CN103155871B - 一种铁皮石斛种苗高效快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛种苗高效繁殖的方法。步骤包括a.选用铁皮石斛茎尖或无菌幼苗为外植体，进行拟原球茎的诱导及增殖培养；b.拟原球茎的分化成苗；c.丛生幼苗的生根壮苗培养；d.无菌苗的炼苗及移栽。本发明利用茎尖和无菌幼苗为外植体，避免了仅以茎芽及顶芽为外植体诱导拟原球茎，外植体来源受限的问题，可大量、快速、持续获得成熟的拟原球茎，拟原球茎发生率最高达99％，幼苗分化系数高达50株/0.1g拟原球茎，获取种苗周期仅需4个月，种苗整齐，生根率100％，根长5cm左右且根数多达10条/丛，移栽成活率可高达95％以上等优点，达到缩短种苗周期、提高繁殖系数、种质来源不受局限的目标。可快速生产大批量的种苗，适用于大规模生产。

Description

一种铁皮石斛种苗高效快繁方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体是一种铁皮石斛种苗高效快繁方法，该方法通过植物组织培养技术进行铁皮石斛种苗高效快繁。

背景技术

铁皮石斛，民间俗称“药中黄金”，是一种附生、多年生的草本植物，开花多，平均自然结实率仅为0.31％，且种子萌发率很低，因而种子资源有限。自秦汉的《神农本草经》将铁皮石斛入列为上品，后续的《本草纲目》、《道藏》等陆续有相关记载，并将其列为中华九大仙草之首。2010年版《中华人民共和国药典》将铁皮石斛单列出来，据记载，其主要成分为多糖、石斛碱、氨基酸和微量元素等，具有增强免疫功能、抗肿瘤、抗衰老和抑制血栓形成等多种功效。现已制成多种中成药，著名的有心血管药“脉络宁”，眼科药“石斛夜光丸”以及咽喉疾病用的“慢咽宁”等。目前，铁皮石斛的鲜条年产量还未达200吨，需求量却达3万吨/年，使得野生资源进一步枯竭，成为濒危、珍稀、高附加值的资源性药材，其种植生产有很大的利润空间。

目前，铁皮石斛种苗主要通过种子人工栽培、扦插繁殖、器官再生、经愈伤组织的间接体胚再生及直接体胚再生等方式获取。专利文献CN102440130A所公开的发明创造，选取成熟自然开裂果实为外植体，以木屑、碎树皮、珍珠岩为基质，喷雾供给种胚萌发所需营养元素，通过种子自然繁殖来生产石斛种苗，石斛种子的萌发率可达75％左右。CN102499085A、CN102422811A、CN101803515A，以及CN101461328B、CN101933456B、CN1324946C的专利文献所公开的发明创造均以铁皮石斛蒴果为外植体，通过蒴果→原球茎→小苗→成苗的路线获取铁皮石斛种苗，此路线获得株高5cm以上的种苗，育苗周期最少需要5个月，最长达14个月，且此法增殖系数最高为10。CN101336589A及金银兵(中国农学通报.2009，25(12)：50-52)以扦插的方式进行铁皮石斛种苗繁殖，分别通过1‰高锰酸钾及6-BA溶液处理，相应诱导生根及长芽，前者生根率达92％，后者侧芽诱导率最高78％，前者一个分支诱导成一株苗，后者增殖系数最大为2.58，两者育苗周期为3～4个月。朱恩灿(公开号CN102369881A)、刘星华(公告号CN101548644B)，YIH-JUH SHIAU等(In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant2005，41：666-670)、Zhao等(Plant Cell Tiss Organ Cult，2007，90：131-139)以及刘健等(宁波农业科技，2012，1：14-16)以腋芽为外植体，通过器官再生的方式进行铁皮石斛种苗的繁殖，育苗周期4～8个月，幼苗再生率最高达78％，增殖系数最高达24.5。蒋武轩(公开号CN101653096A)、田芳(申请号CN102499092A)、滕正平(公开号CN102318561A)以及Zhao等(In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant，2008，44：178-185)以铁皮石斛种子、植株等为外植体，经由愈伤组织的间接体胚再生的方式进行铁皮石斛种苗繁殖，育苗周期6～11个月，愈伤组织的诱导率最高可达82％，增殖系数最高达50。孔祥莹(公告号CN101258835B)、苏有勇(公开号CN101180949A)以及王小霞(公开号CN101273709A)分别选取未展叶芽、茎芽、茎尖为外植体，经表面消毒后诱导拟原球茎，以直接体胚再生的方式繁殖铁皮石斛种苗，育苗周期6～7个月。张世定(公开号CN102282998A)、李跃宇(公告号CN102138415B)、赵兴兵(公告号CN102124936B)、李明焱(CN101352140B)以及滕士元(公告号CN101347101B)从炼苗大棚的设计、出瓶前管理、出瓶后处理、移栽基质选择等方面对铁皮石斛炼苗移栽进行了系统的研究。分别采用松树皮、苔藓+木屑混合物、砂砾岩+木炭+碎红砖+树皮/叶混合物、松木锯木+松木屑+泥炭+松木树皮混合物作为炼苗栽培基质，并辅以调整光照来使幼苗逐渐适应外部环境，移栽成活率达到95％以上。以上文献及专利的研究，为铁皮石斛规模化种植，缓解资源供应压力奠定了坚实的基础，但在铁皮石斛大规模种植时，仍存在不足：以种子为外植体，其种质来源受限、种苗周期与繁殖系数未能同时达到较好的效果；以腋芽为外植体的器官再生方式，其育苗周期较短，但增殖系数不高，且需要大量的外植体材料；现有的以茎芽及顶芽为外植体的体胚再生方式，虽然缩短了育苗周期，但最短也需要160天；另外，上述报道中根的诱导效率不高，只有2～5条/株，不利于移栽。目前市场存在巨大的供需缺口，因而亟需一种短时间内高效快繁出大批量铁皮石斛种苗的新方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种铁皮石斛种苗高效快繁方法，可以在相对短时间内高效扩繁出大批量石斛种苗。

本发明提供的一种铁皮石斛种苗快繁方法，主要包括以下步骤：

(1)拟原球茎诱导及增殖培养

选取铁皮石斛的茎尖或无菌幼苗接种于诱导培养基，诱导培养基为：(1/4～1)MS培养基+蔗糖20g/L～30g/L+琼脂8g/L～12g/L+TDZ(苯基噻二唑脲)0.5mg/L～4mg/L+NAA(萘乙酸)0.5mg/L～4mg/L+2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)0.5mg/L～2mg/L，进行拟原球茎的诱导及增殖培养，得到拟原球茎；

(2)拟原球茎分化培养

将上步培养所得拟原球茎转接于分化培养基，分化培养基为：MS培养基+蔗糖20g/L～30g/L+琼脂8g/L～12g/L+NAA0.25mg/L～2mg/L+6-BA(6-苄基腺嘌呤)2mg/L～10mg/L，进行分化成苗培养，得到丛生幼苗；

(3)丛生幼苗的生根壮苗

将上步中分化培养的丛生幼苗分株接种于生根壮苗培养基，生根壮苗培养基为：(1/4～3/4)MS培养基+蔗糖20g/L～30g/L+琼脂8g/L～12g/L+6-BA0.5mg/L～3mg/L+NAA0.25mg/L～4mg/L+IBA(吲哚丁酸)3mg/L～6mg/L+土豆提取物100g/L～400g/L+活性碳2g/L～5g/L，进行生根壮苗；

(4)炼苗移栽

自然光下炼苗，洗净培养基，移栽于水苔、松树皮、蛭石混合的基质上，维持基质含水量为50％～70％及空气湿度为40％～70％，室内温度控制在25℃±3℃，保持通风透气。

作为上述技术方案的改进，所述拟原球茎诱导及增殖培养、拟原球茎分化培养、丛生幼苗的生根壮苗的培养条件均为：培养温度25℃±3℃，光照培养时间8小时/天～16小时/天，光照强度：1500lx～3000lx，空气湿度60％～80％，pH值为5.5～6.0。

作为上述技术方案的进一步改进，所述的茎尖或无菌幼苗高为0.5cm～1.5cm；所述的拟原球茎诱导培养周期为10天～15天；所述的拟原球茎增殖培养周期为25～35天；所述的拟原球茎分化培养的培养周期为25天～30天；所述生根壮苗的培养周期为40天～50天。

作为上述技术方案的更进一步改进，步骤(4)中，所述炼苗移栽，炼苗7天～10天，以喷雾处理维持空气湿度及含水量，所述栽培基质中松树皮长宽在0.5cm～4cm，蛭石粒径为小于等于4mm，基质分三层，底层为1cm～3cm厚的水苔，中间为松树皮与蛭石按体积比2∶1～4∶1的比例混合，顶层为3cm～5cm厚的水苔。

本发明是一种利用拟原球茎再生途径高效快繁繁殖铁皮石斛种苗的方法的快繁方法。该方法是以铁皮石斛茎尖或无菌幼苗为外植体，组培过程中，通过采用高效激素组合、添加有机提取物、优化培养条件等措施，达到缩短种苗周期、提高繁殖系数、种质来源不受局限、快速生产大批量的种苗的目标。本发明所提供的方法具有外植体来源广泛，增殖系数可以高达50株/0.1g拟原球茎，获取种苗周期短，种苗整齐，生根率可以达到100％，且根长5cm以上且根数多达10条以上，移栽成活率最高可以达到99％以上等优点，可快速生产大批量的种苗，适用于大规模生产。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1：

选取0.5cm～1.5cm高的铁皮石斛芽尖，接种于拟原球茎诱导培养基：1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂10g/L+TDZ0.5mg/L+NAA1mg/L+2，4-D0.5mg/L，培养12天可见拟原球茎形成，发生率达92％，将原球茎接种于原诱导培养基上进行增殖培养，继代周期30天。

将增殖培养后的拟原球茎接种于拟原球茎分化培养基：MS培养基+蔗糖20g/L+琼脂10g/L+NAA2mg/L+6-BA10mg/L，经28天可以分化成1cm～2cm的丛芽簇，平均45个芽/0.1g拟原球茎。

将分化所得丛芽簇分成1～2个芽/株，接种至生根壮苗培养基；1/2MS培养基+蔗糖20g/L+琼脂10g/L+6-BA1mg/L+NAA1mg/L+IBA6mg/L+土豆提取物200g/L+2g/L活性碳，培养50天，生根率100％，植株平均株高7.8cm，平均根数13.8条，平均根长5.6cm。

总计约123天可获得株高5cm以上的优质种苗。

将壮苗培养所得瓶苗室内开盖炼苗7天，后取出洗净根部培养基，移入预先浸湿的栽培基质：水苔薄层(底层2cm)+松树皮蛭石混合物(体积比2∶1)+水苔薄层(顶层3cm)，松树皮长宽在0.5cm～4cm，蛭石粒径为小于等于4mm，维持基质含水量50％～70％，喷雾维持空气湿度为40％～70％，保持室内通风，移栽成活率可达98％以上。

上述无菌培养阶段的培养基pH值5.8，培养温度25℃±3℃，光照3000lx，空气湿度设定65％(实际65％±5％)，光照10小时/天，土豆提取物通过土豆条清水煮沸30min过滤制得。

上述移栽时期，栽培室内温度维持在25℃±3℃，栽培室选取向阴面位置，喷雾1～2次/天。

实施例2：

选取0.5cm～1.0cm高的铁皮石斛苗茎尖或无菌幼苗，接种于拟原球茎诱导培养基：MS+蔗糖20g/L+琼脂12g/L+TDZ1mg/L+NAA4mg/L+2，4-D0.5mg/L，培养10天可见拟原球茎形成，发生率达98％，将原球茎接种于原诱导培养基上进行增殖培养，继代周期30天。

将增殖培养后的拟原球茎接种于拟原球茎分化培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+NAA0.5mg/L+6-BA4mg/L，经30天可以分化成1cm～2cm的丛芽簇，约50个芽//0.1g拟原球茎。

将分化所得丛芽簇分成1～2个芽/株，接种至生根壮苗培养基；3/4MS培养基+蔗糖25g/L+琼脂12g/L+6-BA0.5mg/L+NAA1mg/L+IBA3mg/L+土豆提取物100g/L+3g/L活性碳，培养40天，生根率100％，植株平均株高5.5cm，平均根数10.2条，平均根长5.3cm。

总计115天可获得株高5cm以上的优质种苗。

将壮苗培养所得瓶苗室内开盖炼苗8天，后取出洗净根部培养基，移入预先浸湿的栽培基质：水苔薄层(底层3cm)+松树皮蛭石混合物(体积比3∶1)+水苔薄层(顶层4cm)，松树皮长宽在0.5cm～4cm，蛭石粒径为小于等于4mm，维持基质含水量50％～70％，喷雾维持空气湿度为40％～70％，保持室内通风，移栽成活率可达99％以上。

上述无菌培养阶段的培养基pH值6.0，培养温度25℃±3℃，光照3000lx，空气湿度设定65％(实际65％±5％)，光照8小时/天，土豆提取物通过土豆条清水煮沸30min过滤制得。

上述移栽时期，栽培室内温度维持在25℃±3℃，栽培室选取向阴面位置，喷雾1～2次/天。

实施例3：

选取0.5cm～1.5cm高的铁皮石斛茎尖或无菌幼苗，接种于拟原球茎诱导培养基：1/4MS+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+TDZ1mg/L+NAA1mg/L+2，4-D1mg/L，培养12天可见拟原球茎形成，发生率达96％，将原球茎接种于原诱导培养基上进行增殖培养，继代周期30天。

将增殖培养后的拟原球茎接种于拟原球茎分化培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂12g/L+NAA1mg/L+6-BA5mg/L，经25天可以分化成1cm～2cm的丛芽簇，约40个芽//0.1g拟原球茎。

将分化所得丛芽簇分成1～2个芽/株，接种至生根壮苗培养基；1/4MS培养基+蔗糖20g/L+琼脂8g/L+6-BA3mg/L+NAA2mg/L+IBA3mg/L+土豆提取物100g/L+4g/L活性碳，培养45天，生根率100％，植株平均株高6cm，平均根数8.4条，平均根长4.3cm。

总计112天可以获得株高6cm左右的优质种苗。

将壮苗培养所得瓶苗室内开盖炼苗7天，后取出洗净根部培养基，移入预先浸湿的栽培基质：水苔薄层(底层2cm)+松树皮蛭石混合物(体积比3∶1)+水苔薄层(顶层5cm)，松树皮长宽在0.5cm～4cm，蛭石粒径为小于等于4mm，维持基质含水量50％～70％，喷雾维持空气湿度为40％～70％，保持室内通风，移栽成活率可达95％以上。

上述无菌培养阶段的培养基pH值5.5，培养温度25℃±3℃，光照1500lx，空气湿度设定70％(实际70％±5％)，光照12小时/天，土豆提取物通过土豆条清水煮沸30min过滤制得。

上述移栽时期，栽培室内温度维持在25℃±3℃，栽培室选取向阴面位置，喷雾1～2次/天。

实施例4：

选取0.5cm～1.0cm高的铁皮石斛茎尖或无菌幼苗，接种于拟原球茎诱导培养基：1/4MS+蔗糖20g/L+琼脂10g/L+TDZ2mg/L+NAA0.5mg/L+2，4-D1mg/L，培养10天可见拟原球茎形成，发生率达96％，将原球茎接种于原诱导培养基上进行增殖培养，继代周期30天。

将增殖培养后的拟原球茎接种于拟原球茎分化培养基：MS培养基+蔗糖25g/L+琼脂8g/L+NAA0.25mg/L+6-BA2mg/L，经30天可以分化成1cm～2cm的丛芽簇，约45个芽//0.1g拟原球茎。

将分化所得丛芽簇分成1～2个芽/株，接种至生根壮苗培养基；1/2MS培养基+蔗糖20g/L+琼脂10g/L+6-BA0.5mg/L+NAA4mg/L+IBA3mg/L+土豆提取物100g/L+3g/L活性碳，培养45天，生根率100％，植株平均株高5.7cm，平均根数11.8条，平均根长5.4cm。

总计115天，可获得株高5cm以上的优质种苗。

将壮苗培养所得瓶苗室内开盖炼苗10天，后取出洗净根部培养基，移入预先浸湿的栽培基质：水苔薄层(底层1cm)+松树皮蛭石混合物(体积比2∶1)+水苔薄层(顶层5cm)，松树皮长宽在0.5cm～4cm，蛭石粒径为小于等于4mm，维持基质含水量50％～70％，喷雾维持空气湿度为40％～70％，保持室内通风，移栽成活率可达95％以上。

上述无菌培养阶段的培养基pH值5.5，培养温度25℃±3℃，光照1500lx，空气湿度设定75％(实际75％±5％)，光照16小时/天，土豆提取物通过土豆条清水煮沸30min过滤制得。

上述移栽时期，栽培室内温度维持在25℃±3℃，栽培室选取向阴面位置，喷雾1～2次/天。

实施例5：

选取0.5cm～1.0cm高的铁皮石斛茎尖或无菌幼苗，接种于拟原球茎诱导培养基：1/4MS+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+TDZ2mg/L+NAA2mg/L+2，4-D2mg/L，培养15天可见拟原球茎形成，发生率达80％，将原球茎接种于原诱导培养基上进行增殖培养，继代周期35天。

将增殖培养后的拟原球茎接种于拟原球茎分化培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂12g/L+NAA0.5mg/L+6-BA3mg/L，经30天可以分化成1cm～2cm的丛芽簇，约48个芽//0.1g拟原球茎。

将分化所得丛芽簇分成1～2个芽/株，接种至生根壮苗培养基；3/4MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂12g/L+6-BA2mg/L+NAA0.25mg/L+IBA6mg/L+土豆提取物200g/L+5g/L活性碳，培养50天，生根率100％，植株平均株高7.3cm，平均根数9.8条，平均根长6.4cm。

总计120天可获得株高5cm以上的优质种苗。

将壮苗培养所得瓶苗室内开盖炼苗8天，后取出洗净根部培养基，移入预先浸湿的栽培基质：水苔薄层(底层2cm)+松树皮蛭石混合物(体积比4∶1)+水苔薄层(顶层4cm)，松树皮长宽在0.5cm～4cm，蛭石粒径为小于等于4mm，维持基质含水量50％～70％，喷雾维持空气湿度为40％～70％，保持室内通风，移栽成活率可达95％以上。

上述无菌培养阶段的培养基pH值5.8，培养温度25℃±3℃，光照3000lx，空气湿度设定70％(实际70％±5％)，光照10小时/天，土豆提取物通过土豆条清水煮沸30min过滤制得。

上述移栽时期，栽培室内温度维持在25℃±3℃，栽培室选取向阴面位置，喷雾1～2次/天。

实施例6：

选取0.5cm～1.5cm高的铁皮石斛茎尖或无菌幼苗，接种于拟原球茎诱导培养基：MS+蔗糖25g/L+琼脂10g/L+TDZ2mg/L+NAA2mg/L+2，4-D1.0mg/L，培养12天可见拟原球茎形成，发生率达90％，将原球茎接种于原诱导培养基上进行增殖培养，继代周期30天。

将增殖培养后的拟原球茎接种于拟原球茎分化培养基：MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂10g/L+NAA1mg/L+6-BA3mg/L，经28天可以分化成1cm～2cm的丛芽簇，约45个芽//0.1g拟原球茎。

将分化所得丛芽簇分成1～2个芽/株，接种至生根壮苗培养基；1/4MS培养基+蔗糖20g/L+琼脂10g/L+6-BA2mg/L+NAA0.25mg/L+IBA5mg/L+土豆提取物200g/L+5g/L活性碳，培养50天，生根率100％，植株平均株高7.5cm，平均根数11.3条，平均根长5.6cm。

总计118天可获得株高5cm以上的优质种苗。

将壮苗培养所得瓶苗室内开盖炼苗9天，后取出洗净根部培养基，移入预先浸湿的栽培基质：水苔薄层(底层3cm)+松树皮蛭石混合物(体积比4∶1)+水苔薄层(顶层3cm)，松树皮长宽在0.5cm～4cm，蛭石粒径为小于等于4mm，维持基质含水量50％～70％，喷雾维持空气湿度为40％～70％，保持室内通风，移栽成活率可达95％以上。

上述无菌培养阶段的培养基pH值5.8，培养温度25℃±3℃，光照3000lx，空气湿度设定70％(实际70％±5％)，光照10小时/天，土豆提取物通过土豆条清水煮沸30min过滤制得。

上述移栽时期，栽培室内温度维持在25℃±3℃，栽培室选取向阴面位置，喷雾1～2次/天。

实施例7：

选取0.5cm～1.0cm高的铁皮石斛茎尖或无菌幼苗，接种于拟原球茎诱导培养基：MS+蔗糖30g/L+琼脂12g/L+TDZ4mg/L+NAA1mg/L+2，4-D1.5mg/L，培养15天可见拟原球茎形成，发生率达85％，将原球茎接种于原诱导培养基上进行增殖培养，继代周期30天。

经增殖培养数代后，将拟原球茎接种于拟原球茎分化培养基：MS培养基+蔗糖25g/L+琼脂10g/L+NAA0.5mg/L+6-BA5mg/L，经30天可以分化成1cm～2cm的丛芽簇，约50个芽//0.1g拟原球茎。

将分化所得丛芽簇分成1～2个芽/株，接种至生根壮苗培养基；1/2MS培养基+蔗糖25g/L+琼脂8g/L+6-BA2mg/L+NAA1mg/L+IBA6mg/L+土豆提取物400g/L+5g/L活性碳，培养50天，生根率100％，植株平均株高6.7cm，平均根数9.3条，平均根长5.2cm。

总计120天可获得株高5cm以上的优质种苗。

将壮苗培养所得瓶苗室内开盖炼苗8天，后取出洗净根部培养基，移入预先浸湿的栽培基质：水苔薄层(底层1cm)+松树皮蛭石混合物(体积比3∶1)+水苔薄层(顶层4cm)，松树皮长宽在0.5em～4cm，蛭石粒径为小于等于4mm，维持基质含水量50％～70％，喷雾维持空气湿度为40％～70％，保持室内通风，移栽成活率可达95％以上。

上述无菌培养阶段的培养基pH值5.5，培养温度25℃±3℃，光照1500lx，空气湿度设定75％(实际75％±5％)，光照12小时/天，土豆提取物通过土豆条清水煮沸30min过滤制得。

上述移栽时期，栽培室内温度维持在25℃±3℃，栽培室选取向阴面位置，喷雾1～2次/天。

本发明从外植体到供移栽幼苗只需4个月，缩短了育苗周期，拟原球茎成苗的增殖系数高达50株/0.1g拟原球茎，种苗生长整齐、健壮，叶色浓绿，根系发达，炼苗移栽方法简单易行、适合大批量生产。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种铁皮石斛种苗快繁方法，其特征在于，它包括如下步骤：

(1)拟原球茎诱导及增殖培养

选取铁皮石斛的茎尖或无菌幼苗接种于诱导培养基，茎尖或无菌幼苗高为0.5cm～1.5cm；诱导培养基为：1/4MS～1MS培养基+蔗糖20g/L～30g/L+琼脂8g/L～12g/L+TDZ（苯基噻二唑脲）0.5mg/L～4mg/L+NAA（萘乙酸）0.5mg/L～4mg/L+2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）0.5mg/L～2mg/L，进行拟原球茎的诱导及增殖培养，得到拟原球茎；

(2)拟原球茎分化培养

将上步培养所得拟原球茎转接于分化培养基，分化培养基为：MS培养基+蔗糖20g/L～30g/L+琼脂8g/L～12g/L+NAA0.25mg/L～2mg/L+6-BA（6-苄基腺嘌呤）2mg/L～10mg/L，进行分化成苗培养，得到丛生幼苗；

(3)丛生幼苗的生根壮苗

将上步中分化培养的丛生幼苗分株接种于生根壮苗培养基，生根壮苗培养基为：1/4MS～3/4MS培养基+蔗糖20g/L～30g/L+琼脂8g/L～12g/L+6-BA0.5mg/L～3mg/L+NAA0.25mg/L～4mg/L+IBA（吲哚丁酸）3mg/L～6mg/L+土豆提取物100g/L～400g/L+活性炭2g/L～5g/L，进行生根壮苗；

(4)炼苗移栽

自然光下炼苗，炼苗7天～10天，洗净培养基，移栽于水苔、松树皮、蛭石混合的基质上，该基质中松树皮长宽在0.5cm～4cm，蛭石粒径为小于等于4mm，基质分三层，底层为1cm～3cm厚的水苔，中间为松树皮与蛭石按体积比2：1～4：1的比例混合，顶层为3cm～5cm厚的水苔；以喷雾处理维持空气湿度及含水量，维持基质含水量为50%～70%及空气湿度为40%～70%，室内温度控制在25℃±3℃，保持通风透气。

2.根据权利要求1所述铁皮石斛种苗快繁方法，其特征在于，所述拟原球茎诱导及增殖培养、拟原球茎分化培养、丛生幼苗的生根壮苗的培养条件均为：培养温度25℃±3℃，光照培养时间8小时/天～16小时/天，光照强度：1500lx～3000lx，空气湿度60%～80%，pH值为5.5～6.0。

3.根据权利要求1所述铁皮石斛种苗快繁方法，其特征在于，步骤（1）中，所述诱导培养周期为10天～15天。

4.根据权利要求1所述铁皮石斛种苗快繁方法，其特征在于，步骤（1）中，所述增殖培养周期为25～35天。

5.根据权利要求1所述铁皮石斛种苗快繁方法，其特征在于，步骤（2）中，所述分化培养的培养周期为25天～30天。

6.根据权利要求1至5所述铁皮石斛种苗快繁方法，其特征在于，步骤（3）中，所述生根壮苗的培养周期为40天～50天。