CN109548625A - 适用于铁皮石斛嫩茎的液体培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明揭示了一种适用于铁皮石斛嫩茎的液体培养基及其制备方法，将苹果提取物、土豆提取物及其他物质在室温下加入5‑7倍量的水混匀，得A品；将2、4‑D与NAA使用无水乙醇预溶，配制为0.5‑2mg/ml的溶液，得B品。将A、B品装于组培瓶中混匀，在高温蒸汽下灭菌20‑30min，冷却即得。本发明通过添加并控制苹果提取物与土豆提取物的浓度，以提高终产物中精氨酸含量与多糖含量。
Description
技术领域
本发明涉及农业种植领域，具体而言，尤其涉及一种适用于铁皮石斛嫩茎的液体培养基及其制备方法。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium officinale)是一种多年草本中草药植物，律属被子植物门(Magnoliophyta)、百合纲(Liliopsida)、百合目(Asparagales)、兰科(Orchidaceae)、石斛属(Dendrobium)。在中国药典(2015年版)中记载，铁皮石斛具有清热泻火，解毒，利水消肿，治疗热病烦渴，咽喉肿痛，水肿尿少，热淋涩痛和痈肿疔毒等功效。同样，现代医学研究表明，铁皮石斛具有增强免疫T细胞的功能，可提高人体免疫力，清除人体衰老和突变的细胞，稳定血糖，提高细胞代谢速率，维持机体生理稳定的功能。
野生铁皮石斛一般生长于石崖或古树之上，生长于石崖的铁皮石斛习惯称之为石斛，药物活性好；生长于古树的铁皮石斛习惯称之为木斛，药效活性相对差。不管石斛还是木斛，他们生长都较缓慢，且非常稀少，再加上对铁皮石斛毫无节制的采集和滥用，野生铁皮石斛现已被国家列为二级植物保护品种。
铁皮石斛现虽已大规模人工种植，但由于铁皮石斛自身生长缓慢和种植面积少，其年产量仅能满足一个省份的需求。另外，户外种植的铁皮石斛需要占用大量的耕地面积，同时还要面临农药残留和重金属的污染，以及不同石斛品种间的异花传粉而造成遗传不稳定等诸多问题。此外，铁皮石斛人工种植时，会使用大量的无机化肥，易造成环境污染和铁皮石斛品质下降。利用植物组织培养技术，不仅可以解决传统铁皮石斛种植所面临的问题，而且还可以对培养体系进行有目的定向调控，以提高植物组织营养成分或获取特定细胞代谢产物。
因此，目前已经有比较多的对于铁皮石斛人工培养的专利技术，例如中国专利申请CN201510371264.2，CN201510375351.5，CN201710368696.7，201710375637.2，CN201711119122.2，等等。但是，首先这些培养基都是针对铁皮石斛的生长，属于土培培养基，无专门针对铁皮石斛嫩茎生长用的液体培养基；其次，有机添加物也比较少地被添加到铁皮石斛的培养基中；而且，目前的铁皮石斛嫩茎的精氨酸含量与多糖含量也不甚理想。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种适用于铁皮石斛嫩茎的液体培养基及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种适用于铁皮石斛嫩茎的液体培养基，其配方成分组成如下：
蔗糖 10g/L-30g/L
硝酸钾 50-55mg/L
硝酸铵 80-85mg/L
硫酸镁 245-250mg/L
氯化钙 145-150mg/L
碘化钾 165-170mg/L
硼酸 60-65mg/L
硫酸锰 220-225mg/L
硫酸锌 285-290mg/L
钼酸钠 240-245mg/L
硫酸铜 245-250mg/L
氯化钴 235-240mg/L
乙二胺四乙酸二钠 370-375mg/L
硫酸亚铁 275-280mg/L
肌醇 100-105mg/L
甘氨酸 1-5mg/L
盐酸硫胺素 0.05-0.2mg/L
盐酸吡哆醇 0.1-1mg/L
烟酸 0.1-1mg/L
磷酸二氢钾 70-80mg/L
土豆提取物 5-20％
苹果提取物 5-20％
2,4-D 1mg/L-3mg/L
NAA 0.3mg/L-1mg/L
pH值为 5.6-6.0。
进一步的，适用于铁皮石斛嫩茎的液体培养基，其配方成分组成如下：
蔗糖 10g/L-30g/L
硝酸钾 50mg/L
硝酸铵 80.04mg/L
硫酸镁 246.47mg/L
氯化钙 147.02mg/L
碘化钾 166.01mg/L
硼酸 61.83mg/L
硫酸锰 223.01mg/L
硫酸锌 287.54mg/L
钼酸钠 241.95mg/L
硫酸铜 249.68mg/L
氯化钴 237.93mg/L
乙二胺四乙酸二钠 372.25mg/L
硫酸亚铁 278.03mg/L
肌醇 100mg/L
甘氨酸 2mg/L
盐酸硫胺素 0.1mg/L
盐酸吡哆醇 0.5mg/L
烟酸 0.5mg/L
磷酸二氢钾 75mg/L
土豆提取物 5-20％
苹果提取物 5-20％
2,4-D 2mg/L
NAA 0.5mg/L
pH值为 5.6-6.0。
本发明揭示了一种适用于铁皮石斛嫩茎的液体培养基的制备方法，包括如下步骤，
S1，将土豆提取物、苹果提取物、包括钾、氮、磷、镁在内的主量元素、包括碘、硼、钼在内的微量元素、铁盐及有机物在室温下加入5-7倍量的水混匀，得A品；
S2，将2、4-D与NAA使用无水乙醇预溶，配制为0.5-2mg/ml的溶液，得B品；
S3，将A、B品装于组培瓶中混匀，在高温蒸汽下灭菌20-30min，冷却即得。
优选的，所述蔗糖为碳源；硝酸钾为氮源、钾源；硝酸铵为氮源；硫酸镁为镁源；碘化钾为碘源；硼酸为硼源，钼酸钠为钼源，磷酸二氢钾为磷源。
本发明的有益效果主要体现在：通过添加并控制苹果提取物、土豆提取物，以提高铁皮石斛嫩茎的精氨酸含量与多糖含量。另外，由于2、4-D与NAA属于微量，且均难溶于水，需要在酒精中预溶后加水稀释，因此本发明的液体培养基采用了相适用的特定的制备方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
有别于现有的关于铁皮石斛的土培培养基，本发明的适用于铁皮石斛嫩茎的液体培养基的配方成分组成如下：
蔗糖 10g/L-30g/L
硝酸钾 50-55mg/L
硝酸铵 80-85mg/L
硫酸镁 245-250mg/L
氯化钙 145-150mg/L
碘化钾 165-170mg/L
硼酸 60-65mg/L
硫酸锰 220-225mg/L
硫酸锌 285-290mg/L
钼酸钠 240-245mg/L
硫酸铜 245-250mg/L
氯化钴 235-240mg/L
乙二胺四乙酸二钠 370-375mg/L
硫酸亚铁 275-280mg/L
肌醇 100-105mg/L
甘氨酸 1-5mg/L
盐酸硫胺素 0.05-0.2mg/L
盐酸吡哆醇 0.1-1mg/L
烟酸 0.1-1mg/L
磷酸二氢钾 75-85mg/L
土豆提取物 5-20％
苹果提取物 5-20％
2,4-D 1mg/L-3mg/L
NAA 0.3mg/L-1mg/L
pH值为 5.6-6.0。
本发明中，蔗糖的作用为碳源；硝酸钾为氮源、钾源；硝酸铵为氮源；硫酸镁的作用是镁源，镁是叶绿素的重要成分；碘化钾作为碘源；硼酸作为硼源，其起到促进、调节作用；硫酸锰作为合成叶绿素的催化剂；硫酸锌具有促进光合作用、参与吲哚乙酸的合成的作用；钼酸钠提供钼源，钼是硝酸还原酶的成分，参与植物体内硝酸盐的还原和氮素代谢；乙二胺四乙酸二钠是本发明选择的良好的配合剂；硫酸亚铁作为铁源，补充植物体内的铁元素外，还能促进其对氮与磷元素的吸收；肌醇醇在糖类的相互转化中起作用，是细胞壁的构建材料；甘氨酸对作物的光合作用有独特的效果，利于作物生长，增加作物糖的含量，天然金属螯合剂；盐酸硫胺素是生物体有氧呼吸必须物质；烟酸对胚状体和芽的形成有良好影响；磷酸二氢钾作为磷源；2,4-D和NAA作为生长调节剂。发明人经研究发现：主量元素、微量元素、铁盐及有机物的具体配方比重对于本发明的液体培养基的性能也是极其重要的。
需要说明的是，苹果提取物与土豆提取物含有一定的植物激素,有利于组培植物的生长，且含有一定的过氧化物酶和超氧自由基岐化酶,及维生素C，可以防止空气中过多的氧气，产生氧负离子对组培植物造成伤害；而且，土豆提取物中淀粉含量丰富,也可以作为培养物的碳源补充。
本发明还揭示了一种适用于铁皮石斛嫩茎的液体培养基的制备方法，包括如下步骤：
S1，将苹果提取物、土豆提取物、包括钾、氮、磷、镁在内的主量元素、包括碘、硼、钼在内的微量元素、铁盐及有机物在室温下加入5-7倍量的水混匀，得A品；
S2，将2、4-D与NAA使用无水乙醇预溶，配制为0.5-2mg/ml的溶液，得B品；
S3，将A、B品装于组培瓶中混匀，在高温蒸汽下灭菌20-30min，冷却即得。
具体配方实施例如下：
实施例1
配方：蔗糖20g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾75mg/L、土豆提取物10％、苹果提取物5％、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
实施例2
配方：蔗糖20g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾75mg/L、土豆提取物20％、苹果提取物5％、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
实施例3
配方：蔗糖10g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾75mg/L、土豆提取物20％、苹果提取物15％、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
实施例4
配方：蔗糖15g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾75mg/L、土豆提取物10％、苹果提取物20％、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
实施例5
配方：蔗糖30g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾75mg/L、土豆提取物5％、苹果提取物20％、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
对比例1
配方：蔗糖20g/L、硝酸钾50mg/L、硝酸铵80.04mg/L、硫酸镁246.47mg/L、氯化钙147.02mg/L、碘化钾166.01mg/L、硼酸61.83mg/L、硫酸锰223.01mg/L、硫酸锌287.54mg/L、钼酸钠241.95mg/L、硫酸铜249.68mg/L、氯化钴237.93mg/L、乙二胺四乙酸二钠372.25mg/L、硫酸亚铁278.03mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、磷酸二氢钾75mg/L、2,4-D 2mg/L、NAA 0.5mg/L。
以上培养基按本发明制备方法各接种10瓶，在培养温度为(22±2)℃、自然光照，光照时间14小时/天条件下培养。选取在上述培养基中生长状况良好的同批次铁皮石斛嫩茎，培养45天后，统计铁皮石斛嫩茎的精氨酸含量与多糖含量。
| 培养基 | 精氨酸含量 | 多糖含量 |
| 实施例1 | 2.0％ | 19.3％ |
| 实施例2 | 1.4％ | 17.9％ |
| 实施例3 | 1.4％ | 18.4％ |
| 实施例4 | 1.6％ | 19.2％ |
| 实施例5 | 1.7％ | 18.8％ |
| 对比例1 | 0.5％ | 10.7％ |
由此可见，上述实施例中，铁皮石斛嫩茎在本发明培养基中生长状态佳，其精氨酸含量与多糖含量均有大幅提高。应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种适用于铁皮石斛嫩茎的液体培养基，其特征在于，其配方成分组成如下：
蔗糖 10g/L-30g/L
硝酸钾 50-55mg/L
硝酸铵 80-85mg/L
硫酸镁 245-250mg/L
氯化钙 145-150mg/L
碘化钾 165-170mg/L
硼酸 60-65mg/L
硫酸锰 220-225mg/L
硫酸锌 285-290mg/L
钼酸钠 240-245mg/L
硫酸铜 245-250mg/L
氯化钴 235-240mg/L
乙二胺四乙酸二钠 370-375mg/L
硫酸亚铁 275-280mg/L
肌醇 100-105mg/L
甘氨酸 1-5mg/L
盐酸硫胺素 0.05-0.2mg/L
盐酸吡哆醇 0.1-1mg/L
烟酸 0.1-1mg/L
磷酸二氢钾 70-80mg/L
土豆提取物 5-20%
苹果提取物 5-20%
2,4-D 1mg/L-3mg/L
NAA 0.3mg/L-1mg/L
pH值为 5.6-6.0。
2.根据权利要求1所述的适用于铁皮石斛嫩茎的液体培养基，其特征在于，其配方成分组成如下：
蔗糖 10g/L-30g/L
硝酸钾 50mg/L
硝酸铵 80.04mg/L
硫酸镁 246.47mg/L
氯化钙 147.02mg/L
碘化钾 166.01mg/L
硼酸 61.83mg/L
硫酸锰 223.01mg/L
硫酸锌 287.54mg/L
钼酸钠 241.95mg/L
硫酸铜 249.68mg/L
氯化钴 237.93mg/L
乙二胺四乙酸二钠 372.25mg/L
硫酸亚铁 278.03mg/L
肌醇 100mg/L
甘氨酸 2mg/L
盐酸硫胺素 0.1mg/L
盐酸吡哆醇 0.5mg/L
烟酸 0.5mg/L
磷酸二氢钾 75mg/L
土豆提取物 5-20%
苹果提取物 5-20%
2,4-D 2mg/L
NAA 0.5mg/L
pH值为 5.6-6.0。
3.一种如权利要求1或2所述的适用于铁皮石斛嫩茎的液体培养基的制备方法，特征在于：包括如下步骤，
S1，将土豆提取物、苹果提取物、包括钾、氮、磷、镁在内的主量元素、包括碘、硼、钼在内的微量元素、铁盐及有机物在室温下加入5-7倍量的水混匀，得A品；
S2，将2、4-D与NAA使用无水乙醇预溶，配制为0.5-2mg/ml的溶液，得B品；
S3，将A、B品装于组培瓶中混匀，在高温蒸汽下灭菌20-30min，冷却即得。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述蔗糖为碳源；硝酸钾为氮源、钾源；硝酸铵为氮源；硫酸镁为镁源；碘化钾为碘源；硼酸为硼源，钼酸钠为钼源，磷酸二氢钾为磷源。
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