CN102172217B

CN102172217B - 玉米体细胞胚胎的诱导方法

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Publication number: CN102172217B
Application number: CN 201110024436
Authority: CN
Inventors: 原亚萍; 李颖; 吴颖; 苏胜忠; 李宏魁; 李世鹏; 单晓辉
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2011-01-24
Filing date: 2011-01-24
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2031-01-24
Also published as: CN102172217A

Abstract

玉米体细胞胚胎的诱导方法属生物工程技术领域，本发明包括：在愈伤组织诱导培养基中诱导玉米外植体；将上述诱导培养的外植体转到继代培养基中；在继代培养基上将体胚扩繁；将扩繁后的体胚放入分化培养基中进行分化成苗。本发明可大量高效地诱导出玉米体细胞胚胎，诱导出的玉米体细胞胚胎具有可通过长时间继代无限繁殖、无外源激素调控就可两极同时分化、分化率和成苗率极高的特点，且因分化过程中无外源激素的影响，故玉米成苗时期的体细胞突变率相应降低，本发明可为多种转基因方法(如：农杆菌介导法、基因枪法)提供优良实用的受体系统。

Description

玉米体细胞胚胎的诱导方法

技术领域

本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种玉米体细胞胚胎的诱导方法。

背景技术

玉米是一种重要的粮食作物，2010年播种面积达到2900多万hm²，玉米不仅在我国农业生产中占有重要地位，而且在工业生产中的应用也越来越广泛。

在玉米遗传转化中，具备胚性愈伤组织培养和再生体系的受体转化系统是首选方法。玉米受体系统诱导愈伤的外植体一般选择细胞分化程度低、分生能力强的各种组织部位，如：花粉、花药、幼穗、幼胚、子叶节、下胚轴、茎节和芽尖等。Green和Phillips(1975)首次报道从玉米幼胚诱导出愈伤组织，并成功获得了再生植株，此后大部分研究者都利用玉米幼胚作为玉米组织培养的外植体，但作为遗传转化受体系统的玉米幼胚诱导愈伤组织和再生植株时，还存在诸多问题，如愈伤组织长期继代扩繁、再生植株分化时激素使用、分化率低、畸形苗多等问题。

植物体细胞胚胎发生是指植物体细胞在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚类似的发育途径形成新个体的形态发生过程。1958年Steward从胡萝卜悬浮细胞系中获得体胚，次年，Reinert从固体培养的胡萝卜愈伤组织中获得体胚。体细胞胚胎不仅是细胞全能性的具体体现，而且重演了合子胚形态发生的过程，作为胚胎发生的一种特殊现象，体胚发生有着深远的意义。植物胚胎发生是遗传转化的基础，由于植物体细胞胚胎发生是由单细胞起源，每一个细胞都发育成一个完整植株，且体胚具有两极性，可直接生成小植株，不会出现嵌合体问题，遗传稳定性好，总之，体胚在植物遗传转化、极性建立及组织系统分化研究方面应用广阔。

体胚多是从悬浮培养的细胞系和愈伤组织中诱导获得，近几年来，研究者在胡萝卜、紫花苜蓿、菊苣、松柏等植物上成功诱导出体胚，但玉米作为主要遗传转化受体材料，目前为止还未见成功获得玉米体细胞胚胎的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可大规模繁殖，且成苗率极高的玉米体细胞胚胎的诱导方法。

本发明包括下列步骤：

1.在愈伤组织诱导培养基中诱导玉米外植体；

2.将上述诱导培养的外植体转到继代培养基中；

3.在继代培养基上将体胚扩繁；

4.将扩繁后的体胚放入分化培养基中进行分化成苗。

步骤1中所述的玉米外植体为授粉后15天、位于玉米幼穗中部、长度在2.3mm-2.5mm之间的玉米幼胚，玉米幼胚在诱导培养基上诱导愈伤培养20-30天；所述的玉米为Y412、Y423自交系。

步骤1中所述的愈伤组织诱导培养基包括：N6大量、MS有机、B5微量、铁盐、2mg/l的2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、500mg/l的水解酪蛋白(CH)、600mg/l脯氨酸(L-pro)、200mg/l天冬氨酸(Asp)、30g/l蔗糖(sugar)、6.5g/l琼脂(agar)。

步骤2和3中所述的继代培养基包括：N6大量、MS有机、B5微量、铁盐、2mg/l的2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、500mg/l的水解酪蛋白(CH)、600mg/l脯氨酸(L-pro)、200mg/l天冬氨酸(Asp)、30g/l蔗糖(sugar)、6.5g/l琼脂(agar)和3g/l-15g/l甘露醇。

步骤1中所述的愈伤组织诱导培养时间为25天。

步骤3中所述的体胚15天扩繁一次。

步骤4中分化培养基包括：N6大量、MS有机、B5微量、铁盐、500mg/l的水解酪蛋白(CH)、600mg/l脯氨酸(L-pro)、200mg/l天冬氨酸(Asp)、6.5g/l甘露醇、30g/l蔗糖(sugar)、6.5g/l琼脂(agar)。

步骤4中所述的将扩繁后的体胚放入分化培养基中进行分化成苗，需满足下列条件：

4.1 体胚分化光照强度为7500lux；

4.2 体胚分化光培养时间为12小时，暗培养时间为8小时；

4.3 体胚分化光培养温度为24℃，暗培养温度为22℃；

4.4 体胚分化湿度为80％。

下面对本发明作详细描述：

一、在愈伤组织诱导培养基中诱导玉米外植体

在本发明中玉米的外植体首先在愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤。此步骤中选用授粉后15天左右、位于玉米幼穗中部、大小在2.3mm-2.5mm之间的幼胚；将幼穗苞叶剥开，用酒精反复喷洒消毒，取出幼胚盾片向上放入愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤，培养时间在20-30天之间。

二、将所述培养的外植体转到继代培养基中

为使上述的愈伤组织诱导出体细胞胚胎，需将愈伤组织放入继代培养基中，在放入愈伤组织前，应根据愈伤组织状态，调节继代培养基中甘露醇的含量：愈伤表现为水渍化严重或有褐化出现，则提高甘露醇含量(8-15g/l)；表现为发干发硬，或有白色硬质不定根出现，则减少甘露醇含量(3-6g/l)；当愈伤呈现黄色疏松小颗粒状时，即为正常状态(体胚)，甘露醇含量应保持在6.5g/l不变，培养时间为25天。

三、在继代培养基上将体胚扩繁

为使上述方法中获得玉米体胚达到实验所需数量，需将其放入继代培养基中扩繁。扩繁需要散光培养，有肉眼刚可见的光强即可，光线太强易导致体胚过早分化；也不能完全暗光培养，否则会导致体胚扩繁速度减慢，并伴有小范围褐化出现，扩繁周期维持在15-20天之间最佳，周期过长和过短都会影响体胚的状态，从而影响扩繁的速度和质量。

四、将扩繁后的体胚放入分化培养基中进行分化成苗

为使上述方法中获得玉米体胚分化成苗，需将其放入分化培养基中。体胚分化前应在继代培养基中培养15-20天，然后取大小在1cm以上的体胚块放入分化培养基中进行分化，体胚分化时光培养时间为12小时，光照强度为7500lux，培养温度24℃。体胚分化的暗培养时间为8小时，培养温度22℃，体胚分化所需湿度为80％。

本发明建立的受体系统具有以下优点：

1.诱导出的体胚能够长时间的无限增殖，可以减少材料的消耗，并且源源不断地为玉米遗传转化提供受体材料，为转基因玉米的批量生产打下了基础。

2.诱导出的体胚能够在无外源激素调控下自行分化，同时生根成苗，消除了外源激素在分化时对植物的不利影响，同时为体胚分化过程中内源激素的研究提供了材料。

3.本发明中的受体系统再生率高达300％，畸形苗出现概率极低，是其他受体系统所无法比拟的。

4.各种转基因方法都可与本受体系统联合使用，也可为体胚内部的生理和遗传研究提供材料。

综上所述，本发明可大量高效地诱导出玉米体细胞胚胎，诱导出的玉米体细胞胚胎具有可通过长时间继代无限繁殖、无外源激素调控就可两极同时分化、分化率和成苗率极高的特点，且因分化过程中无外源激素的影响，故玉米成苗时期的体细胞突变率相应降低，本发明可为多种转基因方法(如：农杆菌介导法、基因枪法)提供优良实用的受体系统。

附图说明

图1为玉米自交系Y412、Y423自交授粉后15天左右，位于幼穗中部的玉米幼胚的照片

图2为诱导培养基中诱导出的愈伤状态的照片

图3为继代培养基中体胚状态的照片

图4为扩繁出大量体胚的照片

图5为体胚的照片

图6为继代培养后选择进行分化的愈伤的照片

图7为光照3天后的分化状态的照片

图8、图9、图10为根芽同时分化的照片

图11、图12为光照10天后的分化状态的照片

图13、图14为分化成苗的照片

图15、图16为同一块愈伤组织分化植株的照片

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细描述：

附图1-16是实施例中玉米自交系幼胚诱导成体细胞胚胎，并完成植株再生的技术流程和外植体各个发育阶段的照片。

实施例

一、材料来源及外植体的选择

本发明的试验材料是从50个不同玉米自交系中筛选得到的，将50个玉米自交系的幼胚放入愈伤组织诱导培养基中，将诱导20-30天的愈伤组织放入继代培养基中，自交系1和自交系2两个材料出现黄色疏松小颗粒状的胚性状态，放入分化培养基后，在未加入外源激素情况下同时生根长芽，分化率极高。

2008、2009年春季将两种自交系播种，在严格玉米自交授粉条件下，获得自交系幼胚。在超净工作台内取上述自交系授粉后15天左右的幼穗进行酒精喷洒法消毒，即将幼穗苞叶剥开，用酒精反复喷洒消毒3-5次，将位于玉米幼穗中部大小在2.3mm-2.5mm之间的幼胚，盾片向上放在诱导愈伤培养基中，所需培养温度为23℃，完全暗培养，培养时间在20-30天之间；取幼胚前，幼穗在4℃条件下过夜效果更佳。

二、培养基的制备

1.愈伤组织诱导培养基：

N6大量、MS有机、B5微量、铁盐、2mg/l的2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、500mg/l的水解酪蛋白(CH)、600mg/l脯氨酸(L-pro)、200mg/l天冬氨酸(Asp)、30g/l蔗糖(sugar)、6.5g/l琼脂(agar)

2.继代培养基：

N6大量、MS有机、B5微量、铁盐、2mg/l的2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、500mg/l的水解酪蛋白(CH)、600mg/l脯氨酸(L-pro)、200mg/l天冬氨酸(Asp)、30g/l蔗糖(sugar)、6.5g/l琼脂(agar)和3g/l-15g/l甘露醇。

这是体胚产生关键时期，需根据愈伤组织状态调节继代培养基中甘露醇的含量。愈伤表现为水渍化严重或有褐化出现，则提高甘露醇含量(8-15g/l)，表现为发干发硬，或有白色硬质不定根出现则减少甘露醇含量(3-6g/l)。当愈伤呈现黄色疏松小颗粒状时，即为正常状态(体胚)，甘露醇含量应保持在6.5g/l不变。

3.分化培养基：

N6大量、MS有机、B5微量、铁盐、500mg/l的水解酪蛋白(CH)、600mg/l脯氨酸(L-pro)、200mg/l天冬氨酸(Asp)、6.5g/l甘露醇、30g/l蔗糖(sugar)、6.5g/l琼脂(agar)。

三、培养条件

诱导愈伤所需条件为：完全暗培养，温度为23℃。

继代培养所需条件为：需要散光培养，有肉眼刚可见的光强即可，温度为23℃。

扩繁培养所需条件为：需要散光培养，有肉眼刚可见的光强即可，光线太强易导致体胚过早分化，也不能完全暗光培养，否则会导致体胚扩繁速度减慢并伴有小范围褐化出现，温度为23℃。

分化培养所需条件为：体胚分化时光培养时间为12小时，暗培养时间为8小时；所需光照强度为7500lux；体胚分化光培养温度为24℃；暗培养温度为22℃。体胚分化所需湿度为80％。

在超净工作台内取上述自交系授粉15天的幼穗进行酒精喷洒法消毒，即将幼穗苞叶剥开，用酒精反复喷洒消毒3-5次。将位于玉米幼穗中部的大小在2.3mm-2.5mm之间的幼胚，盾片向上放在诱导愈伤培养基中，所需培养温度为23℃，完全暗培养，培养时间在20-30天之间；将诱导20-30天后的愈伤组织放入继代培养基中培养25天，出现黄色疏松小颗粒状的胚性状态后，开始继代扩繁；将松散的愈伤颗粒平铺在培养基表面聚成小团，扩繁周期在15-20天之间；扩繁后即可分化，分化时选用直径超过1cm的愈伤块放入分化培养基中，在分化培养所需条件下直接分化即可。

Claims

1.一种玉米体细胞胚胎的诱导方法，该方法包括步骤：

(1) 在愈伤组织诱导培养基中诱导玉米外植体，其中：愈伤组织诱导培养基包括： 2mg/l的2,4-二氯苯氧基乙酸、500mg/l的水解酪蛋白、600mg/l脯氨酸、200mg/l天冬氨酸、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂；玉米外植体为授粉后15天、位于玉米幼穗中部、长度在2.3mm-2.5mm之间的玉米幼胚；玉米幼胚在诱导培养基上诱导愈伤培养20-30天；

(2) 将上述诱导培养的外植体转到继代培养基中，继代培养基包括：2mg/l的2,4-二氯苯氧基乙酸、500mg/l的水解酪蛋白、600mg/l脯氨酸、200mg/l天冬氨酸、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂和3g/l-15g/l甘露醇；

(3) 在继代培养基上将体胚扩繁，体胚15天扩繁一次；

(4) 将扩繁后的体胚放入分化培养基中进行分化成苗，需满足下列条件：

4.1 体胚分化光照强度为7500lux；

4.2 体胚分化光培养时间为12小时，暗培养时间为8小时；

4.3 体胚分化光培养温度为24℃，暗培养温度为22℃；

4.4 体胚分化湿度为80%；

分化培养基包括：500mg/l的水解酪蛋白、600mg/l脯氨酸、200mg/l天冬氨酸、6.5g/l甘露醇、30g/l蔗糖、6.5g/l琼脂。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的玉米为Y412、Y423自交系。