CN100366145C - 西瓜子叶离体培养间接再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种西瓜子叶离体培养间接再生植株的方法，包括以下步骤：1)种子发芽：选用京欣或伊选类西瓜栽培种为材料进行种子发芽；2)愈伤组织诱导：选取上述4日龄幼苗无菌苗的胚轴与子叶之间部位作为外植体接种到诱导培养基上，于25℃的黑暗条件下培养20天，诱导获得愈伤组织；3)愈伤组织分化不定芽：将愈伤组织转到分化培养基上，并移到光下继续培养30天，获得间接再生不定芽；4)将上述间接再生不定芽进行伸长、生根培养，获得间接再生植株。使用本发明的方法，能获得完整植株——西瓜间接再生植株。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织培养方法，特别是西瓜子叶离体培养间接再生植株的方法。
背景技术
西瓜香甜味美，而且含有较高的维生素和番茄素，因此受到广大消费者的喜爱。西瓜作为一种重要的蔬菜作物，世界上年产量超过8100万吨。但是西瓜容易遭受病害、冷害等各种自然灾害的影响，导致其栽培受到很大的限制。与此同时，随着社会经济发展和人民生活水平的提高，人们对西瓜种类和品质的要求越来越高，希望一年四季不断有高品质、不同品种的西瓜产品上市。通过离体培养、基因改良和体细胞无性系突变体筛选可以改良西瓜的遗传性状，从而能够获得多抗、高品质的西瓜品种供栽培。西瓜离体培养已经有几十年的历史，并且从茎尖培养、不定芽诱导和体细胞胚胎发生等各种途径对西瓜离体培养进行了研究。但是，以往的西瓜组织培养要么采用直接再生的途径获得植株；要么诱导出西瓜完全脱分化愈伤组织后，没有进一步进行脱分化获得再生植株。Michact E.Compton和D.J.Gray用西瓜未成熟胚的子叶作为外植体，经诱导培养获得直接和间接(愈伤组织途径)再生的体细胞胚胎；这种方法不但频率比低，而且所得的体细胞胚胎发芽率很低。然而，在植物组织培养过程中，通过外植体间接再生比直接再生更容易发生突变，从而利于获得遗传形状得到改良的体细胞无性系突变体。若用愈伤组织作为材料进行基因转化，则有可能增加携带外源基因微生物侵染的机会，从而提高基因转化的频率。而且通过花药培养、原生质体培养以及体细胞杂交获得再生植株时，又必须通过间接再生途径才能得到植株。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种西瓜子叶离体培养间接再生植株的方法。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种西瓜子叶离体培养间接再生植株的方法，包括以下步骤：
1)、种子发芽：选用京欣或伊选西瓜栽培种为材料进行种子发芽；
2)、愈伤组织诱导：
选取上述4日龄幼苗无菌苗的胚轴与子叶之间部位作为外植体；
当西瓜栽培种为京欣时，将上述外植体接种到诱导培养基A上，诱导培养基A是按照每升MS基本培养基内加入20克蔗糖、7克琼脂、1.0毫克萘乙酸(NAA)、0.5毫克六苄基腺嘌呤(BA)和2.0毫克6-糠氨基嘌呤(KT)的比例并调节pH值为5.8所制成的；
当西瓜栽培种为伊选时，将上述外植体接种到诱导培养基B上，诱导培养基B是按照每升MS基本培养基内加入20克蔗糖、7克琼脂、1.0毫克NAA、2.0毫克BA和1.0毫克KT的比例并调节pH值为5.8所制成的；
将上述接种于诱导培养基上的外植体，于25℃的黑暗条件下培养20天，诱导获得愈伤组织；
3)、愈伤组织分化不定芽：
按照每升MS基本培养基内加入0.1毫克吲哚乙酸(IAA)、2.0毫克BA和2.0毫克KT的比例并调节pH值为5.8，制作了分化培养基；
将上述愈伤组织转到分化培养基上，并移到光下继续培养30天，获得间接再生不定芽；
4)、将上述间接再生不定芽进行伸长、生根培养，获得间接再生植株；伸长培养基是按照每升MS基本培养基内加入0.1毫克KT的比例并调节pH值为5.8所制成的；生根培养基是按照每升MS基本培养基内加入0.1毫克NAA的比例并调节pH值为5.8所制成的。
作为本发明的西瓜子叶离体培养间接再生植株的方法的一种改进，种子发芽步骤为：种子在30℃自来水中浸泡3.5～4.5小时后剥去外壳，然后将去壳种子用纱布包好浸入10％次氯酸钠溶液中，置于摇床上振荡消毒10分钟；然后对去壳种子用无菌水进行冲洗。再将上述冲洗后的去壳种子接种到按照每升MS基本培养基内加入20克蔗糖和7克琼脂的比例制成、且pH值为5.8的培养基上；先于28℃培养箱的黑暗条件下培养30小时，待90％以上种子胚根露出以后，再转移到培养室3000勒克斯(LX)光照条件下继续培养，直至4～5天后子叶展开。
作为本发明的西瓜子叶离体培养间接再生植株的方法的一种改进，在愈伤组织诱导步骤中：外植体为长0.5cm、宽0.2cm、且表面带有3～4道手术刀划痕的长方体。
本发明在创作过程中，具体考虑了以下几种因素在本发明中所起的作用：
一、光照条件的不同对西瓜诱导愈伤组织的影响：结果发现在黑暗条件下诱导的愈伤组织呈淡黄色颗粒状，有光泽；如图3和图4所示。明显比3000LX光照条件下诱导的愈伤组织(如图1和图2所示)效果好。
二、不同激素配比对愈伤组织诱导和植株再生的影响：
1)、不同激素配比对愈伤组织诱导的影响：
在每升MS基本培养基内加入20克蔗糖、7克琼脂的基础上，添加不同配比的NAA、BA、KT激素，并调节其pH值为5.8，制成相应的诱导培养基，
具体如表1所示：
表1 18种不同配比激素所制成的诱导培养基
| 培养基编号number of medium | 激素浓度(mg/L)concentration of hormone | ||
| NAA | BA | KT | |
| Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8(诱导培养基A)Y9Y10Y11(诱导培养基B)Y12Y13Y14Y15Y16Y17Y18 | 0.50.50.50.50.50.51.01.01.01.01.01.02.02.02.02.02.02.0 | 0.50.51.01.02.02.00.50.51.01.02.02.00.50.51.01.02.02.0 | 1.02.01.02.01.02.01.02.01.02.01.02.01.02.01.02.01.02.0 |
将京欣类西瓜外植体和伊选类西瓜外植体，分别接种于上述诱导培养基上，于25℃的黑暗条件下培养20天，诱导获得相应的愈伤组织。
结果表明：采用Y8号培养基(即在每升MS基本培养基内加入20克蔗糖、7克琼脂的基础上，再添加1.0mg NAA、0.5mg BA和2.0mg KT)诱导京欣类西瓜愈伤组织效果最好：不仅诱导率高，而且诱导的愈伤组织质量好，没有外植体褐化情况发生，如图3所示。将Y8号培养基定义为诱导培养基A。采用Y11号培养基(即在每升MS基本培养基内加入20克蔗糖、7克琼脂的基础上，再添加1.0mg NAA、2.0mg BA和1.0mg KT)诱导伊选类西瓜愈伤组织效果最好：不仅诱导率高，而且诱导的愈伤组织质量好，没有外植体褐化情况发生，如图4所示。将Y11号培养基定义为诱导培养基B。
2)、不同激素配比对愈伤组织再生不定芽频率的影响：
在每升MS基本培养基内添加不同配比的IAA、BA、KT激素，并调节其pH值为5.8，制成相应的分化培养基。将上述诱导培养基A(即Y8号培养基)诱导的京欣类西瓜愈伤组织和上述诱导培养基B(即Y11号培养基)诱导的伊选类西瓜愈伤组织，分别转到上述不同的分化培养基上，并移到光下继续培养30天，获得间接再生不定芽。分化培养基内的激素含量及相应的愈伤组织分化频率如表2所示。
表2分化培养基内的激素含量及相应的愈伤组织分化频率
| 分化培养基编号number ofmedium | 激素浓度(mg/L)concentration of hormone differentiation | 愈伤分化频率frequency of calli | |||
| IAA | BA | KT | 伊选 | 京欣 | |
| F1F2F3F4F5 | 0.000.000.000.000.05 | 2.02.04.04.02.0 | 0.02.00.02.00.0 | 0±00±02.1±4.20±04.2±4.8 | 0±02.1±4.20±00±06.3±8.0 |
| F6F7F8F9<sup>*</sup>F10F11F12 | 0.050.050.050.100.100.100.10 | 2.04.04.02.02.04.04.0 | 2.00.02.00.02.00.02.0 | 8.3±06.2±4.24.2±4.86.3±8.012.5±4.84.2±4.88.3±6.8 | 10.4±4.26.3±8.06.2±4.24.2±8.418.8±4.26.3±8.08.3±0 |
结果表明：伊选和京欣两类西瓜完全脱分化愈伤组织在F10号分化培养基(即每升MS基本培养基内加入0.1毫克IAA、2.0毫克BA和2.0毫克KT)上均达到最高再生频率，分别为12.5±4.8％和18.8±4.2％，而且再生不定芽嫩绿、有光泽，如图5、图6所示。
本发明成功获得了由伊选和京欣两类西瓜间接再生不定芽，并通过伸长、生根培养获得了完整植株——西瓜间接再生植株。本发明建立了良好的西瓜间接再生体系，并且为体细胞无性系变异诱导、基因改良、花药培养、原生质体培养以及融合和多倍体诱导等研究和应用提供依据。
本发明中使用的所有培养基均用1mol/L的NAOH或HCL调节pH值至5.8，在121～126℃之间恒温灭菌20min。MS基本培养基为Murashige and Skoog1962年发明的植物组织基本培养基。
附图说明
图1是“伊选”在3000LX光照条件下诱导的愈伤组织图；
图2是“京欣”在3000LX光照条件下诱导的愈伤组织图；
图3是“伊选”在黑暗条件下诱导的愈伤组织体式显微镜下的拍摄图；
图4是“京欣”在黑暗条件下诱导的愈伤组织体式显微镜下的拍摄图；
图5是“伊选”愈伤再生不定芽体式显微镜下的拍摄图；
图6是“京欣”愈伤再生不定芽体式显微镜下的拍摄图。
具体实施方式
参照上述附图，对本发明的具体实施方式进行详细说明。一种西瓜子叶离体培养间接再生植株的方法，其特征是包括以下步骤：
1、种子发芽：
选用京欣和伊选类西瓜栽培种为材料，两种种子的发芽步骤均为：
种子在30℃自来水中浸泡4小时左右后剥去外壳，然后将去壳种子用纱布包好浸入浓度为10％的次氯酸钠溶液中，置于摇床上振荡消毒10分钟；然后对去壳种子多次用无菌水进行冲洗；
将上述冲洗后的去壳种子接种到按照每升MS基本培养基内加入20克蔗糖和7克琼脂的比例制成、且pH值为5.8的培养基上；先于28℃培养箱的黑暗条件下培养30小时，待90％以上种子胚根露出以后，再转移到培养室3000LX光照条件下继续培养，直至4～5天后子叶展开。
2、愈伤组织诱导：
1)、选取上述4日龄幼苗无菌苗的胚轴与子叶之间再生能力强的部位，切成长约0.5cm宽约0.2cm的长方体，用手术刀在长方体表面划3-4下作为外植体。
2)、当西瓜栽培种为京欣时，将外植体接种到诱导培养基A上，诱导培养基A是按照每升MS基本培养基内加入20克蔗糖、7克琼脂、1.0毫克NAA、0.5毫克BA和2.0毫克KT的比例并调节pH值为5.8所制成的。
当西瓜栽培种为伊选时，将外植体接种到诱导培养基B上，诱导培养基B是按照每升MS基本培养基内加入20克蔗糖、7克琼脂、1.0毫克NAA、2.0毫克BA和1.0毫克KT的比例并调节pH值为5.8所制成的。
3)、将上述2类接种于诱导培养基上的外植体，分别于25℃的黑暗条件下培养20天，诱导后获得京欣类西瓜愈伤组织和伊选类西瓜愈伤组织的效果均很好：即不仅诱导率高，而且诱导的愈伤组织质量好，没有外植体褐化情况发生。
3、愈伤组织分化不定芽：
按照每升MS基本培养基内加入0.1毫克IAA、2.0毫克BA和2.0毫克KT的比例并调节pH值为5.8，制作分化培养基。
将上述京欣类西瓜愈伤组织和伊选类西瓜愈伤组织，分别转到分化培养基上，并移到组培室，光下继续培养30天，分别获得京欣类西瓜间接再生不定芽和伊选类西瓜间接再生不定芽。
京欣类西瓜愈伤组织和伊选类西瓜愈伤组织在上述分化培养基上均达到最高再生频率，分别为12.5±4.8％和18.8±4.2％；而且两种再生不定芽均为嫩绿，有光泽。
4、将上述间接再生不定芽进行伸长、生根培养，获得间接再生植株：
将上述京欣类西瓜间接再生不定芽和伊选类西瓜间接再生不定芽，分别转到MS+0.1mg/L KT培养基(即按照每升MS基本培养基内加入0.1毫克KT的比例并调节pH值为5.8所制成)上进行培养。
待上述两种不定芽在伸长培养基上分别长至1.5-2.0cm以后，再将其分别转到MS+0.1mg/LNAA的生根培养基(即按照每升MS基本培养基内加入0.1毫克NAA的比例并调节pH值为5.8所制成)上生根培养15天，就可以开口炼苗移栽。
上述实验过程中所用到的MS基本培养基，均可购自Sigma和上海生工生物工程有限公司。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种西瓜子叶离体培养间接再生植株的方法，其特征是包括以下步骤：
1)、种子发芽：选用京欣或伊选西瓜栽培种为材料进行种子发芽；
2)、愈伤组织诱导：
选取上述4日龄幼苗无菌苗的胚轴与子叶之间部位作为外植体；
当西瓜栽培种为京欣时，将上述外植体接种到诱导培养基A上，所述诱导培养基A是按照每升MS基本培养基内加入20克蔗糖、7克琼脂、1.0毫克萘乙酸、0.5毫克六苄基腺嘌呤和2.0毫克6-糠氨基嘌呤的比例并调节pH值为5.8所制成的；
当西瓜栽培种为伊选时，将上述外植体接种到诱导培养基B上，所述诱导培养基B是按照每升MS基本培养基内加入20克蔗糖、7克琼脂、1.0毫克萘乙酸、2.0毫克六苄基腺嘌呤和1.0毫克6-糠氨基嘌呤的比例并调节pH值为5.8所制成的；
将上述接种于诱导培养基上的外植体，于25℃的黑暗条件下培养20天，诱导获得愈伤组织；
3)、愈伤组织分化不定芽：
按照每升MS基本培养基内加入0.1毫克吲哚乙酸、2.0毫克六苄基腺嘌呤和2.0毫克6-糠氨基嘌呤的比例并调节pH值为5.8，制作了分化培养基；
将上述愈伤组织转到分化培养基上，并移到光下继续培养30天，获得间接再生不定芽；
4)、将上述间接再生不定芽进行伸长、生根培养，获得间接再生植株；
所述伸长培养基是按照每升MS基本培养基内加入0.1毫克6-糠氨基嘌呤的比例并调节pH值为5.8所制成的；
所述生根培养基是按照每升MS基本培养基内加入0.1毫克萘乙酸的比例并调节pH值为5.8所制成的。
2.根据权利要求1所述的西瓜子叶离体培养间接再生植株的方法，其特征是所述种子发芽步骤为：
种子在30℃自来水中浸泡3.5～4.5小时后剥去外壳，然后将去壳种子用纱布包好浸入10％次氯酸钠溶液中，置于摇床上振荡消毒10分钟；然后对去壳种子用无菌水进行冲洗；
将上述冲洗后的去壳种子接种到按照每升MS基本培养基内加入20克蔗糖和7克琼脂的比例制成、且pH值为5.8的培养基上；先于28℃培养箱的黑暗条件下培养30小时，待90％以上种子胚根露出以后，再转移到培养室3000勒克斯光照条件下继续培养，直至4～5天后子叶展开。
3.根据权利要求2所述的西瓜子叶离体培养间接再生植株的方法，其特征是所述愈伤组织诱导步骤为：所述外植体为长0.5cm、宽0.2cm、且表面带有3～4道手术刀划痕的长方体。
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