炭按照重量份数比为1:1:2进行混合，堆沤13天后得到的种植基质中。
实施例5：
一种铁皮石斛组培繁殖的方法，包括如下步骤：
(1)外植体的选取和处理：
选取直径为0.3cm的铁皮石斛茎，使用酒精消毒后在无菌超净台下对铁皮石斛茎进行横切，然后纵切得到长1.5cm，宽0.25cm的茎片条待用；
(2)诱导愈伤组织培养
使用镊子将茎片条放入愈伤组织培养基上，轻压茎片条，使茎片条与愈伤组织培养基紧贴，所述愈伤组织培养的培养基配方为：1/2MS+NAA(萘乙酸)0.2mg/L+KT(激动素)0.45mg/L+BA(分裂素)0.25mg/L+6.5g/L琼脂+26g/L蔗糖+5g/L花生汁，PH为5.5，在27℃下，光暗交替培养20天，得到愈伤组织；
(3)分化培养
将愈伤组织转接到MS+6-BA(6苄基腺嘌呤)0.3mg/L+NAA(萘乙酸)0.5mg/L+2,4-D(生长素)0.4mg/L+13g/L琼脂+43g/L蔗糖的分化培养基上培养，PH为5.5，光照强度为1450lx，光培养12d，愈伤组织分化得到铁皮石斛苗；
(4)壮苗培养
将铁皮石斛苗转接至壮苗培养基上继续培养，所述壮苗培养基成分为IBA(吲哚乙酸)0.65mg/L+NAA(萘乙酸)0.35mg/L+2,4-D(生长素)0.65mg/L+12g/L琼脂+45g/L蔗糖+12g/L香蕉泥，PH为5.0，光照强度为1650lx，培养13d；
(5)生根培养
将壮苗培育后的铁皮石斛苗转接至生根培养基上培养，所述生根培养基配方为IBA(吲哚乙酸)3mg/L+NAA(萘乙酸)2mg/L+0.1g/L活性炭+9g/L琼脂+22g/L蔗糖+12g/L马铃薯泥，光照强度为3300lx，培养8d；
(6)炼苗与移栽
选取根系发达及健壮的铁皮石斛幼苗进行闭瓶培养3天后，再取出铁皮石斛幼苗洗净根部培养基，在用0.1％高锰酸钾进行消毒后，湿度为60％，温度为25℃的砂床上驯化12天后，移栽至由按树皮、松树皮和泥炭按照重量份数比为1:1:2进行混合，堆沤12天后得到的种植基质中。
将以上实施例1～5得到的移栽苗和市面购买的普通移栽苗(CK)，分别各选取20棵苗，20cm×20cm定植，其中CK定植于，在3、5、9、14、21天观察记录生长情况。
表1 各实施例定植的生长情况与成活率表
由上表可知，采用本发明方法繁殖后的铁皮石斛苗在定植大田后的成活率均≥90％，与CK相比较提高至少百分之十个点。
将上述各个实施例和CK种植18个月后进行采收，分别进行重量计算。
表1 各实施例采收后重质量情况表 单位KG
| 总质量 | |
| 实施例1 | 25 |
| 实施例2 | 20 |
| 实施例3 | 19 |
| 实施例4 | 18.5 |
| 实施例5 | 18.5 |
| CK | 16 |
由上表可知，采用本发明方法种植的铁皮石斛产量相比普通的培养铁皮石斛苗种植的产量要高，产量提高至少13％以上。
Claims (5)
1.一种铁皮石斛组培繁殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)外植体的选取和处理：
选取直径为0.2-0.5cm的铁皮石斛茎，使用酒精消毒后在无菌超净台下对铁皮石斛茎进行横切，然后纵切得到长0.5-2cm，宽0.1-0.3cm的茎片条待用；
(2)诱导愈伤组织培养
使用镊子将茎片条放入愈伤组织培养基上，轻压茎片条，使茎片条与愈伤组织培养基紧贴，所述愈伤组织培养的培养基配方为：1/2MS+NAA 0.1～0.2mg/L+KT 0.3～0.5mg/L+BA 0.1～0.3mg/L+5～8g/L琼脂+20～30g/L蔗糖+5～8g/L花生汁，PH为5.0-5.5，在25～30℃下，光暗交替培养20天，得到愈伤组织；
(3)分化培养
将愈伤组织转接到MS+6-BA 0.3～0.6mg/L+NAA 0.3～0.6mg/L+2,4-D 0.3～0.5mg/L+10～15g/L琼脂+30～50g/L蔗糖的分化培养基上培养，PH为5.0-5.5，光照强度为1000-1500lx，光培养8-15d，愈伤组织分化得到铁皮石斛苗；
(4)壮苗培养
将铁皮石斛苗转接至壮苗培养基上继续培养，所述壮苗培养基成分为IBA 0.3～0.7mg/L+NAA 0.3～0.5mg/L+2,4-D 0.5～0.8mg/L+10～15g/L琼脂+30～50g/L蔗糖+10～15g/L香蕉泥，PH为5.0-5.5，光照强度为1500-1800lx，培养8-15d；
(5)生根培养
将壮苗培育后的铁皮石斛苗转接至生根培养基上培养，所述生根培养基配方为IBA 2～5mg/L+NAA 2～5mg/L+0.1～0.2g/L活性炭+5～10g/L琼脂+20～30g/L蔗糖+10～15g/L马铃薯泥，光照强度为2500-4500lx，培养3-8d；
(6)炼苗与移栽
选取根系发达及健壮的铁皮石斛幼苗进行闭瓶培养3-5天后，再取出铁皮石斛幼苗洗净根部培养基，在砂床上驯化10-20天后，移栽至种植基质中。
2.根据权利要求书1所述铁皮石斛组培繁殖的方法，其特征在于，所述沙床湿度为50～80％；沙床的温度控制在20℃～35℃。
3.根据权利要求书1所述铁皮石斛组培繁殖的方法，其特征在于，所述沙床用0.1～0.2％高锰酸钾进行消毒。
4.根据权利要求书1所述铁皮石斛组培繁殖的方法，其特征在于，所述种植基质的原料为按树皮、松树皮和泥炭的混合物。
5.根据权利要求书4所述铁皮石斛组培繁殖的方法，其特征在于，所述按树皮、松树皮和泥炭按照重量份数比为1:1:2进行混合，堆沤10-15天即可得到种植基质。
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