CN104871972B - 有效控制西瓜不定芽水渍化现象发生的高频再生体系建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为西瓜品种‘Crimson Sweet’和‘黑孩儿’高效再生体系的建立方法，属于植物生物技术领域。有效控制西瓜不定芽水渍化现象发生的高频再生体系建立方法，该方法步骤为以2个品种5 d苗龄成熟胚子叶和下胚轴为材料，在不定芽诱导培养基中获得不定芽，不定芽在芽伸长培养基上培养2‑3周后转移至生根培养基，最终获得再生植株。通过调控不定芽诱导、芽伸长和生根培养基中不同激素的浓度，建立了2个品种的高频再生体系，再生率最高分别为83.3%和79.17%，同时每个子叶基端部分外植体诱导不定芽数可达为3‑7个。并且以‘Crimson Sweet’材料的再生体系进行了农杆菌介导遗传转化，获得了抗西瓜枯萎病效应蛋白FonSix6的转基因植株。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞工程中植物组织培养领域，建立了2个西瓜品种高频再生体系，可用于农杆菌或者基因枪介导的遗传转化且可做为培养研究基础。
背景技术
西瓜[Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nadai]是重要的世界性水果，其食用价值及保健价值较高，在全球十大果品中位居第5位。2013年，我国西瓜种植面积约为1.83×106 hm2，总产量约为7.29×107 t，面积和产量分别占世界的54%和60%以上，均居世界第一位（FAOSTAT, 2014）。虽然目前市场上西瓜品种类型较多，但复合抗性的品种还不多，与此同时西瓜种质资源缺乏、遗传基础狭窄和病虫害等因素严重影响了西瓜的品质和产量。由于西瓜常规遗传育种周期长、难度大和遗传性状不稳定，而转基因技术具有操作简单、成本低、插入片段确定性好、转基因表达和遗传稳定等优点。因此，采用基因工程技术手段进行种质创新、培育优质、高产的抗病新品种已成为当前西瓜遗传育种研究的热点。
在西瓜高效遗传转化体系的建立中，高效再生体系的建立是转基因成功的关键，而再生体系又受基因型、外植体类型和非生物因素如培养基的类型和培养环境条件等因素的影响。虽然不同品种西瓜再生体系相继建立起来，但是再生率较低。本专利从不同外植体来源、激素水平和基因型等因素上研究西瓜再生体系，建立了2个西瓜材料较稳定高频再生体系，为进一步遗传转化奠定基础。同时，在此基础上对‘Crimson Sweet’进行了遗传转化，获得了抗西瓜枯萎病效应蛋白FonSix6的转基因植株，进一步证明了此再生体系的实用性。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种有效控制西瓜不定芽水渍化现象发生的高频再生体系建立方法，该方法建立了2个西瓜材料高频的再生体系，该方法不定芽的诱导率能达66.67%-83.3%，每个外植体不定芽数为3-7个，伸长率达70%-90%，再生植株生长良好，能够应用于遗传转化。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
有效控制西瓜不定芽水渍化现象发生的高频再生体系建立方法，该方法包括以下步骤：
1） 将西瓜材料‘黑孩儿’和‘Crimson Sweet’种子小心去壳，用70%的酒精消毒1min，无菌去离子水冲洗2次，0.1%的升汞溶液中缓慢震荡10 min，无菌去离子水冲洗3-5次，无菌滤纸吸干后移至1/2MS培养基黑暗条件下培养；
2） 取经步骤1）在1/2MS培养基上暗培养5 d无菌苗子叶和其对应的下胚轴，子叶横切为二，然后基端部分一切为二，同样顶端部分也一切为二，表面朝上接种于添加6-苄氨基腺嘌呤和吲哚乙酸的MSH芽诱导培养基，30 d后不定芽增殖形成大量的丛生芽；
3） 将步骤2）获得的丛生芽切割成单芽接种含有6-糠基氨基嘌呤或6-BA、IAA和赤霉素的伸长培养基中培养2W；
4）将张至2-3 cm的小苗接种至含有萘乙酸或者IAA的1/2MS的生根培养基中，4-6W后90%的植株均可生根；
5）将生根的再生苗在组培室开盖炼苗2 d，然后再在温室中炼苗1-2 d，移入由蛭石、珍珠岩和营养土组成的基质中在温室培养。
作为优选，所述步骤1）中西瓜种子应该尽量挑选饱满干净的种子，暗培养温度为25±1℃。
作为优选，所述步骤2）中MSH基本培养基组成为：大量元素、微量元素和铁的量以MS培养基配方为准，而维生素以SH培养基配方为准，芽诱导培养基中6-BA的浓度为1、2、3、4、5、6、7和10 mg/L，IAA的浓度为0.2、0.5和1mg/L，琼脂7 mg/L，蔗糖3%。
作为优选，所述步骤3）中伸长培养基为MSH且添加0.2 mg/L KT，琼脂7 mg/L，蔗糖3%，或 MSH中添加1 mg/L GA3，1 mg/L IAA，2 mg/L GA3，琼脂7 mg/L，蔗糖3%。
作为优选，所述步骤4）中生根培养基为1/2MS且添加0.2 mg/L NAA或者0.5 mg/LIAA，琼脂7 mg/L，蔗糖2%。
作为优选，所述步骤5）中在移苗时一定要洗净根部的培养基，并且移苗不能在中午进行尽量在傍晚时移苗，新移的西瓜苗应该用塑料袋包住以防水分蒸发过快导致小苗死亡，并且移栽基质中蛭石、珍珠岩和营养土的体积比为1：1：2。
作为优选，所述西瓜材料为‘黑孩儿’或‘Crimson Sweet’。
本发明由于采用了上述的技术方案，具有以下的特点：
（1）比较成熟胚子叶和下胚轴作为外植体对不定芽的诱导，发现5 d苗龄无菌苗的子叶的诱导率远远高于下胚轴。
（2）子叶基端部分不定芽诱导率高于顶端部分诱导率，所以选取子叶基端部分作为适宜的外植体。
（3）选用SH培养基配方中的维生素替代MS培养基配方中的维生素，可以有效抑制不定芽水渍化的发生。
（4）为建立‘黑孩儿’和‘Crimson Sweet’高频再生体系培养基的研究。获得‘黑孩儿’品种不定芽诱导最佳培养基为MSH+2 mg/L 6-BA，诱导率最高为83.3%，而适用于‘Crimson Sweet’不定芽诱导最佳培养基为MSH+1 mg/L BA+0.2 mg/L IAA，诱导率最高为79.17%。并且试验发现70%-90%不定芽在2种伸长培养基上都能伸长至2-3 cm。而2种生根培养基对生根效果没有较大的影响，第一种表现为粗壮，而第二种表现为细长，但是对后期的生长没有影响。
附图说明
图1不同质量浓度6-BA对2个品种不定芽诱导的影响。
图2不同质量浓度BA和IAA组合对2个品种不定芽诱导的影响。
图3以成熟胚子叶为外植体西瓜再生体系的建立（以品种‘Crimson Sweet’再生过程为例）
A: 诱导的不定芽；B: 不定芽的伸长；C: 芽的生根；D: 再生植株。
图4 ‘Crimson Sweet’农杆菌转化植株的再生
A: 未转化重组质粒的子叶在不定芽诱导培养基上；B: 未转化重组质粒的子叶在不定芽诱导筛选培养基上；C: 转化重组质粒的子叶在诱导筛选培养基上分化出的抗性芽；D: 抗性芽的伸长；E: 抗性植株的生根；F: 转移至温室中结瓜的阳性植株。
图5 ‘Crimson Sweet’转抗枯萎病效应蛋白FonSix6转基因植株PCR鉴定；
Lane M: Marker DL2000
Lane1-6: 转pBI-SIX6‘Crimson Sweet’ T0代植株
Lane 7: ‘Crimson Sweet’未转基因植株（阴性对照）
Lane 8: 水（阴性对照）
Lane 9: pBI-SIX6质粒（阳性对照）。
具体实施方式
1.材料与方法
1.1 实验材料：
‘黑孩儿’由浙江省农科院蔬菜所选育的设施西瓜新品种；‘Crimson Sweet’为课题组保存的试验材料，是纯合二倍体。
1.2 外植体获得
将西瓜材料‘黑孩儿’和‘Crimson Sweet’种子小心去壳，用70%的酒精消毒1 min，无菌去离子水冲洗2次，0.1%的升汞溶液中缓慢震荡10 min，无菌去离子水冲洗3-5次，无菌滤纸吸干后移至1/2MS培养基黑暗条件下培养，以5 d苗龄子叶和下胚轴为外植体。
1.3 培养基
无菌苗培养及再生植株生根时以MS为基本培养基，不定芽诱导及伸长时还是以MS为基本培养基，但用SH培养基配方中维生素替换MS培养基配方中维生素的比例，具体为：不定芽诱导培养基：MSH+6-BA（1、2、3、4、5、6、7和10 mg/L）和MSH+6-BA（1、2、3、4、5、6、7和10mg/L）+IAA（0.2、0.5和1 mg/L）
芽伸长培养基：MSH+0.2 mg/L KT和MSH+1 mg/L GA3+1 mg/L IAA+2 mg/L GA3
生根培养基：1/2MS+0.2 mg/L NAA或者1/2MS+0.5 mg/L IAA
然后附加琼脂和蔗糖，pH=5.85。
1.4 培养条件
无菌苗的培养为黑暗培养，其余培养为条件为16 h光照，8 h黑暗，光强2000 Lx，温度25±1℃。
1.5 不定芽培养基中激素的使用及组合
2.结果与分析
2.1 不同外植体不定芽的诱导
利用5 d苗龄成熟胚子叶和下胚轴诱导不定芽，结果见下表。
从上表可以看出，成熟胚子叶基端部分不定芽的诱导率要远远高于顶端部分和下胚轴诱导率，因此选用成熟胚子叶基端部分作为最佳的外植体。
2.2 6-BA不同浓度对4个品种芽诱导的影响
以MSH培养基为基本培养基，附加不同浓度的6-BA。培养45 d后，统计不定芽的诱导率，发现不同质量浓度的6-BA对2个不同品种不定芽诱导率有很大的差别（图1）。其中当6-BA的质量浓度为2 mg/L时，‘黑孩儿’不定芽诱导率最高为83.3%，而当6-BA的质量浓度为1 mg/L时，‘Crimson Sweet’ 不定芽诱导率最高为为66.67%。
2.3不同浓度6-BA和IAA组合对4个品种芽诱导的影响
同样以MSH培养基为基本培养基，附加不同浓度的6-BA和IAA。图2为不同质量浓度BA和IAA组合对2个品种不定芽诱导的影响，其中A1B1: 1 mg/L BA+0.2 mg/L IAA, A1B2:1 mg/L BA+0.5mg/L IAA, A1B3: 1 mg/L BA+1 mg/L IAA; A2B1: 2 mg/L BA+0.2 mg/LIAA, A2B2: 2 mg/L BA+0.5mg/L IAA, A2B3: 2 mg/L BA+1 mg/L IAA; A3B1: 3 mg/L BA+0.2 mg/L IAA, A3B2: 3 mg/L BA+0.5mg/L IAA, A3B3: 3 mg/L BA+1 mg/L IAA; A4B1:4 mg/L BA+0.2 mg/L IAA, A4B2: 4 mg/L BA+0.5mg/L IAA, A4B3: 4 mg/L BA+1 mg/LIAA; A5B1: 5 mg/L BA+0.2 mg/L IAA, A5B2: 5 mg/L BA+0.5mg/L IAA, A5B3: 5 mg/LBA+1 mg/L IAA; A6B1: 6 mg/L BA+0.2 mg/L IAA, A6B2: 6 mg/L BA+0.5mg/L IAA,A6B3: 6 mg/L BA+1 mg/L IAA; A7B1: 7 mg/L BA+0.2 mg/L IAA, A7B2: 7 mg/L BA+0.5mg/L IAA, A7B3: 7 mg/L BA+1 mg/L IAA; A8B1: 10 mg/L BA+0.2 mg/L IAA, A8B2:10 mg/L BA+0.5mg/L IAA, A8B3: 10 mg/L BA+1 mg/L IAA。从图2中可以看出，当2 mg/L6-BA和0.2 mg/L IAA配合使用时，‘黑孩儿’不定芽的诱导率最高为70%，而当1 mg/L 6-BA和0.2 mg/L IAA配合使用时，‘Crimson Sweet’ 不定芽诱导率最高为为79.17%。同时试验发现，在此过程很少有水渍化现象发生，从而在很大程度避免了其他研究者报道的水渍化严重的现象。
综上，适用于‘黑孩儿’和‘Crimson Sweet’不定芽诱导最佳的培养基配方为：MSH+2 mg/L BA；MSH +1 mg/L BA+0.2 mg/L IAA。
2.4不定芽的伸长和生根
诱导获得的不定芽在设定的2种伸长培养基上能够正常生长伸长，实验发现2种培养基对不定芽的伸长生长没有明显的差异。同样伸长的芽在2种生根培养基上能够正常生根。西瓜再生过程系列见图3（以品种‘Crimson Sweet’再生过程为例）。
2.5再生植株的移栽：
炼苗结束之后，把苗移栽至准备好的基质中（蛭石、珍珠岩和营养土的体积比为1：1：2）。由于西瓜再生苗不好移栽，所以应注意：
①移栽时一定要洗净根部的培养基；
②移苗不能在中午进行尽量在傍晚时移苗；
③应该用塑料袋包住以防水分蒸发过快导致小苗死亡。
该再生体系实用实例：
采用农杆菌介导法，侵染由此再生体系获得的成熟胚子叶，经过抗性芽的诱导筛选，最终获得转西瓜抗枯萎病效应蛋白FonSix6的转基因植株（图4）。经PCR（图5）鉴定检测其转化效率为12.5%。这是一次成功运用该技术的实例。
Claims (4)
1.有效控制西瓜不定芽水渍化现象发生的高频再生体系建立方法，该方法包括以下步骤：
1） 将西瓜材料‘黑孩儿’种子小心去壳，用70% 的酒精消毒1 min，无菌去离子水冲洗2次，0.1% 的升汞溶液中缓慢震荡10 min，无菌去离子水冲洗3-5 次，无菌滤纸吸干后移至1/2MS 培养基黑暗条件下培养；
2） 取经步骤1）在1/2MS 培养基上暗培养5天的‘黑孩儿’的无菌苗子叶和其对应的下胚轴，子叶横切为二，然后基端部分一切为二，同样顶端部分也一切为二，表面朝上接种于添加6- 苄氨基腺嘌呤的MSH 芽诱导培养基，30 天后不定芽增殖形成大量的丛生芽；所述MSH芽诱导培养基指，以MS 培养基配方为基础，其维生素含量替换为SH 培养基中的维生素含量，且6-苄氨基腺嘌呤在所述MSH 芽诱导培养基中的浓度为2mg/L；
3） 将步骤2）获得的子叶基端部分形成的丛生芽切割成单芽接种至伸长培养基中培养2 周；所述伸长培养基指MSH培养基中添加1 mg/L GA3，1 mg/L IAA，2 mg/L GA3，琼脂7 mg/L，蔗糖3%4）将长至2-3 cm 的小苗接种至生根培养基中，所述生根培养基为1/2MS 中添加0.2 mg/L NAA 或者0.5 mg/L IAA，琼脂7 mg/L，蔗糖2%；
5）将生根的再生苗在组培室开盖炼苗2天，然后再在温室中炼苗1-2天，移入由蛭石、珍珠岩和营养土组成的基质中在温室培养。
2.根据权利要求1 所述的有效控制西瓜不定芽水渍化现象发生的高频再生体系建立方法，其特征在于：所述步骤1）中西瓜种子应该挑选饱满干净的种子，暗培养温度为25±1℃。
3.根据权利要求1 所述的有效控制西瓜不定芽水渍化现象发生的高频再生体系建立方法，其特征在于：所述步骤3）中伸长培养基替换为MSH 且添加0.2 mg/L KT，琼脂7 mg/L，蔗糖3%。
4.根据权利要求1 所述的有效控制西瓜不定芽水渍化现象发生的高频再生体系建立方法，其特征在于：所述步骤5）中在移苗时洗净根部的培养基，在傍晚时移苗，新移的西瓜苗用塑料袋包住以防水分蒸发过快导致小苗死亡，并且移栽基质中蛭石、珍珠岩和营养土的体积比为1 ：1 ：2。
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