CN110547200B

CN110547200B - 一种万寿菊花粉分化培养基及分化培养方法

Info

Publication number: CN110547200B
Application number: CN201910941154.3A
Authority: CN
Inventors: 李传传
Original assignee: Jinan Yitong Urban Construction Group Co Ltd
Current assignee: Jinan Yitong Urban Construction Group Co., Ltd
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2039-09-30
Also published as: CN110547200A

Abstract

本发明公开了一种万寿菊花粉分化培养基及分化培养方法，其中培养基的配方包括KNO₃、NH₄NO₃、KH₂PO₄·H₂O、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、甘氨酸亚铁、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、苏氨酸、天冬酰胺、视黄醇、落地生根提取液、6‑BA、NAA、脱落酸、伏立诺他、5‑氨基乙酰丙酸、麦芽糖、甜菜碱和琼脂。利用本发明的培养基及方法进行培养，能够获得70%以上的绿苗分化率，为万寿菊花粉高效培养体系的建立提供了一定的技术支撑。

Description

一种万寿菊花粉分化培养基及分化培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种万寿菊花粉分化培养基及分化培养方法。

背景技术

万寿菊（Tagetes erecta L.）为菊科万寿菊属一年生草本植物，原产于墨西哥，其生长适温为15~20℃，在30℃以上高温环境植株徒长、开花少，10℃以下能生长但速度减慢、生长周期拉长。万寿菊较耐干旱，喜温暖、湿润和阳光充足环境，是一种多功能、多用途的植物。首先万寿菊具有较高的观赏价值，不仅可以露地栽培美化街景、庭院，而且可以盆栽布置流动式花坛。万寿菊根据其株高可分为高、中、矮三型，矮型（低于35cm）常用于花坛摆放；中型（35~50cm）可用于园林栽植成花镜或花环；高型（高于50cm）则多栽培成切花。万寿菊富含天然色素，尤其是叶黄素，其花瓣是提取叶黄素的理想材料。叶黄素具有多种生物活性，应用广泛，为当今国际研究热点之一。叶黄素是一种性能优异的抗氧化剂，具有抵御游离基在人体内造成细胞与器官损伤的功能。还有研究发现叶黄素和玉米黄素在防止老年视黄斑退化和视网膜的氧化性损伤方面有重要作用。叶黄素对皮肤癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌抑制作用，还可防治心血管硬化和冠心病。万寿菊提取物被广泛的用于生产杀虫剂、杀菌剂、抗线虫剂。万寿菊还具有药用价值，用于治疗上呼吸道感染、百日咳、结膜炎、口腔炎、牙痛、咽炎、眩晕、小儿惊风、闭经、血瘀腹痛、痈疮肿毒、防治风湿等症。

万寿菊育种工作始于20世纪20年代，选育出提取色素专用品种及观赏万寿菊新品种。美国沃勒公司、英国汤普森摩根公司主要生产盆栽观赏万寿菊，美国戈德史密斯种子公司、泛美种子公司和荷兰的斯拉斯格鲁特种子公司是世界三大万寿菊种子生产公司，主要生产观赏及色素万寿菊种子。国内20世纪80年代后开始引进万寿菊，栽培规模化发展较快，现已成为我国主要栽培的草本盆花之一，但有关万寿菊育种的研究还比较薄弱，万寿菊种子基本依赖进口，缺乏自主知识产权品种已成为我国万寿菊产业化发展的主要限制因子。

单倍体是指仅携有配子染色体数目的个体，在作物育种实践和遗传育种理论研究中均具有重要意义。离体花药培养作为人工诱导单倍体的有效途径，具有实用性。在育种实践中，对单倍体进行染色体加倍当代就可以获得纯系即双单倍体群体，比采用传统的自交纯化方法省时约 3~5年，大大提高育种效率，缩短了育种周期。单倍体只含有一套染色体，这套染色体存在着所有基因，所以即使隐性基因也能在表现型中得到表达，获得表现丰富的花粉培养株系。加倍单倍体容易获得可育的纯合体，这就有可能使人们选择不同的基因组合，尤其是可以比较容易的获得隐性纯合体。花药培养不仅能够获得高频率的变异，还可以与常规育种、分子育种和转基因技术相结合，对各种复杂的遗传规律进行分析，解决目前研究尚不能克服的困难。万寿菊具有丰富遗传内容，把万寿菊花粉直接培养成单倍体植株，再加倍成纯合体植株，就可以选育出丰富多彩的新类型。更重要的是用万寿菊单倍体作为原始的育种材料，结合常规育种和转基因技术对目前正在进行的各种遗传规律的分析研究如构建遗传图谱，进行重要性状遗传基础研究，重要性状相关基因定位和分子克隆等，将对万寿菊品种改良及优良新品种选育具有深远意义。同时，花药培养获得单倍体和纯合体，应用于杂交制种，能够快速的获得优质的Fl代，从而解决我国万寿菊种子生产的问题，具有巨大的潜在商业价值。

在离体花药培养技术的基础上，发展了花粉培养技术，也叫游离小孢子培养技术。它是在花药培养的基础上发展起来的，不经过任何形式的花药预培养，直接从花蕾或花药中获得游离的、新鲜的小孢子群体进行培养。1982 年，Lichter 首次通过培养甘蓝型油菜（Brassica napus）花粉成功获得单倍体植株，从此开创了游离小孢子培养技术。游离的小孢子在获得再生植株方面，具有很大的潜力，首先，花药培养虽然较游离小孢子培养容易，但存在花药壁和花丝等母体组织的干扰。游离小孢子培养则可消除这些因素，再生植株均来源于小孢子；同时游离小孢子具备分散性单细胞特点，是理想的遗传转化受体材料，能提高转基因选择效率，加快转基因育种进程。此外游离小孢子也是抗性筛选、突变体筛选、作物改良和植物系统发育研究的理想受体。目前，游离小孢子培养技术已逐渐变成重要的育种方法，在白菜、番茄、小麦和水稻等作物上都建立了高效再生体系，但关于观赏植物方面的研究较少。

由于菊科植物基因在花药培养方面可能具有顽拗性，导致其胚胎发生较为困难，目前花药培养在洋甘菊、一枝黄花、蛇目菊、缬草等很多菊科植物中都以失败而告终。虽然关于万寿菊花药培养的研究已有报道，但存在着愈伤组织诱导率低、分化率低、植株再生率低等问题。并且在花药培养得到的再生植株中，二倍体占了大多数，非整倍体还有一小部分，单倍体的比例较低，而这些二倍体植株可能是由单倍体自然加倍而来，也可能是花药壁及药隔等组织细胞的干扰，无法准确判断，因此开展万寿菊花粉培养十分必要。小孢子分化通常有两种途径，一种是胚状体途径，一种是愈伤组织途径。有的物种在小孢子培养过程中只有一种分化途径，有的是两种途径都有。在我们的前期研究中，已经成功对万寿菊花粉进行诱导培养获得了愈伤组织，在此基础上，我们将进一步探索万寿菊花粉愈伤组织的分化、继代增殖以及植株再生技术，为万寿菊单倍体育种提供更多试验材料。

发明内容

本发明的目的是在已有的基础上提供一种万寿菊花粉分化培养基及分化培养方法，从而建立一个完整的万寿菊花粉培养体系，为万寿菊单倍体育种工作的开展奠定基础。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种万寿菊花粉分化培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：KNO₃1700-1900mg/L，NH₄NO₃1350-1550mg/L，KH₂PO₄·H₂O 180-200mg/L，MgSO₄·7H₂O 340-360mg/L，CaCl₂·2H₂O 158-176mg/L，MnSO₄·4H₂O 9.5-10.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 7.3-8.1mg/L，H₃BO₃5.5-6.5mg/L，KI 0.7-0.8mg/L， Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02-0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.04-0.05mg/L，甘氨酸亚铁10.6-12.2mg/L，肌醇110-130mg/L，盐酸硫胺素0.5-0.7mg/L，盐酸吡哆醇1.0-1.2mg/L，烟酸0.4-0.6mg/L，苏氨酸5.0-7.0mg/L，天冬酰胺15-20mg/L，视黄醇1.6-2.0mg/L，落地生根提取液75-85ml/L，6-BA 0.8-1.2mg/L，NAA0.08-0.12mg/L，脱落酸 0.08-0.12mg/L，伏立诺他16-24μmol/L，5-氨基乙酰丙酸1.4-1.6mg/L，麦芽糖19-25g/L，甜菜碱4.0-4.8mg/L，琼脂8-10g/L，pH调节为5.6-6.0。

所述落地生根提取液的制备方法为：称取100g落地生根叶片，剪碎置于研钵中，加入 0.1mol/L盐酸40mL，粗略研碎，浸泡30min后用四层纱布过滤，残渣加蒸馏水200mL分三次浸提，过滤合并提取液。

所述培养基的最佳配方为：KNO₃1800mg/L，NH₄NO₃1450mg/L，KH₂PO₄·H₂O 190mg/L，MgSO₄·7H₂O 350mg/L，CaCl₂·2H₂O 167mg/L，MnSO₄·4H₂O 10mg/L，ZnSO₄·7H₂O 7.7mg/L，H₃BO₃5.0mg/L，KI 0.75mg/L， Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.045mg/L，甘氨酸亚铁11.4mg/L，肌醇120mg/L，盐酸硫胺素0.6mg/L，盐酸吡哆醇1.1mg/L，烟酸0.5mg/L，苏氨酸6.0mg/L，天冬酰胺17.5mg/L，视黄醇1.8mg/L，落地生根提取液80ml/L，6-BA 1.0mg/L，NAA 0.1mg/L，脱落酸 0.1mg/L，伏立诺他20μmol/L，5-氨基乙酰丙酸1.5mg/L，麦芽糖22g/L，甜菜碱4.4mg/L，琼脂9g/L，pH调节为5.6-6.0。

一种万寿菊花粉愈伤组织分化培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）待万寿菊花粉愈伤组织长至2~3mm大小，将其接种至分化培养基上进行光照、黑暗交替培养，光照培养时温度为25±1℃，光照时间为11~13h/d，光照强度为1000~2000lx，黑暗培养时温度为22±1℃，培养3~4周后愈伤组织分化成试管苗；

2）将步骤1）所得试管苗切除周围愈伤组织后转接至增殖培养基上培养，当试管苗诱导出不定芽且苗高长到2.0~3.0cm时结束增殖培养，切取2~3株不定芽作为丛生小苗，将丛生小苗转接至新鲜增殖培养基上进行继代培养；

3）待步骤2）继代增殖的试管苗长至3.0~5.0cm高时，将其单株切下接种至生根培养基上培养；

4）待生根培养基上的试管苗长出3~5片真叶并形成根系后，先在培养室内开瓶炼苗1周，然后起苗出瓶，洗净根部培养基，移栽到装有灭菌基质的营养钵中置于温室炼苗3周，最后将其移栽到大田，获得再生植株。

所述步骤2）中增殖培养基以MS为基本培养基，添加KT 0.4-0.6mg/L、三十烷醇0.01-0.02mg/L、蔗糖25-35g/L，琼脂7-9g/L，pH调节为5.6-6.0。

所述步骤2）中增殖培养的条件为：温度25±1℃，光照时间11~13h/d，光照强度1500~2000lx。

所述步骤3）中生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加IAA 0.04-0.06mg/L、多效唑2.7-3.3mg/L，蔗糖25-35g/L，琼脂5-6g/L，pH调节为5.6-6.0。

所述步骤3）中生根培养的条件为：温度25±2℃、光照时间13~15h/d、光照强度2000~3000lx。

所述步骤4）中灭菌基质为蛭石、营养土和泥炭，三者体积比为1:1:2。

本发明的有益效果：

1）本发明提供的分化培养基是根据万寿菊花粉生长发育特性进行的改良，在MS培养基的基础上对NH₄NO₃、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O、CoCl₂·6H₂O等大量、微量元素浓度进行调整，以甘氨酸亚铁作为铁盐利用率更高，还附加了苏氨酸、天冬酰胺、视黄醇、落地生根提取液、6-BA、NAA、脱落酸、伏立诺他、5-氨基乙酰丙酸、甜菜碱，对于促进愈伤组织分化，提高绿苗分化率均有显著效果。

2）本发明以万寿菊为材料，首次建立了花粉小孢子培养与植株再生体系，利用流式细胞仪进行倍性鉴定，发现再生植株中平均单倍体率为31.95%，二倍体（双单倍体）率为58.75%，弥补了万寿菊花药培养的缺陷，为万寿菊单倍体育种开辟了一条新途径。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

实施例1

一种万寿菊花粉愈伤组织分化培养方法，包括如下步骤：

1）以‘安提瓜’和‘发现’两个品种万寿菊作为供试材料，将其花粉小孢子分离出来进行诱导培养，待愈伤组织长至2~3mm大小，将愈伤组织接种至分化培养基上进行光照、黑暗交替培养，光照培养时温度为25℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500lx，黑暗培养时温度为22℃，培养3~4周后愈伤组织分化成试管苗，培养30d时统计绿苗分化率，绿苗分化率（%）=分化出绿苗的愈伤组织数/接种愈伤组织总数×100%；

采用的分化培养基的配方为：KNO₃1800mg/L，NH₄NO₃1450mg/L，KH₂PO₄·H₂O190mg/L，MgSO₄·7H₂O 350mg/L，CaCl₂·2H₂O 167mg/L，MnSO₄·4H₂O 10mg/L，ZnSO₄·7H₂O7.7mg/L，H₃BO₃5.0mg/L，KI 0.75mg/L， Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.045mg/L，甘氨酸亚铁11.4mg/L，肌醇120mg/L，盐酸硫胺素0.6mg/L，盐酸吡哆醇1.1mg/L，烟酸0.5mg/L，苏氨酸6.0mg/L，天冬酰胺17.5mg/L，视黄醇1.8mg/L，落地生根提取液80ml/L，6-BA 1.0mg/L，NAA 0.1mg/L，脱落酸 0.1mg/L，伏立诺他20μmol/L，5-氨基乙酰丙酸1.5mg/L，麦芽糖22g/L，甜菜碱4.4mg/L，琼脂9g/L，pH调节为5.8；落地生根提取液的制备方法为：称取100g落地生根叶片，剪碎置于研钵中，加入 0.1mol/L盐酸40mL，粗略研碎，浸泡30min后用四层纱布过滤，残渣加蒸馏水200mL分三次浸提，过滤合并提取液。

2）将步骤1）所得试管苗切除周围愈伤组织后转接至增殖培养基上，在温度25℃，光照时间12h/d，光照强度1800lx的条件下培养，当试管苗诱导出不定芽且苗高长到2.0~3.0cm时结束增殖培养，切取2~3株不定芽作为丛生小苗，将丛生小苗转接至新鲜增殖培养基上进行继代培养；增殖培养基以MS为基本培养基，添加KT 0.5mg/L、三十烷醇0.015mg/L、蔗糖30g/L，琼脂8g/L，pH调节为5.8。

3）待步骤2）继代增殖的试管苗长至3.0~5.0cm高时，将其单株切下接种至生根培养基上，在温度25℃、光照时间14h/d、光照强度2500lx的条件下培养；生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加IAA 0.05mg/L、多效唑3.0mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5.5g/L，pH调节为5.8。

4）待生根培养基上的试管苗长出3~5片真叶并形成根系后，先在培养室内开瓶炼苗1周，然后起苗出瓶，洗净根部培养基，移栽到装有灭菌基质（蛭石、营养土和泥炭，三者体积比为1:1:2）的营养钵中置于温室炼苗3周，最后将其移栽到大田，获得再生植株。

对比例1：落地生根提取液对万寿菊花粉愈伤组织绿苗分化的影响

相对于实施例1，更改了分化培养基的配方，具体如下：将分化培养基中落地生根提取液的浓度改为20ml/L、40ml/L、60ml/L、100ml/L，以不附加落地生根提取液作为对照，将‘安提瓜’和‘发现’的花粉愈伤组织分别接种至上述几组分化培养基上进行光照、黑暗交替培养，结果如表1所示。

从表1可以看出，与对照相比，附加20~100ml/L的落地生根提取液，‘安提瓜’和‘发现’的绿苗分化率均有所提高，其中附加80ml/L的落地生根提取液最有利于万寿菊花粉愈伤组织分化，绿苗分化率最高。落地生根为景天科多年生肉质草本植物，全草入药，可治咽喉肿痛、肺热咳嗽、跌打损伤、凉血止血，其化学成分丰富多样，主要含有黄酮类、三萜类、生物碱类及酸类化合物等成分。我们通过试验发现在分化培养基中附加落地生根提取液对万寿菊花粉愈伤组织分化能产生有益效果，但具体是哪种或哪些成分产生效果还有待进一步研究。

对比例2：脱落酸对万寿菊花粉愈伤组织绿苗分化的影响

相对于实施例1，更改了分化培养基的配方，具体如下：将分化培养基中脱落酸的浓度改为0.05mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L，以不附加脱落酸作为对照，将‘安提瓜’和‘发现’的花粉愈伤组织分别接种至上述几组分化培养基上进行光照、黑暗交替培养，结果如表2所示。

脱落酸是一种重要的植物生长调节剂，从表2可以看出，与对照相比，随着脱落酸浓度的增加，‘安提瓜’和‘发现’的绿苗分化率均呈现先升后降的趋势，当脱落酸浓度为0.1mg/L时，‘安提瓜’和‘发现’的绿苗分化率最高；当脱落酸浓度高于0.3mg/L时，‘安提瓜’和‘发现’和绿苗分化率显著下降，到1.0mg/L时绿苗分化率已经接近或低于对照，说明低浓度的脱落酸能够促进万寿菊花粉愈伤组织分化，而高浓度的脱落酸则会抑制其分化。

对比例3：伏立诺他对万寿菊花粉愈伤组织绿苗分化的影响

相对于实施例1，更改了分化培养基的配方，具体如下：将分化培养基中伏立诺他的浓度改为1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L，以不附加伏立诺他作为对照，将‘安提瓜’和‘发现’的花粉愈伤组织分别接种至上述几组分化培养基上进行光照、黑暗交替培养，结果如表3所示。

伏立诺他是一种化学表观遗传修饰剂，可抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，提高组蛋白乙酰化水平，从而激活基因表达。表观遗传机制在植物发育、非生物逆境抗性等方面起着关键作用。从表3可以看出，当伏立诺他浓度为1μmol/L时，‘安提瓜’和‘发现’的绿苗分化率与对照组没有显著差异；当伏立诺他浓度为20μmol/L时，‘安提瓜’和‘发现’的绿苗分化率均达到高，比对照组分别提高了27.70%和32.06%；当伏立诺他浓度为50μmol/L和100μmol/L时，‘安提瓜’和‘发现’的绿苗分化率则显著下降，可见高浓度的伏立诺他不利于万寿菊花粉愈伤组织的分化。

对比例4：5-氨基乙酰丙酸对万寿菊花粉愈伤组织绿苗分化的影响

相对于实施例1，更改了分化培养基的配方，具体如下：将分化培养基中5-氨基乙酰丙酸的浓度改为0.5mg/L、1.0mg/L、3.0mg/L、6.0mg/L，以不附加5-氨基乙酰丙酸作为对照，将‘安提瓜’和‘发现’的花粉愈伤组织分别接种至上述几组分化培养基上进行光照、黑暗交替培养，结果如表4所示。

5-氨基乙酰丙酸是一种广泛存在于植物、动物、真菌、细菌等生物机体活细胞中的非蛋白氨基酸，是卟啉化合物生物合成的关键前体物质。5-氨基乙酰丙酸是生物合成叶绿素、血红素、维生素B、光敏素等物质的必须因子，在生物体内光合作用与呼吸作用中联系十分广泛，还参与植物生长发育的调节过程，具有类似植物激素的生理活性。从表4可以看出，与对照相比，附加0.5~6.0mg/L的5-氨基乙酰丙酸，‘安提瓜’和‘发现’的绿苗分化率均有所提高，当5-氨基乙酰丙酸浓度为1.5mg/L时，‘安提瓜’和‘发现’的绿苗分化率均达到最高，继续升高5-氨基乙酰丙酸的浓度至3.0mg/L和6.0mg/L，绿苗分化率没有明显变化，因此5-氨基乙酰丙酸的最佳浓度为1.5mg/L。

实施例5：再生植株倍性鉴定试验

采用流式细胞仪对实施例1获得的再生植株进行倍性鉴定，具体方法为：取大于1cm²的植株叶片，在55mm的培养皿中用锋利的刀片切碎叶片，加入 400uL的提取液（15mol/LTris-HCl(pH7.5)，80mol/LKCl，20mol/LNaCl，20mol/LEDTA-Na₂，15mol/L巯基乙醇，0.05%的Triton X-100）。放置1分钟，再用50μm的微孔尼龙网过滤，滤液收集在上机测试用的标准试管中，然后于1000r/min 离心8min，弃去上清液，再加入 1mL的碘化丙啶染色液,在黑暗低温处染色20分钟，之后上机检测，结果如表5。

由表5可知，‘安提瓜’的再生植株中，单倍体率为35.6%，二倍体率为56.7%，‘发现’的再生植株中，单倍体率为28.3%，二倍体率为60.8%，平均单倍体率为31.95%，二倍体率为58.75%。由于再生植株是由万寿菊花粉小孢子诱导分化而来，基本可以排除体细胞干扰，因此二倍体最可能是由单倍体自然加倍而来，即双单倍体。

上述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims

1.一种万寿菊花粉分化培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：KNO₃1700-1900mg/L，NH₄NO₃1350-1550mg/L，KH₂PO₄·H₂O 180-200mg/L，MgSO₄·7H₂O 340-360mg/L，CaCl₂·2H₂O 158-176mg/L，MnSO₄·4H₂O 9.5-10.5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 7.3-8.1mg/L，H₃BO₃5.5-6.5mg/L，KI 0.7-0.8mg/L， Na₂MoO₄·2H₂O 0.2-0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02-0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.04-0.05mg/L，甘氨酸亚铁10.6-12.2mg/L，肌醇110-130mg/L，盐酸硫胺素0.5-0.7mg/L，盐酸吡哆醇1.0-1.2mg/L，烟酸0.4-0.6mg/L，苏氨酸5.0-7.0mg/L，天冬酰胺15-20mg/L，视黄醇1.6-2.0mg/L，落地生根提取液75-85ml/L，6-BA 0.8-1.2mg/L，NAA0.08-0.12mg/L，脱落酸 0.08-0.12mg/L，伏立诺他16-24μmol/L，5-氨基乙酰丙酸1.4-1.6mg/L，麦芽糖19-25g/L，甜菜碱4.0-4.8mg/L，琼脂8-10g/L，pH调节为5.6-6.0。

2.根据权利要求1所述的一种万寿菊花粉分化培养基，其特征在于，所述落地生根提取液的制备方法为：称取100g落地生根叶片，剪碎置于研钵中，加入 0.1mol/L盐酸40mL，粗略研碎，浸泡30min后用四层纱布过滤，残渣加蒸馏水200mL分三次浸提，过滤合并提取液。

3.根据权利要求1所述的一种万寿菊花粉分化培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：KNO₃1800mg/L，NH₄NO₃1450mg/L，KH₂PO₄·H₂O 190mg/L，MgSO₄·7H₂O 350mg/L，CaCl₂·2H₂O 167mg/L，MnSO₄·4H₂O 10mg/L，ZnSO₄·7H₂O 7.7mg/L，H₃BO₃5.0mg/L，KI 0.75mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.045mg/L，甘氨酸亚铁11.4mg/L，肌醇120mg/L，盐酸硫胺素0.6mg/L，盐酸吡哆醇1.1mg/L，烟酸0.5mg/L，苏氨酸6.0mg/L，天冬酰胺17.5mg/L，视黄醇1.8mg/L，落地生根提取液80ml/L，6-BA 1.0mg/L，NAA0.1mg/L，脱落酸 0.1mg/L，伏立诺他20μmol/L，5-氨基乙酰丙酸1.5mg/L，麦芽糖22g/L，甜菜碱4.4mg/L，琼脂9g/L，pH调节为5.6-6.0。

4.一种万寿菊花粉愈伤组织分化培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）待万寿菊花粉愈伤组织长至2~3mm大小，将其接种至权利要求1-3任一项所述的分化培养基上进行光照、黑暗交替培养，光照培养时温度为25±1℃，光照时间为11~13h/d，光照强度为1000~2000lx，黑暗培养时温度为22±1℃，培养3~4周后愈伤组织分化成试管苗；

5.根据权利要求4所述的一种万寿菊花粉愈伤组织分化培养方法，其特征在于，所述步骤2）中增殖培养基以MS为基本培养基，添加KT 0.4-0.6mg/L、三十烷醇0.01-0.02mg/L、蔗糖25-35g/L，琼脂7-9g/L，pH调节为5.6-6.0。

6.根据权利要求4所述的一种万寿菊花粉愈伤组织分化培养方法，其特征在于，所述步骤2）中增殖培养的条件为：温度25±1℃，光照时间11~13h/d，光照强度1500~2000lx。

7.根据权利要求4所述的一种万寿菊花粉愈伤组织分化培养方法，其特征在于，所述步骤3）中生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加IAA 0.04-0.06mg/L、多效唑2.7-3.3mg/L，蔗糖25-35g/L，琼脂5-6g/L，pH调节为5.6-6.0。

8.根据权利要求4所述的一种万寿菊花粉愈伤组织分化培养方法，其特征在于，所述步骤3）中生根培养的条件为：温度25±2℃、光照时间13~15h/d、光照强度2000~3000lx。

9.根据权利要求4所述的一种万寿菊花粉愈伤组织分化培养方法，其特征在于，所述步骤4）中灭菌基质为蛭石、营养土和泥炭，三者体积比为1:1:2。