CN109548624A - 多糖类液体培养基及制备方法 - Google Patents

多糖类液体培养基及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明揭示了一种多糖类液体培养基及制备方法，将蔗糖、果糖或者葡萄糖、磷酸二氢钾及其他营养物质在室温下加入水混匀，并与生长调节剂一起装于组培瓶中混匀，在高温蒸汽下灭菌20‑30min，冷却即得。本发明通过添加并控制果糖、葡萄糖等单糖浓度，以及提高氮磷比，来提升液体培养基的营养质量，继而使培养出来的铁皮石斛嫩茎的多糖、浸出物的含量大大提升。

Description

多糖类液体培养基及制备方法
技术领域
本发明涉及农业种植领域，具体而言，尤其涉及一种多糖类液体培养基及其制备方法。
背景技术
众所周知，糖类在生命活动过程中起着重要的作用，是一切生命体维持生命活动所需能量的主要来源，在这些培养基中，均采用的是蔗糖作为糖分的来源，仅仅使用二糖作为碳源，则对于单子叶植物的铁皮石斛来讲效果不佳，尤其对于铁皮石斛嫩茎来讲更为不利。
铁皮石斛(Dendrobium officinale)是一种多年草本中草药植物，律属被子植物门(Magnoliophyta)、百合纲(Liliopsida)、百合目(Asparagales)、兰科(Orchidaceae)、石斛属(Dendrobium)。在中国药典(2015年版)中记载，铁皮石斛具有清热泻火，解毒，利水消肿，治疗热病烦渴，咽喉肿痛，水肿尿少，热淋涩痛和痈肿疔毒等功效。同样，现代医学研究表明，铁皮石斛具有增强免疫T细胞的功能，可提高人体免疫力，清除人体衰老和突变的细胞，稳定血糖，提高细胞代谢速率，维持机体生理稳定的功能。
铁皮石斛现虽已大规模人工种植，但由于铁皮石斛自身生长缓慢和种植面积少，其年产量仅能满足一个省份的需求。另外，户外种植的铁皮石斛需要占用大量的耕地面积，同时还要面临农药残留和重金属的污染，以及不同石斛品种间的异花传粉而造成遗传不稳定等诸多问题。此外，铁皮石斛人工种植时，会使用大量的无机化肥，易造成环境污染和铁皮石斛品质下降。利用植物组织培养技术，不仅可以解决传统铁皮石斛种植所面临的问题，而且还可以对培养体系进行有目的定向调控，以提高植物组织营养成分或获取特定细胞代谢产物。
因此，目前已经有比较多的对于铁皮石斛人工培养的专利技术，例如中国专利申请CN201510371264.2，CN201510375351.5，CN201710368696.7，201710375637.2，CN201711119122.2，等等。但是，首先这些培养基都是针对铁皮石斛的生长，属于土培培养基，没有专门针对铁皮石斛嫩茎生长用的液体培养基；其次，糖类的选择也都是片面的；再次，在培养基中，磷元素的含量也是限制植物生长的一个重要因素。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种多糖类液体培养基及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种多糖类液体培养基，其配方成分组成如下：
蔗糖 10g/L-30g/L
磷酸二氢钾 95-105mg/L
果糖 5g/L-10g/L
2,4-D 1mg/L-3mg/L
NAA 0.3mg/L-1mg/L
pH值为 5.6-6.0，其余为植物营养元素。
或者，所述果糖可由葡萄糖代替。
优选的，所述植物营养元素包括主量元素、微量元素、铁盐及有机物。
优选的，所述植物营养元素的具体配方成分组成如下：
硝酸钾 50-55mg/L
硝酸铵 80-85mg/L
硫酸镁 245-250mg/L
氯化钙 145-150mg/L
碘化钾 165-170mg/L
硼酸 60-65mg/L
硫酸锰 220-225mg/L
硫酸锌 285-290mg/L
钼酸钠 240-245mg/L
硫酸铜 245-250mg/L
氯化钴 235-240mg/L
乙二胺四乙酸二钠 370-375mg/L
硫酸亚铁 275-280mg/L
肌醇 100-105mg/L
甘氨酸 1-5mg/L
盐酸硫胺素 0.05-0.2mg/L
盐酸吡哆醇 0.1-1mg/L
烟酸 0.1-1mg/L。
优选的，本发明所述的多糖类液体培养基，其配方成分组成如下：
蔗糖 10g/L-30g/L
硝酸钾 50mg/L
硝酸铵 80.04mg/L
硫酸镁 246.47mg/L
氯化钙 147.02mg/L
碘化钾 166.01mg/L
硼酸 61.83mg/L
硫酸锰 223.01mg/L
硫酸锌 287.54mg/L
钼酸钠 241.95mg/L
硫酸铜 249.68mg/L
氯化钴 237.93mg/L
乙二胺四乙酸二钠 372.25mg/L
硫酸亚铁 278.03mg/L
肌醇 100mg/L
甘氨酸 2mg/L
盐酸硫胺素 0.1mg/L
盐酸吡哆醇 0.5mg/L
烟酸 0.5mg/L
磷酸二氢钾 95-105mg/L
果糖 5g/L-10g/L
2,4-D 2mg/L
NAA 0.5mg/L；
pH值为 5.6-6.0。
其中，所述果糖可由葡萄糖代替。
本发明还揭示了一种如上述的多糖类液体培养基的制备方法，包括如下步骤：
S1，将蔗糖、果糖、包括钾、氮、磷、镁在内的主量元素、包括碘、硼、钼在内的微量元素、铁盐及有机物在室温下加入5-7倍量的水混匀，得A品；
S2，将2、4-D与NAA使用无水乙醇预溶，配制为0.5-1mg/ml的溶液，得B品；
S3，将A、B品装于组培瓶中混匀，在高温蒸汽下灭菌20-30min，冷却即得。
其中，所述果糖可由葡萄糖代替。
优选的，蔗糖和果糖为碳源；硝酸钾为氮源、钾源；硝酸铵为氮源；硫酸镁为镁源；碘化钾为碘源；硼酸为硼源，钼酸钠为钼源，磷酸二氢钾为磷源。
本发明的有益效果主要体现在：通过添加并控制果糖、葡萄糖等单糖浓度，以及提高氮磷比，来提升培养基的营养质量，继而使培养出来的铁皮石斛嫩茎的多糖、浸出物的含量大大提升。另外，由于2、4-D与NAA属于微量，且均难溶于水，需要在酒精中预溶后加水稀释，因此本发明的液体培养基采用了相适用的特定的制备方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。有别于现有的关于铁皮石斛的土培培养基，本发明的多糖类液体培养基的配方成分组成如下：
蔗糖 10g/L-30g/L
硝酸钾 50-55mg/L
硝酸铵 80-85mg/L
硫酸镁 245-250mg/L
氯化钙 145-150mg/L
碘化钾 165-170mg/L
硼酸 60-65mg/L
硫酸锰 220-225mg/L
硫酸锌 285-290mg/L
钼酸钠 240-245mg/L
硫酸铜 245-250mg/L
氯化钴 235-240mg/L
乙二胺四乙酸二钠 370-375mg/L
硫酸亚铁 275-280mg/L
肌醇 100-105mg/L
甘氨酸 1-5mg/L
盐酸硫胺素 0.05-0.2mg/L
盐酸吡哆醇 0.1-1mg/L
烟酸 0.1-1mg/L
磷酸二氢钾 95-105mg/L
果糖 5g/L-10g/L
2,4-D 1mg/L-3mg/L
NAA 0.3mg/L-1mg/L
pH值为 5.6-6.0。
需要注意的是，本发明的多糖类液体培养基中，所包含的离子是一定的，即有且仅有上述的原料成分，不能随意引入其他离子。具体来讲：
本发明中，蔗糖和果糖的作用为碳源；硝酸钾为氮源、钾源；硝酸铵为氮源；硫酸镁的作用是镁源，镁是叶绿素的重要成分；碘化钾作为碘源；硼酸作为硼源，其起到促进、调节作用；硫酸锰作为合成叶绿素的催化剂；硫酸锌具有促进光合作用、参与吲哚乙酸的合成的作用；钼酸钠提供钼源，钼是硝酸还原酶的成分，参与植物体内硝酸盐的还原和氮素代谢；乙二胺四乙酸二钠是本发明选择的良好的配合剂；硫酸亚铁作为铁源，补充植物体内的铁元素外，还能促进其对氮与磷元素的吸收；肌醇醇在糖类的相互转化中起作用，是细胞壁的构建材料；甘氨酸对作物的光合作用有独特的效果，利于作物生长，增加作物糖的含量，天然金属螯合剂；盐酸硫胺素是生物体有氧呼吸必须物质；烟酸对胚状体和芽的形成有良好影响；磷酸二氢钾作为磷源；2,4-D和NAA作为生长调节剂。
发明人经研究发现：主量元素、微量元素、铁盐及有机物的具体配方比重对于本发明的液体培养基的性能也是极其重要的。
需要说明的是，在植物组培过中，一般需要添加糖为植物组织生长和发育提供碳源和能量。在植物组培过程中，不同组织对糖的需求量和种类有所差异，其中蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖是最常用的糖类添加物。而作为果糖和葡萄糖的单糖来讲，其作为碳源时，单子叶植物将生长地较好，营养制备更高，而铁皮石斛就是典型的单子叶植物。另外，单糖可被细胞直接吸收，而蔗糖可刺激愈伤，本发明即有机地将两者结合在其，促进愈伤的生长和发育。
本发明液体培养基的具体制备方法，包括如下步骤：
S1，将蔗糖、果糖/葡萄糖、主量元素、微量元素、铁盐及有机物在室温下加入5-7倍量的水混匀，得A品；
S2，将2、4-D与NAA使用无水乙醇预溶，配制为0.5-1mg/ml的溶液，得B品；
S3，将A、B品装于组培瓶中混匀，在高温蒸汽下灭菌20-30min，冷却即得。
具体配方实施例如下：
实施例1
配方：蔗糖20g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾105mg/L、果糖5g/L、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
实施例2
配方：蔗糖10g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾100mg/L、果糖10g/L、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
实施例3
配方：蔗糖20g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾95mg/L、果糖5g/L、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
实施例4
配方：蔗糖10g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾102mg/L、果糖5g/L、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
实施例5
配方：蔗糖20g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾97mg/L、果糖7g/L、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
实施例6
配方：蔗糖10g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾103mg/L、果糖7g/L、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
实施例7
配方：蔗糖20g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾105mg/L、葡萄糖5g/L、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
实施例8
配方：蔗糖20g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾95mg/L、葡萄糖10g/L、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
对比例1
配方：蔗糖20g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾163mg/L、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
对比例2
配方：蔗糖20g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾54mg/L、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
以上述培养基按本发明制备方法各接种10瓶，在培养温度为(22±2)℃、自然光照，光照时间14小时/天条件下培养。选取在上述培养基中生长状况良好的同批次铁皮石斛嫩茎，培养45天后，统计铁皮石斛嫩茎的多糖与浸出物含量。
培养基 多糖含量 浸出物含量
实施例1 17.9％ 45％
实施例2 19.2％ 42％
实施例3 16.9％ 45％
实施例4 21.6％ 53％
实施例5 19.0％ 47％
实施例6 18.5％ 44％
实施例7 19.7％ 46％
实施例8 18.2％ 49％
对比例1 11.2％ 39％
对比例2 10.1％ 37％
由此可见，上述实施例中，铁皮石斛嫩茎在本发明培养基中生长状态佳，其重要指标多糖与浸出物含量均有大幅提高。多糖和醇溶性浸出物是铁皮石斛的主要成分，与药理作用有着密切的联系，是目前判断铁皮石斛质量的主要依据。应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种多糖类液体培养基，其特征在于，其配方成分组成如下：
蔗糖　　 10g/L-30g/L
磷酸二氢钾 95-105mg/L
果糖 5g/L-10g/L
2,4-D 1mg/L-3mg/L
NAA 0.3mg/L-1mg/L
pH值为 5.6-6.0，其余为植物营养元素。
2.根据权利要求1所述的多糖类液体培养基，其特征在于，所述果糖可由葡萄糖代替。
3.根据权利要求1所述的多糖类液体培养基，其特征在于，所述植物营养元素包括主量元素、微量元素、铁盐及有机物。
4.根据权利要求1所述的多糖类液体培养基，其特征在于，所述植物营养元素的具体配方成分组成如下：
硝酸钾　 50-55mg/L
硝酸铵　 80-85mg/L
硫酸镁　 245-250mg/L
氯化钙　 145-150mg/L
碘化钾　 165-170mg/L
硼酸　 60-65mg/L
硫酸锰　 220-225mg/L
硫酸锌　 285-290mg/L
钼酸钠　 240-245mg/L
硫酸铜　 245-250mg/L
氯化钴　 235-240mg/L
乙二胺四乙酸二钠　370-375mg/L
硫酸亚铁　 275-280mg/L
肌醇　 100-105mg/L
甘氨酸　 1-5mg/L
盐酸硫胺素　 0.05-0.2mg/L
盐酸吡哆醇　 0.1-1mg/L
烟酸　 0.1-1mg/L。
5.根据权利要求4所述的多糖类液体培养基，其特征在于，其配方成分组成如下：
蔗糖　　 10g/L-30g/L
硝酸钾　 50mg/L
硝酸铵　 80.04mg/L
硫酸镁　 246.47mg/L
氯化钙　 147.02mg/L
碘化钾　 166.01mg/L
硼酸　 61.83mg/L
硫酸锰 　223.01mg/L
硫酸锌　 287.54mg/L
钼酸钠　 241.95mg/L
硫酸铜　 249.68mg/L
氯化钴　 237.93mg/L
乙二胺四乙酸二钠　372.25mg/L
硫酸亚铁　 278.03mg/L
肌醇　 100mg/L
甘氨酸　 2mg/L
盐酸硫胺素　 0.1mg/L
盐酸吡哆醇　 0.5mg/L
烟酸　 0.5mg/L
磷酸二氢钾 95-105mg/L
果糖 5g/L-10g/L
2,4-D 2mg/L
NAA 0.5mg/L；
pH值为 5.6-6.0。
6.根据权利要求5所述的多糖类液体培养基，其特征在于：所述果糖可由葡萄糖代替。
7.一种如权利要求1所述的多糖类液体培养基的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，
S1，将蔗糖、果糖、包括钾、氮、磷、镁在内的主量元素、包括碘、硼、钼在内的微量元素、铁盐及有机物在室温下加入5-7倍量的水混匀，得A品；
S2，将2、4-D与NAA使用无水乙醇预溶，配制为0.5-1mg/ml的溶液，得B品；
S3，将A、B品装于组培瓶中混匀，在高温蒸汽下灭菌20-30min，冷却即得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述果糖可由葡萄糖代替。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：蔗糖和果糖为碳源；硝酸钾为氮源、钾源；硝酸铵为氮源；硫酸镁为镁源；碘化钾为碘源；硼酸为硼源，钼酸钠为钼源，磷酸二氢钾为磷源。
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