CN109984035A - 一种建立金钗石斛再生体系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于金钗石斛技术领域，具体涉及一种建立金钗石斛再生体系的方法，包括以下步骤：(1)无菌苗的培养，包括启动的诱导、丛生芽的诱导、壮芽；(2)愈伤组织的诱导：将壮芽培养的小苗转接到培养基上，当壮芽培养的小苗根周围出现绿色的突起，绿色的突起周围出现绿色的组织时，进行继代培养，2‑3周后可见绿色的愈伤组织团块，直至诱导出直径超过1cm的愈伤组织团块；(3)愈伤组织的增殖：将直径超过1cm的愈伤组织团块切下，接种至培养基上，令愈伤组织增殖；培养温度24‑26℃，暗培养；(4)愈伤组织的分化；(5)壮芽和生根培养。本发明为提高其组培快繁的繁殖系数和实现对其进行分子生物学水平的遗传改良奠定基础。

Description

一种建立金钗石斛再生体系的方法
技术领域
本发明属于金钗石斛技术领域，具体涉及一种建立金钗石斛再生体系的方法。
背景技术
金钗石斛又名扁黄草、扁金钗、扁草、吊兰花等，2015年版中国药典中记载的石斛药材来源之一，产云南、贵州等地。金钗石斛以新鲜或干燥的茎入药。多糖和生物碱是金钗石斛的主要活性成分，据食品药品监督管理局统计显示已具有准字号的金钗石斛保健品中超过90％的产品是以多糖为有效成分。同时氨基酸和微量元素也较丰富，具有养胃生津、滋阴清热等作用。现代药理研究其具有明目、抗疲劳、抗衰老、增强免疫、抗肿瘤、抗辐射、增强体力、扩张血管、保肝等作用。具有良好的保健功能和营养价值。近年来市场需求不断增加。
除了药用之外，金钗石斛总状花序老茎中部以上部分发出，花大，白色带淡紫色先端，有时全体淡紫红色或除唇盘上具1个紫红色斑块外，其余均为白色；是是一种极具观赏价值花卉。
金钗石斛喜温暖，潮湿，半阴半阳的生长环境。根据中国药材资源普查结果，目前国内只有贵州赤水符合金钗石斛的野外种植条件。但金钗石斛种子极小，呈粉末状，长度为0.75～1.10mm，宽为0.09～0.20mm，野生条件下萌发率极低，种群的扩张十分困难。因此，研发其高效的快繁技术体系并辅之设施栽培措施，是金钗石斛种质资源的深度开发和推广应用的前提和基础。在诸多的人工繁殖技术中，组培快繁是最高效的方法之一。本技术基于金钗石斛的再生体系建立其组培快繁技术体系，为其快速繁殖奠定了技术方面的基础，同时也为实现对其进行分子生物学水平的遗传改良提供了可能，对于金钗石斛野生资源的保护同样具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种建立金钗石斛再生体系的方法，为提高其组培快繁的繁殖系数和实现对其进行分子生物学水平的遗传改良奠定基础。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种建立金钗石斛再生体系的方法，包括以下步骤：
(1)无菌苗的培养
(1-1)启动的诱导将灭菌的金钗石斛茎段接种到启动培养基上培养28-31d，之后继代培养40-50d，从金钗石斛茎段的结节处长出不定芽；培养温度24-26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间15-17h；所述启动培养基的组分为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+2.3-1.7mg/L 6-BA(6苄基腺嘌呤)+0.7-0.4mg/L NAA(萘乙酸)；
(1-2)丛生芽的诱导不定芽继代培养40d后，转接到丛生芽诱导培养基上进行丛生芽诱导，培养温度24-26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16-17h；所述丛生芽诱导培养基配方为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.8-1.2mg/L 6-BA+0.1-0.2mg/LNAA；
(1-3)壮芽丛生芽增殖培养40d后进行壮芽培养，将丛生芽接种到壮芽培养基上，每30d继代一次，共培养60-90d，直至丛生芽长成直径高3-4cm小植株；培养温度24-26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16-17h；所述壮芽培养基的组分为：蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.3-0.7mg/L 6-BA+0.05-0.15mg/L NAA；
(2)愈伤组织的诱导
将壮芽培养的小苗转接到蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+1.8-1.4mg/L 6-BA+0.15-0.25mg/L NAA培养基上，当壮芽培养的小苗根周围出现绿色的突起，绿色的突起周围出现绿色的组织时，进行继代培养，培养基配方为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.8-1.2mg/L 6-BA+0.05-0.15mg/L NAA，2-3周后可见绿色的愈伤组织团块，直至诱导出直径超过1cm的愈伤组织团块；培养温度24-26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间15-17h；
(3)愈伤组织的增殖
将直径超过1cm的愈伤组织团块切下，接种至蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+1.2-1.4mg/L 6-BA+0.05-0.15mg/L NAA的培养基上，令愈伤组织增殖；培养温度24-26℃，暗培养；
(4)愈伤组织的分化
将愈伤组织分成直径1.4-1.6cm的小块，转接到芽诱导培养基上，使愈伤组织分化出生芽；所述芽诱导培养基配方为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.8-1.2mg/L 6-BA+0.1-0.2mg/LNAA；
(5)壮芽和生根培养
将步骤(4)得到的愈伤组织分化出的芽转接到壮芽培养基上培养30-60d，壮芽培养基的组分为蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.3-0.7mg/L 6-BA+0.05-0.15mg/L NAA；再次在转接到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.2mg/L IBA(吲哚丁酸)培养基上，进行壮芽和生根共培养28-30d得到试管苗；培养温度24-26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16-17h。
优选的，所述步骤(1-1)中茎段取3年生以上、高5-8cm健康的金钗石斛带节茎段，剥去叶片和叶鞘，洗净表面的泥土和灰尘，质量浓度1％洗涤液震荡洗涤30-50min，流水冲洗30-60min，备用。
优选的，所述茎段的灭菌方法是：将金钗石斛带节茎段在超净工作台上用质量浓度75％的酒精漂洗30s，质量浓度3％次氯酸钠溶液灭菌15-20min，无菌水冲洗4-5遍，吸干表面的水分。
优选的，所述灭菌的金钗石斛茎段以平放的方式直接接种到启动培养基上。
优选的，所述步骤(2)愈伤组织的诱导中所述壮芽培养的小苗保留0.5cm长的假根。
优选的，所述方法还包括炼苗和移栽，具体为：
炼苗在室内进行；将组培瓶松盖后，置于组培室缓冲间，放置1-2d，之后移入室内房间，置于自然散射光下，放置2-3d；
炼苗完成后，将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽；移栽栽培基质为棕榈壳：树皮(v:v)＝1:1，栽培基质须经800-1000倍多菌灵消毒处理；之后进行正常的水肥管理；移栽温度为17-29℃，移栽湿度85-92％。
优选的，所述步骤(5)中试管苗高度4-6cm、根系3-5条。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
第一，从茎段为外植体启动芽的萌发，经壮芽培养后获得无菌苗，再由无菌苗诱导出愈伤组织，由愈伤组织分化出丛生芽，建立起金钗石斛的再生体系。此法的优点是丛生芽数量多，芽生长速度快，可大幅度的提高了其繁殖系数，加快繁殖的速度，缩短成苗周期，极大的有利于金钗石斛的推广应用。
第二，利用愈伤组织，有望建立金钗石斛高效的遗传转化体系，从而利用分子生物学手段对金钗石斛进行多种遗传操作或生物工程研究，从分子生物学水平进行遗传改良。
具体实施方式
实施例1
1.1.1无菌苗的培养
(1)外植体的准备茎段的获取：取3年生以上(高5-8cm)健康的金钗石斛带节茎段，剥去叶片和叶鞘，毛刷洗净表面的泥土和灰尘，质量浓度1％洗涤液震荡洗涤30-50min，流水冲洗30-60min，备用。
(2)外植体的灭菌上述材料在超净工作台上用质量浓度75％的酒精漂洗30s，质量浓度3％次氯酸钠溶液灭菌15-20min，无菌水冲洗4-5遍，无菌吸水纸吸干表面的水分。
(3)启动的诱导将已灭菌的茎段，以平放的方式直接接种到启动培养基上，培养基的组分为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+2.3-1.7mg/L 6-BA+0.7-0.4mg/L NAA。其中：1/2是数量概念。MS是培养基。6-BA中文名6苄基腺嘌呤，是一种细胞分裂素。NAA是萘乙酸，生长素的一种。30d后进行继代培养，经过40-50d的培养后，从茎段的结节处长出小芽。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
(4)丛生芽的诱导不定芽继代培养40d后，转接到丛生芽诱导培养基上进行丛生芽诱导。培养基配方为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.8-1.2mg/L 6-BA+0.1-0.2mg/L NAA。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
(5)壮芽丛生芽增殖培养40d后进行壮芽培养，将丛生芽接种到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.3-0.7mg/L 6-BA+0.05-0.15mg/L NAA培养基上，每30d继代一次，共培养60-90d，直至丛生芽长成直径高约3-4cm的小植株。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
1.1.2愈伤组织的诱导将壮芽培养的小苗(保留0.5cm长的假根)转接到蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+1.8-1.4mg/L 6-BA+0.15-0.25mg/L NAA培养基上。3周后，根的周围出现绿色的突起，此为愈伤组织的萌动，4周可见绿色的突起周围出现绿色的组织，此时，进行继代培养，培养基配方为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.8-1.2mg/L 6-BA+0.05-0.15mg/LNAA，2-3周后可见绿色的愈伤组织团块，直至诱导出直径超过1cm的愈伤组织团块。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
1.1.3愈伤组织的增殖将直径超过1cm的愈伤组织团块切下，接种至蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+1.2-1.4mg/L 6-BA+0.05-0.15mg/L NAA的培养基上，令愈伤组织增殖。培养温度25±1℃，暗培养。
1.1.4愈伤组织的分化将愈伤组织分成直径1.5cm左右的小块，转接到上述芽诱导培养基上，使愈伤组织分化出生芽。培养方法同(4)。
1.1.5壮芽和生根培养壮芽和生根培养可以一次完成。具体方法是将上述愈伤组织分化出的芽转接到上述壮芽培养基上。30-60d后再次在转接到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.2mg/L IBA培养基上，进行壮芽和生根共培养。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。30d后，即可长成高度4-6cm、根系3-5条的试管苗。
1.1.6炼苗和移栽炼苗在室内进行。将组培瓶松盖后，置于组培室缓冲间，放置1-2d，之后移入室内房间，置于自然散射光下，放置2-3d。炼苗完成后，用镊子将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽到10×10的穴盘中。栽培基质为棕榈壳：树皮(v:v)＝1:1，栽培基质须经800-1000倍多菌灵消毒处理。之后进行正常的水肥管理。由于金钗石斛为附生植物，喜温暖，潮湿，半阴半阳的生长环境。在炼苗移栽是选择温度较高、湿度较大的季节，同时，考虑到幼苗的生长，在长江中下游地区最好避开秋冬季节。
实施例2
以茎段为外植体进行金钗石斛的快速繁殖
2.1无菌苗的培养
2.1.1外植体的准备茎段的获取：取4年生以上(高7cm)健康的金钗石斛带节茎段，剥去叶片和叶鞘，毛刷洗净表面的泥土和灰尘，质量浓度1％洗涤液震荡洗涤30min，流水冲洗60min，备用。
2.1.2外植体的灭菌上述材料在超净工作台上用质量浓度75％的酒精漂洗30s，质量浓度3％次氯酸钠溶液灭菌18min，无菌水冲洗4-5遍，无菌吸水纸吸干表面的水分。
2.1.3启动的诱导将已灭菌的茎段，以平放的方式直接接种到启动培养基上，培养基的组分为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+2.1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA。30d后进行继代培养，经过45d的培养后，从茎段的结节处长出小芽。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
2.1.4丛生芽的诱导不定芽继代培养40d后，转接到芽增殖培养基上进行增殖培养。培养基配方为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
2.1.5壮芽丛生芽增殖培养40d后进行壮芽培养，将丛生芽接种到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA培养基上，每30d继代一次，共培养90d，直至丛生芽长成直径高约3-4cm的小植株。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
2.1.6壮芽和生根培养将上述从生芽转接到上述壮芽培养基上。30d后再次在转接到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2.0mg/L IBA培养基上，进行壮芽和生根共培养。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。30d后，即可长成直径1-2mm根系3-5条的试管苗。
2.1.7炼苗和移栽炼苗在室内进行。将组培瓶开盖，置于自然散射光下，放置2-3d。炼苗完成后，用镊子将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽到10×10的穴盘中。栽培基质为泥炭土：珍珠岩：田园土＝1:1:1，栽培基质须经800-1000倍多菌灵消毒处理。之后进行正常的水肥管理。实例2以无菌苗为外植体建立金钗石斛的再生体系
2.2愈伤组织的诱导将无菌金钗石斛的小苗(高2-3成苗，保留0.5cm长的假根)转接到蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA培养基上。3周后，根的周围出现绿色的突起，此为愈伤组织的萌动，4周可见绿色的突起周围出现绿色的组织，此后进行继代培养，培养基配方为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.15mg/LNAA，2-3周后可见绿色的愈伤组织团块，直至诱导出直径超过1cm的愈伤组织团块。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。
2.3愈伤组织的增殖将直径超过1cm的愈伤组织团块切下，接种至蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+1.3mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA的培养基上，令愈伤组织增殖。每隔30d继代一次。培养温度25±1℃，暗培养。
2.4愈伤组织的分化将愈伤组织切下，分成直径1.5cm左右的小块，转接到芽诱导培养基上，使愈伤组织分化出丛生芽。培养基配方：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.8-1.2mg/L 6-BA+0.1-0.2mg/L NAA。培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。

Claims (7)

1.一种建立金钗石斛再生体系的方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：
(1)无菌苗的培养
(1-1)启动的诱导将灭菌的金钗石斛茎段接种到启动培养基上培养28-31d，之后继代培养40-50d，从金钗石斛茎段的结节处长出不定芽；培养温度24-26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间15-17h；所述启动培养基的组分为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+2.3-1.7mg/L 6-BA+0.7-0.4mg/L NAA；
(1-2)丛生芽的诱导不定芽继代培养40d后，转接到丛生芽诱导培养基上进行丛生芽诱导，培养温度24-26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16-17h；所述丛生芽诱导培养基配方为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.8-1.2mg/L 6-BA+0.1-0.2mg/L NAA；
(1-3)壮芽丛生芽增殖培养40d后进行壮芽培养，将丛生芽接种到壮芽培养基上，每30d继代一次，共培养60-90d，直至丛生芽长成直径高3-4cm小植株；培养温度24-26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16-17h；所述壮芽培养基的组分为：蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.3-0.7mg/L 6-BA+0.05-0.15mg/L NAA；
(2)愈伤组织的诱导
将壮芽培养的小苗转接到蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+1.8-1.4mg/L 6-BA+0.15-0.25mg/L NAA培养基上，当壮芽培养的小苗根周围出现绿色的突起，绿色的突起周围出现绿色的组织时，进行继代培养，培养基配方为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.8-1.2mg/L6-BA+0.05-0.15mg/L NAA，2-3周后可见绿色的愈伤组织团块，直至诱导出直径超过1cm的愈伤组织团块；培养温度24-26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间15-17h；
(3)愈伤组织的增殖
将直径超过1cm的愈伤组织团块切下，接种至蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+1.2-1.4mg/L 6-BA+0.05-0.15mg/L NAA的培养基上，令愈伤组织增殖；培养温度24-26℃，暗培养；
(4)愈伤组织的分化
将愈伤组织分成直径1.4-1.6cm的小块，转接到芽诱导培养基上，使愈伤组织分化出生芽；所述芽诱导培养基配方为蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.8-1.2mg/L 6-BA+0.1-0.2mg/L NAA；
(5)壮芽和生根培养
将步骤(4)得到的愈伤组织分化出的芽转接到壮芽培养基上培养30-60d，壮芽培养基的组分为蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.3-0.7mg/L 6-BA+0.05-0.15mg/L NAA；再次在转接到蔗糖40g/L+琼脂7.5g/L+1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.2mg/L IBA培养基上，进行壮芽和生根共培养28-30d得到试管苗；培养温度24-26℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16-17h。
2.根据权利要求1所述的一种建立金钗石斛再生体系的方法，其特征是，所述步骤(1-1)中茎段取3年生以上、高5-8cm健康的金钗石斛带节茎段，剥去叶片和叶鞘，洗净表面的泥土和灰尘，洗涤剂震荡洗涤30-50min，流水冲洗30-60min。
3.根据权利要求1或2所述的一种建立金钗石斛再生体系的方法，其特征是，所述茎段的灭菌方法是：将金钗石斛带节茎段在超净工作台上用质量浓度75％的酒精漂洗30s，质量浓度3％次氯酸钠溶液灭菌15-20min，无菌水冲洗4-5遍，吸干表面的水分。
4.根据权利要求1所述的一种建立金钗石斛再生体系的方法，其特征是，所述灭菌的金钗石斛茎段以平放的方式直接接种到启动培养基上。
5.根据权利要求1所述的一种建立金钗石斛再生体系的方法，其特征是，所述步骤(2)愈伤组织的诱导中所述壮芽培养的小苗保留0.5cm长的假根。
6.根据权利要求1所述的一种建立金钗石斛再生体系的方法，其特征是，所述方法还包括炼苗和移栽，具体为：
炼苗在室内进行；将组培瓶松盖后，置于组培室缓冲间，放置1-2d，之后移入室内房间，置于自然散射光下，放置2-3d；
炼苗完成后，将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽；移栽栽培基质为棕榈壳：树皮(v：v)＝1:1，栽培基质须经800-1000倍多菌灵消毒处理；之后进行正常的水肥管理；移栽温度为17-29℃，移栽湿度85-92％。
7.根据权利要求1所述的一种建立金钗石斛再生体系的方法，其特征是，所述步骤(5)中试管苗高度4-6cm、根系3-5条。
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