CN101836587A - 通过花药培养获得洋桔梗再生植株的方法 - Google Patents

通过花药培养获得洋桔梗再生植株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种通过花药培养获得洋桔梗再生植株的方法，经过选材、花蕾消毒、愈伤组织的诱导、愈伤组织分化成芽、再生植株的扩繁等步骤，获得花药培养的洋桔梗再生植株。本发明诱导洋桔梗基因型成功率达100％，愈伤诱导率达35～100％，愈伤组织分化率为8～23％，分化植株最高可达28株/愈伤组织，可为F1代种子生产提供优良的亲本材料。

Description

通过花药培养获得洋桔梗再生植株的方法
技术领域
本发明涉及一种通过花药培养获得洋桔梗再生植株的方法，属于生物技术领域。
背景技术
洋桔梗(Eustoma grandiflorum)为龙胆科观赏植物，原产于北美洲，其株态轻盈，花色典雅，花形别致，茎杆叶片光洁动人，是近年来国际上流行的一种高档切花。其种源主要是从国外进口F1杂种，价格昂贵，给洋桔梗切花生产带来很多困难。
发明内容
为解决F1杂种需进口，洋桔梗切花难以生产等问题，本发明提供一种通过花药培养获得洋桔梗再生植株的方法。通过本发明可对洋桔梗进行花药培养产生单倍体植株，再经秋水仙素加倍处理能够产生纯合自交系，可为F1代种子生产提供优良的亲本材料。
本发明通过下列技术方案完成：一种通过花药培养获得洋桔梗再生植株的方法，其特征在于经过下列工艺步骤：
A.将经过预处理的花蕾灭菌后切除花冠，剥出花药，除去花丝，将花药接种在：MS+0.5～3mg/L的KT+0.5～3mg/L的2，4-D，pH为5.5～6.0的诱导培养基上，在光照强度为：1500～2000lx，光照时间为：8～12小时/天，温度为20～28℃条件下，培养20～40天，取出，放入上述诱导培养基上，如此反复培养至花药上长出愈伤组织；
B.将A中继代培养的愈伤组织置于：MS+0.5～3mg/L的KT+0.1～0.5mg/L的NAA，pH为5.5～6.0的分化培养基上，在温度为：20～28℃，光照强度为：1500～2000lx，光照时间为：8～12小时/天的条件下，培养20～40天，使愈伤组织分化出芽，未分化的愈伤组织继续放入上述相同分化培养基上，在相同条件下继续培养至分化出芽；
C.将B中分化出的芽置于：MS+0.1～0.5mg/L的BA+0.1～0.5mg/L的NAA，pH为5.5～6.0的繁殖培养基上，在温度为：20～28℃，光照强度为：1500～2000lx，光照时间为：8～12小时/天的条件下，培养20～40天，即获得花药培养的洋桔梗再生植株。
所述A中的花蕾预处理经过下列步骤：
(1)于冬季选洋桔梗材料，取其花蕾；
(2)将花蕾装入塑料袋中，放入3～6℃冰箱中2～4天；
(3)花蕾用体积浓度为75％的酒精消毒30～60秒，再用质量浓度为0.05～0.2％的HgCl2消毒10～20分种，最后用无菌水冲洗2～4次，吸干花蕾上的水分，得预处理灭菌的花蕾。
所述A中的花蕾为花萼等长于花冠或者花萼稍长于花冠的花蕾。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：通过本发明之方法对洋桔梗花药进行离体培养，诱导洋桔梗基因型成功率达100％，愈伤诱导率达35～100％，愈伤组织分化率为8～23％，分化植株最高可达28株/愈伤组织，为洋桔梗单倍体植株的获得提供了可靠技术支持，进而有望解决生产洋桔梗切花困难、成本高等问题。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
A.所用洋桔梗材料为‘Ceremony Orange’，取花萼与花冠等长的花蕾；将花蕾送冰箱内于3℃放置4天；取出花蕾用体积浓度为75％的酒精消毒30秒，再用质量浓度为0.2％的HgCl2消毒10分种，最后用无菌水冲洗3次，用经过高压灭菌处理的滤纸吸干花蕾上的水分；将花蕾切除花冠，剥出花药，除去花丝后，接种在：MS+0.5mg/L的KT+0.5mg/L的2，4-D，pH为5.5的诱导培养基上，在光照强度为：1500lx，光照时间为：12小时/天，温度20℃，培养40天，取出，放入新的与上述相同的诱导培养基上至花药长出愈伤组织，切下愈伤组织，未长愈伤组织的花药继续在相同的诱导培养基中，相同培养条件下进行继代培养至长出愈伤组织；
B.将A中继代培养的愈伤组织置于：MS+0.5mg/L的KT+0.1mg/L的NAA，pH为5.5的分化培养基上，在温度20℃，光照强度为：1500lx，光照12小时/天的条件下，培养40天，从愈伤组织分化出芽，未分化的愈伤组织再放入相同配方的上述分化培养基上、在相同培养条件下继续培养分化出芽；
C.将B中分化出的芽置于：MS+0.1mg/L的BA+0.1mg/L的NAA，pH为5.5的繁殖培养基上，在温度为20℃，光照强度为：1500lx，光照时间为：12小时/天，培养40天，即获得花药培养的洋桔梗再生植株。
该实施例的愈伤诱导率达77.3％，愈伤组织分化率为12.1％。
实施例2
A.选洋桔梗材料‘Art Peach’，取花萼稍长于花冠的花蕾；将花蕾放入冰箱中于6℃放置2天；取出花蕾用体积浓度为75％的酒精消毒60秒，再用质量浓度为0.05％的HgCl2消毒20分种，最后用无菌水冲洗2次，用经过高压灭菌处理的滤纸吸干花蕾上的水分；将花蕾切除花冠，剥出花药，除去花丝，将花药接种在：MS+3mg/L的KT+3mg/L的2，4-D，pH为6.0的诱导培养基上，在光照强度为：2000lx，光照时间为：8小时/天，温度28℃，培养20天，取出，放入上述诱导培养基上至花药长出愈伤组织，切下愈伤组织，未长愈伤组织的花药继续在相同的诱导培养基中，相同培养条件下进行继代培养至长出愈伤组织；
B.将A中继代培养的愈伤组织置于：MS+3mg/L的KT+0.5mg/L的NAA，pH为6.0的分化培养基上，在温度28℃，光照强度为：2000lx，光照8小时/天的条件下，培养20天，从愈伤组织分化出芽，未分化的愈伤组织继续放入相同配方的上述分化培养基上，在相同培养条件下继续分化出芽；
C.将B中分化出的芽置于：MS+0.5mg/L的BA+0.5mg/L的NAA，pH为6.0的繁殖培养基上，在温度为28℃，光照强度为：2000lx，光照时间为：8小时/天，培养20天，即获得花药培养的洋桔梗再生植株。
该例愈伤诱导率达100％，愈伤组织分化率为15.6％。
实施例3
A.选洋桔梗材料‘Cessna White’，取花萼稍长于花冠的花蕾；将花蕾放入冰箱内于4℃放置3天；花蕾用体积浓度为75％的酒精消毒40秒，再用质量浓度为0.1％的HgCl2消毒15分种，最后用无菌水冲洗4次，用经过高压灭菌处理的滤纸吸干花蕾上的水分；将花蕾切除花冠，剥出花药，除去花丝，将花药接种在：MS+1mg/L的KT+1mg/L的2，4-D，pH为5.8的诱导培养基上，在光照强度为：1800lx，光照时间为：10小时/天，温度25℃，培养30天，取出，放入上述诱导培养基上至花药长出愈伤组织，切下愈伤组织，未长愈伤组织的花药继续在相同的诱导培养基中，相同培养条件下进行继代培养至长出愈伤组织；
B.将A中继代培养的愈伤组织置于：MS+1.2mg/L的KT+0.3mg/L的NAA，pH为5.8的分化培养基上，在温度25℃，光照强度为：1800lx，光照10小时/天的条件下，培养30天，从愈伤组织分化出芽，未分化的愈伤组织继续放入相同配方的上述分化培养基上，在相同培养条件下继续分化出芽；
C.将B中分化出的芽置于：MS+0.2mg/L的BA+0.2mg/L的NAA，pH为5.8的繁殖培养基上，在温度为25℃，光照强度为：1800lx，光照时间为：10小时/天，培养30天，即获得花药培养的洋桔梗再生植株。
该例愈伤诱导率达92.3％，愈伤组织分化率为17.7％。
实施例4
A.选洋桔梗材料‘Cessna Green’，取花萼稍长于花冠的花蕾；将花蕾放入冰箱内于4℃放置2天；取出花蕾用体积浓度为75％的酒精消毒50秒，再用质量浓度为0.1％的HgCl2消毒15分种，最后用无菌水冲洗3次，用经过高压灭菌处理的滤纸吸干花蕾上的水分；将花蕾切除花冠，剥出花药，除去花丝，将花药接种在：MS+2mg/L的KT+2mg/L的2，4-D，pH为5.5的诱导培养基上，在光照强度为：2000lx，光照时间为：10小时/天，温度25℃，培养30天，取出，放入上述诱导培养基上至花药长出愈伤组织，切下愈伤组织，未长愈伤组织的花药继续在相同的诱导培养基中，相同培养条件下进行继代培养至长出愈伤组织；
B.将A中继代培养的愈伤组织置于：MS+1.0mg/L KT+0.5mg/L NAA，pH为5.5的分化培养基上，在温度25℃，光照强度为：2000lx，光照10小时/天的条件下，培养30天，从愈伤组织分化出芽，未分化的愈伤组织继续放入相同配方的上述分化培养基上，在相同培养条件下继续分化出芽；
C.将B中分化出的芽置于：MS+0.3mg/L BA+0.1mg/L NAA，pH为5.5的繁殖培养基上，在温度为25℃，光照强度为：2000lx，光照时间为：10小时/天，培养30天，即获得花药培养的洋桔梗再生植株。
该例愈伤诱导率达85.7％，愈伤组织分化率为22.2％。
实施例5
A.选洋桔梗材料‘Volet Spring’，取花萼等长于花冠的花蕾；将花蕾于4℃冰箱中放置2天；取出花蕾用体积浓度为75％的酒精消毒30秒，再用质量浓度为0.2％的HgCl2消毒10分种，最后用无菌水冲洗2次，用经过高压灭菌处理的滤纸吸干花蕾上的水分；将花蕾切除花冠，剥出花药，除去花丝，将花药接种在：MS+3mg/L KT+1mg/L 2，4-D，pH为6.0的诱导培养基上，在光照强度为：2000lx，光照时间为：8小时/天，温度25℃，培养40天，花药长出愈伤组织，切下愈伤组织，未长愈伤组织的花药继续在相同的诱导培养基中，相同培养条件下进行继代培养至长出愈伤组织；
B.将A中继代培养的愈伤组织置于：MS+1.0mg/L KT+0.3mg/L NAA，pH为6.0的分化培养基上，在温度25℃，光照强度为：2000lx，光照12小时/天的条件下，培养40天，从愈伤组织分化出芽，未分化的愈伤组织继续放入相同配方的上述分化培养基上，在相同培养条件下继续分化出芽；
C.将B中分化出的芽置于：MS+0.4mg/L BA+0.2mg/L NAA，pH为6.0的繁殖培养基上，在温度为25℃，光照强度为：2000lx，光照时间为：12小时/天，培养30天，即获得花药培养的洋桔梗再生植株。
该例愈伤诱导率达69.2％，愈伤组织分化率为14.3％。

Claims (3)

1.一种通过花药培养获得洋桔梗再生植株的方法，其特征在于经过下列各步骤：
A.将经过预处理的花蕾灭菌后切除花冠，剥出花药，除去花丝，将花药接种在：MS+0.5～3mg/L的KT+0.5～3mg/L的2，4-D，pH为5.5～6.0的诱导培养基上，在光照强度为：1500～2000lx，光照时间为：8～12小时/天，温度为：20～28℃条件下，培养20～40天，取出，放入上述诱导培养基上，如此反复培养至花药上长出愈伤组织；
B.将A中继代培养的愈伤组织置于：MS+0.5～3mg/L的KT+0.1～0.5mg/L的NAA，pH为5.5～6.0的分化培养基上，在温度为：20～28℃，光照强度为：1500～2000lx，光照时间为：8～12小时/天的条件下，培养20～40天，使愈伤组织分化出芽，未分化的愈伤组织继续放入上述相同分化培养基上，在相同条件下继续培养至分化出芽；
C.将B中分化出的芽置于：MS+0.1～0.5mg/L的BA+0.1～0.5mg/L的NAA，pH为5.5～6.0的繁殖培养基上，在温度为：20～28℃，光照强度为：1500～2000lx，光照时间为：8～12小时/天的条件下，培养20～40天，即获得花药培养的洋桔梗再生植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述A中预处理为经过下列步骤：
(1)于冬季选洋桔梗材料，取其花蕾；
(2)将花蕾装入塑料袋中，放入3～6℃冰箱中2～4天；
(3)花蕾用体积浓度为75％的酒精消毒30～60秒，再用质量浓度为0.05～0.2％的HgCl2消毒10～20分种，最后用无菌水冲洗2～4次，吸干花蕾上的水分，得预处理灭菌的花蕾。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述A中的花蕾为花萼等长于花冠或者花萼稍长于花冠的花蕾。
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