CN116098059B - 洋桔梗游离小孢子与花药共培养诱导愈伤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种洋桔梗游离小孢子与花药共培养诱导愈伤的方法，涉及花卉育种技术领域。所述洋桔梗游离小孢子与花药共培养诱导愈伤的方法包括以下步骤：选取不同品种的杂交一代洋桔梗的未开花花蕾，经预培养、离心，得花药营养液和花药提取物，再选取不同品种的杂交一代洋桔梗的单核靠边期花蕾经预培养、消毒、粉碎、离心后，加入含有蔗糖的B5培养液，得小孢子提取物，将小孢子提取物移至表面有花药提取物的K4培养基中，撒入花药营养液，共培养诱导得愈伤组织。通过本发明的方法可以克服不同基因型对洋桔梗单倍体育种的影响，获得单倍体的愈伤组织，提高洋桔梗单倍体的诱导率，进一步解决了我国洋桔梗种子生产问题，具有巨大的潜在商业价值。
Description
技术领域
本发明涉及花卉育种技术领域，具体涉及一种洋桔梗游离小孢子与花药共培养诱导愈伤的方法。
背景技术
洋桔梗是龙胆科洋桔梗属的多年生草本植物，又名草原龙胆、德国铃兰，原产美国布拉斯加州和得克萨斯州，后引种到欧洲和日本，现代洋桔梗盆栽由日本发展而来，其花色丰富、花瓣多样、花姿典雅、花型别致，是目前国际上最流行的盆花和切花品种之一。
洋桔梗(Eustoma grandiflorum(Raf.)Shinners)作为园艺植物，在经过人类长时间的驯化后，基因型多为杂合子，杂合子不能稳定遗传，后代易产生性状分离，不利于后续生产，因此获取洋桔梗的纯合系是研究的重点和难点。洋桔梗的常规育种方法是选育自交系，耗时长且效率低，加之洋桔梗是异花授粉的植株，存在自交衰退的现象，导致获得洋桔梗自交纯合系较为困难。
单倍体育种(haploid breeding)是植物育种的重要手段之一，是缩短育种周期和快速获得纯系的最佳途径，其中的小孢子单倍体诱导技术已成为近年来育种工作者研究的热点。洋桔梗的花粉是单倍性细胞，其中只有一套染色体，通过小孢子(未成熟的花粉)培养可快速且直接的获得单倍体植株，进而通过其他手段进行染色体加倍处理获得二倍体纯系材料，可以尽早投入杂交育种生产中。
尽管小孢子诱导获得单倍体植株的方法已有报道，如CN103026969B的一种洋桔梗小孢子诱导获得单倍体植株的方法，其实验结果表明单一品种且单色的洋桔梗可以通过小孢子诱导来获得单倍体植株，然而不同基因型的小孢子诱导率不同即不同品种、不同花色的小孢子诱导率不同，该发明没有表明其可以完全克服基因型的影响，没有表明不同品种、花色均可在该方法下成功诱导小孢子获得单倍体，并且该结果未指出小孢子诱导的具体出愈率/出愈量，我们多次进行重复实验，均未能成功诱导小孢子长出愈伤，因此该报道对小孢子诱导单倍体的方法有待进一步的改进。CN105850738B的一种茄子自然游离小孢子与花药共培养诱导单倍体的方法，其技术方案中虽然涉及将茄子自然游离小孢子与花药共培养，将花药残体保留在液体培养基中与茄子的游离小孢子进行共培养，采用茄子游离小孢子与花药共培养诱导单倍体的方法在茄子单倍体诱导率不高，通过文献检索可知花药壁等组织细胞主要为二倍体，采用花药残体与茄子游离小孢子进行共培养，会产生二倍体再生植株的干扰，所以自然游离小孢子与花药共培养诱导单倍体的方法也有待进一步的改进。
洋桔梗小孢子培养与其他物种一样存在着基因型障碍，一方面原因为：不同基因型小孢子出愈量不同，多种基因型的小孢子诱导出愈量极低甚至无愈伤组织生成；另一方面则是由于游离小孢子数量较少且死亡率高，直接影响其出愈量。现有技术中，采用固液双层培养基进行小孢子培养时，由于培养基的组成固定，不同基因型的洋桔梗采用固液双层培养基进行培养时，未能针对不同基因型做出调整，存在出愈率低、无法克服基因型的问题。
因此，如何实现洋桔梗游离小孢子与花药共培养，克服基因型的影响，同时提高出愈量是当下的研究热点。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种洋桔梗游离小孢子与花药共培养诱导愈伤的方法。本发明将原有固液双层培养基改为纯固体培养基，并向其中加入6-BA和NAA两种生长激素，得K4培养基，并将K4培养基作为小孢子培养基的最下层，在此基础上加入花药提取物作为小孢子培养基的第二层，再加入花药营养液作为小孢子培养基的液体层，形成新的固液三层培养基，将游离小孢子置于新的固液三层培养基中，实现洋桔梗游离小孢子与花药的共培养诱导愈伤，克服基因型影响，提高出愈量。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种洋桔梗游离小孢子与花药提取物共培养诱导愈伤的方法，包括以下步骤：
(1)选取杂交一代洋桔梗中未开花花蕾，预培养后剥出花药，经研磨、离心后，将离心后液体灭菌，得花药营养液，将离心后固体经干燥、研磨、灭菌，得花药提取物；
(2)选取杂交一代洋桔梗中单核靠边期花蕾，预培养后剥出花药，消毒，将消毒后的花药放入添加有蔗糖的B5培养液中粉碎，得混合液，将混合液过滤，将滤液一次离心，弃去上清液，再加入添加有蔗糖的B5培养液后，二次离心，洗涤离心后固体，得小孢子提取物；
(3)将步骤(2)制得的小孢子提取物撒入表面覆有步骤(1)制得的花药提取物的K4培养基中，再加入步骤(1)制得的花药营养液，共培养诱导，即得愈伤组织。
优选的，步骤(1)中，预培养温度为4℃，预培养时间为24h。
优选的，步骤(1)中，离心转速为15000～17000rmp，离心时间为8～12min。
优选的，步骤(1)中，干燥温度为55℃，干燥时间为24h。
优选的，步骤(1)中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为15～25min。
优选的，步骤(2)中，所述单核靠边期花蕾的花冠长度大于等于花萼长度。
优选的，步骤(2)中，预培养的温度为4℃，预培养时间为24h。
优选的，步骤(2)中，消毒处理为：将花药依次用酒精、无菌水、次氯酸钠和无菌水进行冲洗。
进一步优选的，所述酒精的质量分数为75％，酒精冲洗时间为30s；次氯酸钠的质量分数为10％，次氯酸钠冲洗时间为10min；无菌水冲洗1～3次。
优选的，步骤(2)中，一次离心和二次离心转速均为1100～1300mp，离心时间均为10min。
优选的，步骤(3)中，所述的K4培养基的组成为：MS培养基、2mg/L2，4-D、1mg/LKT、1mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂。
优选的，步骤(3)中，培养条件为：22～25℃下黑暗培养30～40天。
本发明的有益效果：
1.本发明采用固体层上层、固体层下层和液体层的三层培养基，将原固液双层培养液进行综合配比后作为三层培养基中的固体层下层，在其上方覆有一层花药提取物，作为三层培养基中的固体层上层，播种小孢子后，在其上方加入花药营养液，作为三层培养基的液体层。
现有技术中，洋桔梗小孢子诱导愈伤中采用的是固液双层培养基，即固体层由MS、蔗糖和琼脂组成，液体层则是由MS、KT、2,4-D和蔗糖组成，采用固液双层培养基虽然可以正常愈伤长出，但无法克服洋桔梗不同基因型所造成的影响，而本申请采用三层培养基进行培养时，利用洋桔梗各品种自身的花药提取物和花药营养液来模拟其在自然条件下的营养生长环境，洋桔梗自身花药的看护培养更能有效提高小孢子诱导愈伤的出愈量，以此来克服洋桔梗不同基因型对小孢子诱导造成的影响，进而提高该方法的应用。
2.本发明在原有固液双层培养基的组成上增加了6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)和NAA(萘乙酸)两种激素，其中，6-BA为人工合成的细胞分裂素、NAA为人工合成的植物生长调节剂，6-BA和NAA的加入有利于愈伤组织的诱导，本发明通过大量试验后，当6-BA和NAA的配比浓度为5:1时，洋桔梗小孢子的出愈量最高。
3.本发明的洋桔梗游离小孢子和花药共培养诱导愈伤的方法，在获得小孢子提取物前去除了花丝、花药壁等组织，有效避免洋桔梗的其他组织器官对其花药培养带来的二倍体再生植株的干扰，提高洋桔梗小孢子的出愈量，使其诱导愈伤组织的数量翻倍。
附图说明
图1：单核靠边期小孢子显微镜图；
图2：剥离花药示意图；
图3：过滤收集装置示意图；
图4：实施例1中小孢子形成愈伤组织图；
图5：实施例1中愈伤组织显微镜图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术所述，洋桔梗选育自交系，耗时长且效率低，还存在自交衰退的现象，现有技术中，虽有洋桔梗小孢子诱导获得单倍体植株的方法，但该方法无法完全克服基因型影响。
基于此，本发明提供了一种洋桔梗游离小孢子与花药提取物共培养诱导愈伤的方法。该方法采用了三层培养基，所述三层培养基的液体层和固体层上层分别为花药营养液和花药提取物，固体层下层为K4培养基，通过将洋桔梗游离小孢子与花药提取物共培养，克服洋桔梗基因型的影响，提高小孢子的出愈量。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
本发明采用的杂交一代洋桔梗品种为“闪耀”、“蓝宝石”和“佛罗里达”，均可通过商业渠道购买。
实施例1：“闪耀”杂交一代洋桔梗游离小孢子与花药共培养诱导愈伤
(1)上午10时选取“闪耀”杂交一代洋桔梗中未开花的花蕾，放入托盘中置于4℃冰箱中进行预培养24h，剥出花药，液氮研磨，于16000rmp下离心10min进行固液分离，将固液分离，将离心后的液体121℃下灭菌20min，得花药营养液，将离心后的固体于55℃的烘箱中干燥24h，研磨成粉，121℃下灭菌20min后，得花药提取物；
(2)上午10时选取“闪耀”杂交一代洋桔梗中单核靠边期的花蕾，所述单核靠边期花蕾的花冠长度≥花萼长度，将其放入托盘中置于4℃冰箱中预培养24h，剥出花药，将其置于超净工作台上，分别用75％的酒精冲洗30s，无菌水冲洗2次，10％的次氯酸钠冲洗10min，无菌水冲洗2次进行消毒，晾干备用；
将消毒后的花药放入含有添加有30g/L蔗糖的B5培养液的无菌离心管中粉碎，得混合液，将混合液经两层400目双层漏斗过滤后，收集滤液于离心管中，于1200rmp一次离心10min，弃去上清液，向离心后固体中加入添加有30g/L蔗糖的B5培养液，于1200rmp下二次离心10min，清洗离心后的固体，得小孢子提取物；
(3)移取1mL步骤(2)制得的小孢子提取物撒入表面覆有步骤(1)制得的花药提取物的K4培养基中，在其表面再加入步骤(1)中的的花药培养液，于25℃下黑暗培养35天，即得愈伤组织；
其中，K4培养基的组成为：MS培养基、2mg/L 2，4-D、1mg/L KT、1mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂。
实施例2：“蓝宝石”杂交一代洋桔梗游离小孢子与花药共培养诱导愈伤
(1)上午10时选取“蓝宝石”杂交一代洋桔梗中未开花的花蕾，放入托盘中置于4℃冰箱中进行预培养24h，剥出花药，液氮研磨，于15000rmp下离心10min进行固液分离，将固液分离，将离心后的液体121℃下灭菌25min，得花药营养液，将离心后的固体于55℃的烘箱中干燥24h，研磨成粉，121℃下灭菌25min后，得花药提取物；
(2)上午10时选取“蓝宝石”杂交一代洋桔梗中单核靠边期的花蕾，所述单核靠边期花蕾的花冠长度≥花萼长度，将其放入托盘中置于4℃冰箱中预培养24h，剥出花药，将其置于超净工作台上，分别用75％的酒精冲洗30s，无菌水冲洗1次，10％的次氯酸钠冲洗10min，无菌水冲洗1次进行消毒，晾干备用；
将消毒后的花药放入无菌离心管中粉碎，无菌离心管中有添加30g/L蔗糖的B5培养液，得混合液，将混合液经两层400目双层漏斗过滤后，收集滤液于离心管中，于1100rmp一次离心10min，弃去上清液，向一次离心后固体中加入添加30g/L蔗糖的B5培养液，于1100rmp下二次离心10min，清洗离心后的固体，得小孢子提取物；
(3)移取1mL步骤(2)制得的小孢子提取物撒入表面覆有步骤(1)制得的花药提取物的K4培养基中，在其表面再加入步骤(1)中的的花药培养液，于22℃下黑暗培养30天，即得愈伤组织；
其中，K4培养基的组成为：MS培养基、2mg/L 2，4-D、1mg/L KT、1mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂。
实施例3：“佛罗里达”杂交一代洋桔梗游离小孢子与花药共培养诱导愈伤
(1)上午10时选取“佛罗里达”杂交一代洋桔梗中未开花的花蕾，放入托盘中置于4℃冰箱中进行预培养24h，剥出花药，液氮研磨，于17000rmp下离心10min进行固液分离，将固液分离，将离心后的液体121℃下灭菌15min，得花药营养液，将离心后的固体于55℃的烘箱中干燥24h，研磨成粉，121℃下灭菌15min后，得花药提取物；
(2)上午10时选取“佛罗里达”杂交一代洋桔梗中单核靠边期花蕾，所述单核靠边期花蕾的花冠长度≥花萼长度，将其放入托盘中置于4℃冰箱中预培养24h，剥出花药，将其置于超净工作台上，分别用75％的酒精冲洗30s，无菌水冲洗3次，10％的次氯酸钠冲洗10min，无菌水冲洗3次进行消毒，晾干备用；
将消毒后的花药放入无菌离心管中粉碎，无菌离心管中有添加了30g/L蔗糖的B5培养液，得混合液，将混合液经两层400目双层漏斗过滤后，收集滤液于离心管中，于1300rmp一次离心10min，弃去上清液，向一次离心后固体中加入B5培养液，于1300rmp下二次离心10min，清洗二次离心后的固体，得小孢子提取物；
(3)移取1mL步骤(2)制得的小孢子提取物撒入表面覆有步骤(1)制得的花药提取物的K4培养基中，在其表面再加入步骤(1)中的的花药培养液，于25℃下黑暗培养40天，即得愈伤组织；
其中，K4培养基的组成为：MS培养基、2mg/L 2，4-D、1mg/L KT、1mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂。
对比例1
(1)上午10时选取“闪耀”杂交一代洋桔梗中单核靠边期的花蕾，所述单核靠边期花蕾的花冠长度≥花萼长度，将其放入托盘中置于4℃冰箱中预培养24h，剥出花药，将其置于超净工作台上，分别用75％的酒精冲洗30s，无菌水冲洗1～3次，10％的次氯酸钠冲洗10min，无菌水冲洗1～3次进行消毒，晾干备用；
将消毒后的花药放入无菌离心管中粉碎，无菌离心管中有添加了30g/L蔗糖的B5培养液，得混合液，将混合液经两层400目双层漏斗过滤后，收集滤液于离心管中，于1200rmp离心10min，弃去上清液，向离心后固体中加入添加了30g/L蔗糖的B5培养液，于1200rmp下离心10min，清洗离心后的固体，得小孢子提取物；
(2)移取1mL步骤(1)制得的小孢子提取物撒入现有固液双层培养基中，于25℃下黑暗培养35天，即得愈伤组织；
其中，现有固液双层培养基的固体层为：MS、7g/L琼脂和30g/L蔗糖；
现有固液双层培养基的液体层为：MS、2mg/L 2，4-D、1mg/L KT、1mg/L 6-BA、0.2mg/LNAA和30g/L蔗糖。
对比例2
(1)上午10时选取“蓝宝石”杂交一代洋桔梗中单核靠边期的花蕾，所述单核靠边期花蕾的花冠长度≥花萼长度，将其放入托盘中置于4℃冰箱中预培养24h，剥出花药，将其置于超净工作台上，分别用75％的酒精冲洗30s，无菌水冲洗1～3次，10％的次氯酸钠冲洗10min，无菌水冲洗1～3次进行消毒，晾干备用；
将消毒后的花药放入无菌离心管中粉碎，无菌离心管中有添加了30g/L蔗糖的B5培养液，得混合液，将混合液经两层400目双层漏斗过滤后，收集滤液于离心管中，于1200rmp离心10min，弃去上清液，向离心后固体中加入添加了30g/L蔗糖的B5培养液，于1200rmp下离心10min，清洗离心后的固体，得小孢子提取物；
(2)移取1mL步骤(1)制得的小孢子提取物撒入现有固液双层培养基中，于25℃下黑暗培养35天，观察愈伤组织；
其中，现有固液双层培养基的固体层为：MS、7g/L琼脂和30g/L蔗糖；
现有固液双层培养基的液体层为：MS、2mg/L 2，4-D、1mg/L KT、1mg/L 6-BA、0.2mg/LNAA和30g/L蔗糖。
对比例3
(1)上午10时选取“佛罗里达”杂交一代洋桔梗中单核靠边期的花蕾，所述单核靠边期花蕾的花冠长度≥花萼长度，将其放入托盘中置于4℃冰箱中预培养24h，剥出花药，将其置于超净工作台上，分别用75％的酒精冲洗30s，无菌水冲洗1～3次，10％的次氯酸钠冲洗10min，无菌水冲洗1～3次进行消毒，晾干备用；
将消毒后的花药放入无菌离心管中粉碎，无菌离心管中有添加了30g/L蔗糖的B5培养液，得混合液，将混合液经两层400目双层漏斗过滤后，收集滤液于离心管中，于1200rmp离心10min，弃去上清液，向离心后固体中加入添加了30g/L蔗糖的B5培养液，于1200rmp下离心10min，清洗离心后的固体，得小孢子提取物；
(2)移取1mL步骤(1)制得的小孢子提取物撒入现有固液双层培养基中，于25℃下黑暗培养35天，观察愈伤组织；
其中，现有固液双层培养基的固体层为：MS、7g/L琼脂和30g/L蔗糖；
现有固液双层培养基的液体层为：MS、2mg/L 2，4-D、1mg/L KT、1mg/L 6-BA、0.2mg/LNAA和30g/L蔗糖。
对比例4
(1)上午10时选取“闪耀”杂交一代洋桔梗中未开花的花蕾，放入托盘中置于4℃冰箱中进行预培养24h，剥出花药，液氮研磨，于16000rmp下离心10min进行固液分离，将固液分离，将离心后的固体于55℃的烘箱中干燥24h，研磨成粉，高温灭菌后，得花药提取物；
(2)上午10时选取“闪耀”杂交一代洋桔梗中单核靠边期花蕾，所述单核靠边期花蕾的花冠长度≥花萼长度，将其放入托盘中置于4℃冰箱中预培养24h，剥出花药，将其置于超净工作台上，分别用75％的酒精冲洗30s，无菌水冲洗1～3次，10％的次氯酸钠冲洗10min，无菌水冲洗1～3次进行消毒，晾干备用；
将消毒后的花药放入含有添加了30g/L蔗糖的B5培养液的无菌离心管中粉碎，得混合液，将混合液经两层400目双层漏斗过滤后，收集滤液于离心管中，于1200rmp一次离心10min，弃去上清液，向一次离心后固体中加入添加有30g/L蔗糖的B5培养液，于1200rmp下二次离心10min，清洗二次离心后的固体，得小孢子提取物；
(3)移取1mL步骤(2)制得的小孢子提取物撒入表面覆有步骤(1)制得的花药提取物的K4培养基中，于25℃下黑暗培养35天，即得愈伤组织；
其中，K4培养基的组成为：MS培养基、2mg/L 2，4-D、1mg/L KT、1mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂。
对比例5
(1)上午10时选取“闪耀”杂交一代洋桔梗中未开花的花蕾，放入托盘中置于4℃冰箱中进行预培养24h，剥出花药，液氮研磨，于16000rmp下离心10min进行固液分离，将固液分离，将离心后的液体高温灭菌，得花药营养液；
(2)上午10时选取“闪耀”杂交一代洋桔梗中单核靠边期花蕾，所述单核靠边期花蕾的花冠长度≥花萼长度，将其放入托盘中置于4℃冰箱中预培养24h，剥出花药，将其置于超净工作台上，分别用75％的酒精冲洗30s，无菌水冲洗1～3次，10％的次氯酸钠冲洗10min，无菌水冲洗1～3次进行消毒，晾干备用；
将消毒后的花药放入含有添加有30g/L蔗糖的B5培养液的无菌离心管中粉碎，得混合液，将混合液经两层400目双层漏斗过滤后，收集滤液于离心管中，于1200rmp一次离心10min，弃去上清液，向离心后固体中加入添加有30g/L蔗糖的B5培养液，于1200rmp下二次离心10min，清洗离心后的固体，得小孢子提取物；
(3)移取1mL步骤(2)制得的小孢子提取物撒入K4培养基中，在其表面再加入步骤(1)中的的花药培养液，于25℃下黑暗培养35天，即得愈伤组织；
其中，K4培养基的组成为：MS培养基、2mg/L 2，4-D、1mg/L KT、1mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂。
试验例1：
统计实施例1～3和对比例1～3出愈量，如表2所示，
其中，出愈量为每10mL小孢子提取物诱导出的愈伤组织的数量。
表2实施例1～3和对比例1～3的出愈量(个)
| 组别 | 出愈量(个) |
| 实施例1 | 37 |
| 实施例2 | 42 |
| 实施例3 | 35 |
| 对比例1 | 2 |
| 对比例2 | 0 |
| 对比例3 | 3 |
| 对比例4 | 11 |
| 对比例5 | 15 |
由表2可以看出，采用本发明中的游离小孢子与花药共培养诱导愈伤的方法，每10mL小孢子提取物的出愈量可到35个，最高可达42个。而采用现有技术中固液双层培养基(对比例1、对比例2、对比例3)进行洋桔梗小孢子培养的出愈量最多为3个；采用花药提取物和K4培养液组成的小孢子培养基(对比例4)进行洋桔梗小孢子培养的出愈量为11个，采用花药营养液和K4培养液组成的小孢子培养基(对比例5)进行洋桔梗小孢子培养的出愈量为15个。
同时，通过对比例1、对比例2和对比例3可以看出，采用现有固液双层培养基培养不同基因型的洋桔梗小孢子，“佛罗里达”品种的洋桔梗小孢子的出愈量为3个，“闪耀”品种的洋桔梗小孢子的出愈量为2个，而“蓝宝石”品种洋桔梗小孢子的出愈量为0。由此可见，现有技术的固液双层小孢子培养基由于其培养基成分固定，无法适用于不同基因型的洋桔梗小孢子。
而本申请采用花药营养液、花药提取物和K4固体培养基组成的新的固液三层小孢子培养基，会更大限度的使得游离小孢子和花药共培养诱导出愈伤组织，相比现有的双层固液培养基出愈量低甚至不出愈，在K4固体培养基上单独添加花药营养液或花药提取物会增加小孢子出愈量，但不如三层培养基共培养下的出愈量高。
原理上，利用洋桔梗不同品种自身的花药提取物和花药营养液来模拟其在自然条件下的营养生长条件；同时，在现有培养基中添加NAA和6-BA能够诱导愈伤组织的形成，激素NAA+6-BA+KT+2,4-D配合洋桔梗自身花药的看护培养更能有效提高小孢子诱导愈伤的出愈量，以此来克服了洋桔梗不同基因型对小孢子诱导造成的影响，提高出愈量。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种洋桔梗游离小孢子与花药共培养诱导愈伤的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选取杂交一代洋桔梗中未开花花蕾，于4℃下预培养24h后剥出花药，经研磨、离心后，将离心后液体灭菌，得花药营养液，将离心后固体干燥、研磨、灭菌，得花药提取物；
离心转速为15000-17000rpm，离心时间为8-12min，干燥温度为55℃，干燥时间为24h；
（2）选取与步骤（1）相同品种的杂交一代洋桔梗的单核靠边期花蕾，4℃下预培养24h后剥出花药，消毒，将消毒后的花药放入含有蔗糖的B5培养液中粉碎，得混合液，将混合液过滤，滤液一次离心，弃去上清液后，再加入含有蔗糖的B5培养液，二次离心，洗涤二次离心后的固体，得小孢子提取物；
消毒处理为：将花药依次用酒精、无菌水、次氯酸钠和无菌水进行冲洗；一次离心和二次离心转速均为1100-1300rpm，离心时间均为10min；
（3）将步骤（2）制得的小孢子提取物撒入表面覆有步骤（1）制得的花药提取物的K4培养基中，再加入步骤(1)制得的花药营养液，于22-25℃下黑暗条件下共培养诱导30-40天即得愈伤组织；
K4培养基的组成为：MS培养基、2mg/L2，4-D、1mg/L KT、1mg/L 6-BA、0 .2mg/L NAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂。
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-
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