CN106106144B - 一种铁皮石斛无性系快速繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁皮石斛无性系快速繁育方法，该方法包括以下步骤：噻苯隆促进野生铁皮石斛不定芽诱导、噻苯隆促进铁皮石斛不定芽增殖和壮苗，然后获得的铁皮石斛无菌幼苗的生根培养。本发明克服了野生铁皮石斛无性系培养获得的植株增殖慢、质量低及长势不一致等问题，其所用的噻苯隆是一种苯基脲化合物取代物，其被认为是植物组培中诱导侧芽最有效的一种细胞分裂素类似物，近年来已广泛用于兰科植物的离体培养当中。本发明具有技术工艺易操作简单、产出量大，所得铁皮石斛幼苗质量好、增殖快和长势均匀等，为铁皮石斛试管苗大量繁殖和产业化发展提供有效和可持续方法。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种铁皮石斛无性系快速繁育方法。
背景技术
兰科植物是一种全世界流行的园艺和观赏植物，它能在单一花序中反复盛开2~20朵花，且常被用作盆栽植物或者鲜切花。石斛属植物是兰科植物中的第二大属，其中铁皮石斛(Dendrobium officinal Kimura et Migo) 为兰科石斛属多年生附生型草本植物，是最著名的兰花之一，其主要分布在南亚和东南亚地区。铁皮石斛不只是一种观赏植物，还是一种传统中医药和保健品，已在中国应用了数千年。然而铁皮石斛这一物种由于过度被采挖、栖息地破坏和城市化而逐渐减少，组织培养技术可以在短时间内进行不同种类石斛的快速繁殖。铁皮石斛的离体繁殖主要包括运用成熟种子、原球茎等作为外植体材料，但是产生的再生植株表现出不稳定的生物基因行为，而相对于其他外植体，茎段培养是一种能够快速诱导出幼苗的途径，其繁殖体表现出形态、生长和气候适应的统一性。这一培养体系已经被成功地运用在若干石斛属植物再生中，因此茎段培养可能是一种铁皮石斛大量繁殖和稳定遗传的有效方法。
噻苯隆是一种取代苯基脲类化合物，其具有类似于N6-取代腺嘌呤衍生物的强大活性，被认为是植物组织培养中一个最活跃的细胞分裂素类物质，特别是在应用在兰花的繁殖中。使用茎段作为外植体，噻苯隆可以诱导植物多芽的形成，其已被报道运用在兜兰、纹瓣兰、兜唇石斛和杓唇石斛的培养中。鉴于噻苯隆可以促进植物的大量生长以及稳定遗传等优点，有望为铁皮石斛试管苗大量繁殖和产业化发展提供有效和可持续方法。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种铁皮石斛无性系快速繁育方法，该方法是从野生铁皮石斛茎节段进行离体无菌培养，获得了大量稳定遗传的铁皮石斛幼苗，在该过程中没有出现形态变异；该方法的特征之一是在培养基中添加噻苯隆。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
在本文中，茎节段（Stem nodal segment）是指铁皮石斛植株去除叶片、茎尖、腋芽及根部后，均切成带1个茎节的约1 cm节段。
一种铁皮石斛无性系快速繁育方法，包括以下步骤：
（1）铁皮石斛茎段无菌培养建立
所有铁皮石斛茎段经表面洗净后，置于超净工作台中进行消毒，然后切成约1 cm的带节茎段。
所述的铁皮石斛茎段均去除叶片、茎尖及腋芽；
所述的约1 cm带节茎段均切掉两端伤口褐化部分。
（2）铁皮石斛不定芽诱导培养
将上述获得的铁皮石斛无菌带节茎段在超净工作台中移入诱导培养基中，盖上瓶盖，置于培养室内进行培养；
所用的培养基中含有0.1~2.0 mg/L噻苯隆，优选N6培养基、MS培养基、1/2MS培养基、B5培养基、LS培养基或KM培养基。
（3）铁皮石斛不定芽增殖和壮苗培养
将上述获得的铁皮石斛幼芽从组培瓶中取出，在超净工作台中移入增殖和壮苗培养基中，盖上瓶盖，置于培养室内进行培养；
所述的铁皮石斛幼芽为高1~2 cm；
所用的培养基中含有0.1~2.0 mg/L噻苯隆，优选N6培养基、MS培养基、1/2MS培养基、B5培养基、LS培养基或KM培养基。
（4）铁皮石斛幼苗生根培养
将上述获得的铁皮石斛幼苗从组培瓶中取出，在超净工作台中移入生根培养基中，盖上瓶盖，置于培养室内进行培养；
所述的铁皮石斛幼苗为高3~6 cm；
所用的培养基优选N6培养基、MS培养基、1/2MS培养基、B5培养基、LS培养基或KM培养基。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明对铁皮石斛不定芽的诱导、增殖、壮苗及生根培养方法不会诱发环境问题，且可稳定提供来源于铁皮石斛的有用物质（如抗氧化剂、抗癌物质及功能性保健品添加剂等）。
2、本发明克服了野生铁皮石斛植株生长的质量低、增殖慢及长势不一致等的问题，从而提高培养效率及减少生产成本。本发明具有技术工艺易操作、流程少、产出量大等优点。
附图说明
图1是经野生铁皮石斛带节茎段诱导得到的不定芽试验结果图。
图2是经野生铁皮石斛不定芽增殖和壮苗培养得到的试验结果图。
图3是经野生铁皮石斛幼苗生根培养得到的试验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
噻苯隆促进野生铁皮石斛不定芽诱导
1.1 材料
本实验采用的材料保存在广州中医药大学药用植物教研室的植物组培室，经广州中医药大学中药鉴定教研室赖小平教授鉴定为兰科石斛属植物铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo。
1.2 实验方法
所有铁皮石斛茎段均去除叶片、茎尖及腋芽，用吐温-20浸泡8~13min，再用自来水清洗，洗净后置于超净工作台用75%酒精浸泡，再用0.2~0.6%次氯酸钠灭菌，以无菌水清洗2~3次，用消毒纸巾吸干表面水分，切掉两端伤口褐化部分，然后切成约1cm的带节茎段，移入诱导培养基中，盖上瓶盖，置于培养室内进行培养。
以MS作为基本培养基，培养基中含琼脂、蔗糖，添加0.1~2.0 mg/L噻苯隆，以1.0mol/L NaOH或0.1mol/L HCl调pH为5.8，在121 °C高压灭菌锅灭菌20 min。培养条件：温度（25±1）℃，光照12 h/d，光照强度为1500~2000 lx。
1.3 实验结果与结论
铁皮石斛不定芽诱导情况结果见图1。结果显示，铁皮石斛茎段培养的对照组中仅能诱导出0~1个不定芽，且诱导出的不定芽弱小、较黄，而培养基中添加噻苯隆可以明显地提高铁皮石斛不定芽的诱导量和生长状态（P<0.05）。
以上实验结果表明，噻苯隆可以提高铁皮石斛不定芽诱导情况。
实施例2
噻苯隆促进铁皮石斛不定芽增殖和壮苗
2.1 材料
取“实施例1”中获得的铁皮石斛不定芽。
2.2 实验方法
选出大小基本一致的不定芽，接种于不定芽增殖和壮苗培养基中。以MS作为基本培养基，培养基中含琼脂、蔗糖，添加0.1~2.0 mg/L噻苯隆，以1.0mol/LNaOH或0.1mol/LHCl调pH为5.8，在121 °C高压灭菌锅灭菌20min。培养条件：温度（25±1）℃，光照12 h/d，光照强度为1500~2000 lx。
2.3 实验结果与结论
铁皮石斛不定芽增殖和壮苗情况结果见图2。结果显示，与对照组比较，培养基中添加噻苯隆可以明显地提高铁皮石斛不定芽的增殖倍数和生长状况（P<0.05）。
以上实验结果表明，噻苯隆可以促进铁皮石斛不定芽增殖和壮苗。
实施例3
铁皮石斛无菌幼苗生根培养
2.1 材料
取“实施例2”中获得的无菌铁皮石斛幼苗。
2.2 实验方法
选出大小基本一致的无菌铁皮石斛幼苗，接种于生根培养基中。以MS作为基本培养基，培养基中含琼脂、蔗糖，以1.0mol/LNaOH或0.1mol/LHCl调pH为5.8，在121 °C高压灭菌锅灭菌20min。培养条件：温度（25±1）℃，光照12 h/d，光照强度为1500~2000 lx。
2.3 实验结果与结论
铁皮石斛无菌幼苗生根培养结果见图3。结果显示，与对照组比较，生根培养基中可以明显地提高铁皮石斛无菌幼苗的生根倍数和根部生长情况（P<0.05）。
以上实验结果表明，生根培养基可以促进铁皮石斛无菌幼苗生根。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种铁皮石斛无性系快速繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)铁皮石斛茎段无菌培养建立 所有铁皮石斛茎段经表面洗净后，置于超净工作台中进行消毒，然后切成1cm的带节茎段；
(2)铁皮石斛不定芽诱导培养 将上述获得的铁皮石斛无菌带节茎段在超净工作台中移入诱导培养基中，盖上瓶盖，置于培养室内进行培养；所述诱导培养基以MS作为基本培养基，培养基中仅含琼脂、蔗糖、0.1～2.0mg/L噻苯隆，以1.0mol/L NaOH或0.1mol/L HCl调pH为5.8，在121℃高压灭菌锅灭菌20min；
所述培养的条件为：温度(25±1)℃，光照12h/d，光照强度为1500～2000lx；
(3)铁皮石斛不定芽增殖和壮苗培养 将上述获得的铁皮石斛幼芽从组培瓶中取出，在超净工作台中移入增殖和壮苗培养基中，盖上瓶盖，置于培养室内进行培养；所述增殖和壮苗培养基以MS作为基本培养基，培养基中仅含琼脂、蔗糖、0.1～2.0mg/L噻苯隆，以1.0mol/LNaOH或0.1mol/LHCl调pH为5.8，在121℃高压灭菌锅灭菌20min；
所述培养的条件为：温度(25±1)℃，光照12h/d，光照强度为1500～2000lx；
(4)铁皮石斛幼苗生根培养
将上述获得的铁皮石斛幼苗从组培瓶中取出，在超净工作台中移入生根培养基中，盖上瓶盖，置于培养室内进行培养；所述生根培养基以MS作为基本培养基，培养基中仅含琼脂、蔗糖，以1.0mol/LNaOH或0.1mol/LHCl调pH为5.8，在121℃高压灭菌锅灭菌20min；所述培养的条件为：温度(25±1)℃，光照12h/d，光照强度为1500～2000lx。
2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛无性系快速繁育方法，其特征在于：步骤(1)所述的铁皮石斛茎段均去除叶片、茎尖及腋芽。
3.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛无性系快速繁育方法，其特征在于：步骤(1)所述的1cm带节茎段均切掉两端伤口褐化部分。
4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛无性系快速繁育方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的铁皮石斛幼芽为高1～2cm。
5.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛无性系快速繁育方法，其特征在于：步骤(4)中，所述的铁皮石斛幼苗为高3～6cm。
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