CN117016394B - 一种白术试管苗及其培养方法与培育白术待移栽苗的方法 - Google Patents

一种白术试管苗及其培养方法与培育白术待移栽苗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物培养技术领域，尤其涉及一种白术试管苗及其培养方法与培育白术待移栽苗的方法。本发明提供了一种白术壮苗生根培养基，以1/2MS培养基为基础还包括如下浓度的组分：吲哚乙酸0.3～0.5mg/L、多效唑0.2～0.5g/L、琼脂7.0～7.5g/L、蔗糖25～35g/L；所述白术壮苗生根培养基的pH为5.8～6.0。本发明的壮苗生根培养基可以得到根长为5.4cm，根数量为12个以上的白术试管苗。将白术试管苗移栽至育苗基质中，移栽成活率能达到90％以上。为优良品种的快速繁殖提供了新的途径。

Description

一种白术试管苗及其培养方法与培育白术待移栽苗的方法
技术领域
本发明涉及植物培养技术领域，尤其涉及一种白术试管苗及其培养方法与培育白术待移栽苗的方法。
背景技术
白术(学名：Atractylodes macrocephala Koidz)：菊科苍术属多年生草本植物，主产于浙江、江苏、安徽、四川、重庆、云南、贵州、湖北等省市，是著名中药材“浙八味”之一，为我国常用大宗中药材品种之一，具有健脾益气、燥湿利水、安胎、和胃、固表、止汗等功能，主治脾虚食少、消化不良、腹胀泄泻、痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安等症。白术含挥发油，油中主要成分为苍术酮、苍术醇、白术内酯等。现代药理研究表明，白术具有利尿、降低血糖升高白细胞等功效，同时白术还能调节消化系统、增强免疫力、增强造血功能以及起到延缓衰老的作用，对降低血糖、抑制癌症等都有一定的效果。
根据我国中药材的栽培现状，白术生产过程中长期只种不选，品种退化，药材产量和质量逐年下降，化学含量不稳定，无法满足市场需求。市场上白术药材源于人工栽培，传统地道产区栽培资源逐年萎缩，白术药材价格波动较大且质量也参差不齐。利用植物组织培养技术可以改善这种现状，提高白术药材的质量和产量。
基于此，提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白术试管苗及其培养方法与培育白术待移栽苗的方法，为白术优良品种的快速繁殖提供了新的途径。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种白术壮苗生根培养基，以1/2MS培养基为基础还包括如下浓度的组分：
吲哚乙酸0.3～0.5mg/L、多效唑0.2～0.5g/L、琼脂7.0～7.5g/L、蔗糖25～35g/L；
所述白术壮苗生根培养基的pH为5.8～6.0。
本发明还提供了一种白术试管苗的培养方法，包括如下步骤：
(1)将白术种子进行消毒，得到消毒的白术种子；
(2)将所述消毒的白术种子接种至启动培养基中，培养10～15d，得到白术无菌苗；
(3)将所述白术无菌苗接种至增殖培养基中，培养20～35d，得到白术增殖苗；
(4)将所述白术增殖苗接种至白术壮苗生根培养基中，培养15～20d，得到白术试管苗；
步骤(4)所述的白术壮苗生根培养基为所述的白术壮苗生根培养基。
作为优选，所述白术种子为去除种皮上毛茸的白术种子；
所述消毒的方法为：先利用酒精消毒30～40s，再用氯化汞消毒5～7min；
所述酒精的浓度为70～80vt％；
所述氯化汞的浓度为0.08～0.12wt％。
作为优选，步骤(2)所述启动培养基以MS培养基为基础还包括如下浓度的组分：
赤霉素0.3～0.5mg/L、6-苄氨基嘌呤3.0mg/L、琼脂7.0～7.5g/L、蔗糖25～35g/L；
所述启动培养基的pH为5.8～6.0。
作为优选，步骤(3)所述增殖培养基以MS培养基为基础还包括如下浓度的组分：
6-苄氨基嘌呤1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.5～1.0mg/L、琼脂7.0～7.5g/L、蔗糖25～35g/L；
所述增殖培养基的pH为5.8～6.0。
作为优选，步骤(2)～步骤(4)中所述培养的光照强度独立为2000～3000Lx；
步骤(2)～步骤(4)中所述培养的温度独立为22～25℃；
步骤(2)～步骤(4)中所述培养的湿度独立为55～65％；
步骤(2)～步骤(4)中所述培养的光照时间独立为14～18h/d。
本发明还提供了所述的培养方法培养得到的白术试管苗。
本发明还提供了一种育苗基质，所述育苗基质包括如下质量比的组分：
蛭石：营养土：河沙为1：1～2：0～2；
所述育苗基质用于将所述的白术试管苗培育成白术待移栽苗。
本发明还提供了一种白术待移栽苗的培育方法，包括如下步骤：
(1)将白术试管苗炼苗5～7d，得到待培育白术苗；
(2)将所述待培育白术苗移栽至育苗基质中，培育6～8d，得到白术待移栽苗；
所述白术试管苗为所述的白术试管苗；
所述育苗基质为所述的育苗基质。
作为优选，所述炼苗的光照强度为2500～3000Lx；
所述炼苗的光照时间为11～13h/d。
本发明提供了一种白术试管苗及其培养方法与培育白术待移栽苗的方法，本发明的方法与现有技术方法的优势在于：
利用本发明的增殖培养基，可以得到增殖系数为4.9～5.5的白术增殖苗。利用本发明的白术壮苗生根培养基，可以得到根长度为5.4cm，根数量为12个以上的白术试管苗。利用本发明的育苗基质，可以将试管苗的移栽成活率提高至90％以上。按照本发明的培养基以及培养方法在45～70d就可以得到白术试管苗，将白术试管苗进行炼苗，培育后就可以得到移栽成活率高的白术待移栽苗。为白术优良品种的快速繁殖提供了新的途径。
附图说明
图1为白术无菌苗；
图2为白术在增殖培养基中生长20d的情况；
图3为白术在增殖培养基中生长35d的情况；
图4为待培育白术苗；
图5为白术待移栽苗的生长情况。
具体实施方式
本发明提供了一种白术壮苗生根培养基，以1/2MS培养基为基础还包括如下浓度的组分：
吲哚乙酸0.3～0.5mg/L，优选为0.4mg/L；
多效唑0.2～0.5g/L，优选为0.3～0.4g/L，进一步优选为0.35g/L；
琼脂7.0～7.5g/L，优选为7.1～7.4g/L，进一步优选为7.25g/L；
蔗糖25～35g/L，优选为27～33g/L，进一步优选为30g/L；
所述白术壮苗生根培养基的pH为5.8～6.0，优选为5.9。
本发明还提供了一种白术试管苗的培养方法，包括如下步骤：
(1)将白术种子进行消毒，得到消毒的白术种子；(2)将所述消毒的白术种子接种至启动培养基中，培养10～15d，得到白术无菌苗；(3)将所述白术无菌苗接种至增殖培养基中，培养20～35d，得到白术增殖苗；(4)将所述白术增殖苗接种至白术壮苗生根培养基中，培养15～20d，得到白术试管苗；步骤(4)所述的白术壮苗生根培养基为所述的白术壮苗生根培养基。
在本发明中，所述白术种子为去除种皮上毛茸的白术种子，所述去除种皮上毛茸的方法为酒精灯火焰燃烧法；所述白术种子为粒大、饱满的白术种子；所述白术种子取自浙江省台州市天台县。所述消毒的方法为：先利用酒精消毒30～40s，再用氯化汞消毒5～7min；所述酒精的浓度为70～80vt％，优选为75vt％；所述酒精消毒的时间优选为35s；所述氯化汞的浓度为0.08～0.12wt％，优选为0.1wt％；所述氯化汞消毒的时间优选为6min；所述酒精消毒后经过水冲洗2～3次，再进行氯化汞消毒；所述氯化汞消毒后也要用水冲洗2～3次。在本发明中，白术增殖苗的苗长3～5cm。
在本发明中，步骤(2)所述启动培养基以MS培养基为基础还包括如下浓度的组分：
赤霉素0.3～0.5mg/L，优选为0.4mg/L；6-苄氨基嘌呤3.0mg/L；琼脂7.0～7.5g/L，优选为7.1～7.4g/L，进一步优选为7.25g/L；蔗糖25～35g/L，优选为27～33g/L，进一步优选为30g/L；所述启动培养基的pH为5.8～6.0，优选为5.9。
在本发明中，步骤(3)所述增殖培养基以MS培养基为基础还包括如下浓度的组分：
6-苄氨基嘌呤1.0～2.0mg/L，优选为1.5mg/L；萘乙酸0.5～1.0mg/L，优选为0.75mg/L；琼脂7.0～7.5g/L，优选为7.25g/L；蔗糖25～35g/L，优选为30g/L；所述增殖培养基的pH为5.8～6.0，优选为5.9。
在本发明中，步骤(2)～步骤(4)中所述培养的光照强度独立为2000～3000Lx，优选为2500Lx；步骤(2)～步骤(4)中所述培养的温度独立为22～25℃，优选为23.5℃；步骤(2)～步骤(4)中所述培养的湿度独立为55～65％，优选为60％；步骤(2)～步骤(4)中所述培养的光照时间独立为14～18h/d，优选为16h/d。
本发明还提供了所述的培养方法培养得到的白术试管苗。
本发明还提供了一种育苗基质，所述育苗基质包括如下质量比的组分：
蛭石：营养土：河沙为1：1～2：0～2，优选为1:2:1；
所述育苗基质用于将所述的白术试管苗培育成白术待移栽苗。
本发明还提供了一种白术待移栽苗的培育方法，包括如下步骤：
(1)将白术试管苗炼苗5～7d，得到待培育白术苗；(2)将所述待培育白术苗移栽至育苗基质中，培育6～8d，得到白术待移栽苗；
所述白术试管苗为所述的白术试管苗；
所述育苗基质为所述的育苗基质。
作为优选，所述炼苗的光照强度为2500～3000Lx，优选为2800Lx；
所述炼苗的光照时间为11～13h/d，优选为12h/d。
在本发明中，所述炼苗的方法为揭开组培瓶盖，在光照培养箱中炼苗；所述炼苗的时机为白术试管苗根长至3～5cm时，优选为4cm时；所述炼苗的时间优选为6d；所述培育的时间优选为7d。待培育白术苗在移栽前需要去除基部的培养基，接入多菌灵溶液中浸泡20～30min，再进行移栽；所述浸泡的时间优选为25min。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明中，所述白术种子来源于浙江省台州市天台县。
在本发明中，所述MS培养基包括如下浓度的组分：硫酸铵1.32g/L、硝酸钾2.0g/L、七水硫酸镁0.36g/L、磷酸二氢钾0.17g/L、氯化钙0.44g/L、硫酸锰0.0168g/L、七水硫酸锌0.0085g/L、硼酸0.0065g/L、碘化钾0.00083g/L、钼酸钠0.00025g/L、硫酸铜0.000025g/L、氯化钴0.000025g/L、七水硫酸铁0.0278g/L、乙二胺四乙酸二钠0.0373g/L、甘氨酸0.0020g/L、盐酸硫胺素0.0004g/L、盐酸吡哆醇0.0005g/L、肌醇0.010g/L。
实验例1
选取粒大、饱满的白术种子经过酒精灯火焰去除种皮上的毛茸，用75vt％的酒精浸泡去除种皮上毛茸的白术种子，浸泡消毒30s，用水冲洗3次，再用0.1wt％的氯化汞浸泡消毒6min，用水冲洗3次，得到消毒的白术种子。将消毒的白术种子接种至启动培养基中，每个培养瓶中接种3粒种子，培养12d，种胚在子叶处诱导出大量不定芽，得到白术无菌苗，白术无菌苗如图1所示。切取白术无菌苗，取3个不定芽接入添加不同激素浓度的增殖培养基中，培养7d，观察白术无菌苗在不同激素浓度的培养基中的增殖系数，确定增殖培养基中各激素的最适添加浓度。增殖系数＝7d形成的有效苗数/接种苗数。
培养白术无菌苗和增殖苗过程的条件如下：光照强度3000Lx，培养的温度为22℃，培养的湿度为60％，培养的光照时间为16h/d。
启动培养基以MS培养基为基础，还包括0.3mg/L赤霉素(GA3)、3.0mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA)、7.2g/L琼脂、30g/L蔗糖；pH为5.8。
增殖培养基以MS培养基为基础，还包括1.0～2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤(6-BA)、0～1.0mg/L的萘乙酸(NAA)、7.2g/L琼脂、30g/L蔗糖；pH为5.8。具体设置如表1所示。增殖培养基中不同的激素浓度对增殖系数的影响如表1所示。
表1不同浓度的激素组合对白术组培苗增殖的影响
组别 培养基类型 6-BA(mg/L) NAA(mg/L) 增殖系数
A MS 1.0 0 3.2
B MS 1.0 0.5 3.8
C MS 2.0 0 4.3
D MS 2.0 0.5 4.9
E MS 2.0 1.0 5.5
增殖系数是一个衡量植物分化能力的指标。由表1可知，经过7d的培养，白术组培苗在不同浓度激素组成的培养基中的增殖系数不同，增殖培养基中的6-BA的浓度为2.0mg/L，NAA的浓度为1.0mg/L时，增殖系数能达到5.5，具有很高的分化能力。
实验例2
选取粒大、饱满的白术种子经过酒精灯火焰去除种皮上的毛茸，用75vt％的酒精浸泡去除种皮上毛茸的白术种子，浸泡消毒30s，用水冲洗3次，再用0.1wt％的氯化汞浸泡消毒6min，用水冲洗3次，得到消毒的白术种子。将消毒的白术种子接种至启动培养基中，每个培养瓶中接种3粒种子，培养12d，种胚在子叶处诱导出大量不定芽，得到白术无菌苗。切取白术无菌苗，取3个不定芽接种至增殖培养基中，培养20～35d，得到白术增殖苗。在增殖培养基中培养20d的白术增殖苗的生长情况如图2所示，在增殖培养基中培养35d的白术增殖苗的生长情况如图3所示。将在增殖培养中培养20d的白术增殖苗接种于含有不同激素的白术壮苗生根培养基中，培养20d，得到白术试管苗，研究不同激素对白术生根的影响，筛选适宜白术生根的白术壮苗生根培养基中的激素组合。白术壮苗生根培养基中的激素组合和筛选结果如表2所示。
启动培养基如实验例1所述的启动培养基；
增殖培养基以MS培养基为基础，还包括2.0mg/L的6-BA、1.0mg/L的NAA、7.2g/L琼脂、30g/L蔗糖。pH为5.8。
白术壮苗生根培养基以1/2MS培养基为基础，还包括表2中的激素种类以及7.2g/L琼脂、30g/L蔗糖，pH为5.8。
培养白术无菌苗、增殖苗和白术试管苗的过程中的条件：光照强度3000Lx，培养的温度为22℃，培养的湿度为60％，培养的光照时间为16h/d。
表2不同激素组合对白术生根的影响
IAA表示吲哚乙酸、ABT为生根粉、IBA为吲哚丁酸、PP333为多效唑。由表2可知，将IAA和PP333加入到1/2MS培养基中设置白术壮苗生根培养基，培养得到的白术试管苗的根长度最长，为5.4cm，根数量最多，为13个。
图2和图3显示，白术增殖苗的苗长至少为3～5cm。
实验例3
将实验例2在1/2MS+IAA0.5 mg/L+PP3330.5 mg/L培养基中培养20d得到的白术试管苗，揭开组培瓶盖，在3000Lx的光照培养箱中炼苗6d，得到待培育白术苗。将待培育白术苗基部的培养基洗净，放入0.2％的多菌灵溶液中，浸泡30min后，将其移栽于含有不同育苗基质的穴盘中进行培养，浇透水，薄膜覆盖保湿，注意通风和保持适宜的温度，7d后揭开薄膜，观察白术的生长情况，计算白术试管苗在不同育苗基质中的成活率。成活率＝成活的苗数/移栽的试管苗数×100％。不同育苗基质和移栽成活率如表3所示。洗净基部培养基的待培育白术苗如图4所示。
表3不同育苗基质对白术试管苗移栽成活率的影响
编号 基质配比 成活率(％)
A 营养土 66.3
B 营养土：蛭石＝1:1 84.7
C 营养土：蛭石＝2:1 76.6
D 蛭石：营养土：河沙＝1:2:1 90.4
E 珍珠岩 40.3
F 河沙：蛭石＝1:1 51.7
表3显示，将白术试管苗移栽至B和D育苗基质中，白术试管苗的移栽成活率高达84.7％以上。说明营养土、蛭石组成的育苗基质适宜白术生长，在其中加入河沙后，可以提高白术试管苗的移栽成活率。
实施例1
选取粒大、饱满的白术种子经过酒精灯火焰去除种皮上的毛茸，用75vt％的酒精浸泡去除种皮上毛茸的白术种子，浸泡消毒30s，用水冲洗3次，再用0.1wt％的氯化汞浸泡消毒6min，用水冲洗3次，得到消毒的白术种子。将消毒的白术种子接种至启动培养基中，每个培养瓶中接种3粒种子，培养10d，种胚在子叶处诱导出不定芽，得到白术无菌苗。切取白术无菌苗，取3个不定芽接种至增殖培养基中，培养32d，得到白术增殖苗，将白术增殖苗接种至白术壮苗生根培养基中，培养16d，得到白术试管苗。
白术启动培养基以MS培养基为基础，还包括如下浓度的组分：0.5mg/L GA3、3.0mg/L 6-BA、7.2g/L琼脂、30g/L蔗糖，pH为5.8。
增殖培养基增殖培养基以MS培养基为基础，还包括：2.0mg/L 6-BA、0.5mg/LNAA、7.2g/L琼脂、30g/L蔗糖，pH为5.8。
白术壮苗生根培养基以1/2MS培养基为基础还包括如下浓度的组分：IAA 0.3mg/L、PP3330.5 g/L、琼脂7.2g/L、蔗糖30g/L；pH为5.8。
按照该壮苗生根培养基培养得到的白术试管苗的平均根长度为5.3cm，根数量14。
将揭开白术试管苗组培瓶盖，在2500Lx的光照培养箱中炼苗6d，得到待培育白术苗。将待培育白术苗基部的培养基洗净，放入0.1％的多菌灵溶液中，浸泡30min后，将其移栽于含有育苗基质(蛭石：营养土：河沙的质量比为1:2:2)的穴盘中进行培养，浇透水，薄膜覆盖保湿，注意通风和保持适宜的温度，7d后揭开薄膜，得到白术待移栽苗，观察白术待移栽苗的生长情况，揭开薄膜后的白术待移栽苗的生长情况如图5所示。计算白术试管苗的移栽成活率。白术试管苗在该育苗基质下的移栽成活率为91.2％。
所有培养过程的条件为：光照强度3000Lx，培养的温度为22℃，培养的湿度为60％，培养的光照时间为16h/d。
实施例2
选取粒大、饱满的白术种子经过酒精灯火焰去除种皮上的毛茸，用75vt％的酒精浸泡去除种皮上毛茸的白术种子，浸泡消毒30s，用水冲洗3次，再用0.1wt％的氯化汞浸泡消毒6min，用水冲洗3次，得到消毒的白术种子。将消毒的白术种子接种至启动培养基中，每个培养瓶中，接种3粒种子，培养15d，种胚在子叶处诱导出不定芽，得到白术无菌苗。切取白术无菌苗，取3个不定芽接种至增殖培养基中，培养28d，得到白术增殖苗，将白术增殖苗接种至白术壮苗生根培养基中，培养18d，得到白术试管苗。
启动培养基以MS培养基为基础，还包括如下浓度的组分：还包括0.4mg/LGA3、3.0mg/L 6-BA、7.2g/L琼脂、30g/L蔗糖，pH为5.8。
增殖培养基增殖培养基以MS培养基为基础，还包括2.0mg/L 6-BA、1.0mg/LNAA、7.2g/L琼脂、30g/L蔗糖，pH为5.8。
白术壮苗生根培养基以1/2MS培养基为基础还包括如下浓度的组分：IAA 0.4mg/L、PP3330.2 g/L、琼脂7.2g/L、蔗糖30g/L；pH为5.8。
按照该壮苗生根培养基培养得到的白术试管苗的平均根长度为5.2cm，根数量12。
将揭开白术试管苗组培瓶盖，在3000Lx的光照培养箱中炼苗6d，得到待培育白术苗。将待培育白术苗基部的培养基洗净，放入0.2％的多菌灵溶液中，浸泡30min后，将其移栽于含有育苗基质(蛭石：营养土：河沙的质量比为1:2:1)的穴盘中进行培养，浇透水，薄膜覆盖保湿，注意通风和保持适宜的温度，7d后揭开薄膜，得到白术待移栽苗。
所有培养过程的条件为：光照强度3000Lx，培养的温度为22℃，培养的湿度为60％，培养的光照时间为16h/d。
由以上实施例可知，本发明提供了一种白术试管苗及其培养方法与培育白术待移栽苗的方法，利用本发明的增殖培养基，可以得到增殖系数为4.9～5.5的白术增殖苗。利用本发明的白术壮苗生根培养基，可以得到根长度为5.4cm，根数量为12个以上的白术试管苗。利用本发明的育苗基质，可以将试管苗的移栽成活率提高至90％以上。为白术优良品种的快速繁殖提供了新的途径。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种白术试管苗的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将白术种子进行消毒，得到消毒的白术种子；
(2)将所述消毒的白术种子接种至启动培养基中，培养10～15d，得到白术无菌苗；
(3)将所述白术无菌苗接种至增殖培养基中，培养20～35d，得到白术增殖苗；
(4)将所述白术增殖苗接种至白术壮苗生根培养基中，培养15～20d，得到白术试管苗；
步骤(4)所述的白术壮苗生根培养基以1/2MS培养基为基础还由如下浓度的组分组成：
吲哚乙酸0.3～0.5mg/L、多效唑0.2～0.5g/L、琼脂7.0～7.5g/L、蔗糖25～35g/L；
所述白术壮苗生根培养基的pH为5.8～6.0；
步骤(2)所述启动培养基以MS培养基为基础还由如下浓度的组分组成：
赤霉素0.3～0.5mg/L、6-苄氨基嘌呤3.0mg/L、琼脂7.0～7.5g/L、蔗糖25～35g/L；
所述启动培养基的pH为5.8～6.0；
步骤(3)所述增殖培养基以MS培养基为基础还由如下浓度的组分组成：
6-苄氨基嘌呤1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.5～1.0mg/L、琼脂7.0～7.5g/L、蔗糖25～35g/L；
所述增殖培养基的pH为5.8～6.0。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述白术种子为去除种皮上毛茸的白术种子；
所述消毒的方法为：先利用酒精消毒30～40s，再用氯化汞消毒5～7min；
所述酒精的浓度为70～80vt％；
所述氯化汞的浓度为0.08～0.12wt％。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)～步骤(4)中所述培养的光照强度独立为2000～3000Lx；
步骤(2)～步骤(4)中所述培养的温度独立为22～25℃；
步骤(2)～步骤(4)中所述培养的湿度独立为55～65％；
步骤(2)～步骤(4)中所述培养的光照时间独立为14～18h/d。
4.一种白术待移栽苗的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将白术试管苗炼苗5～7d，得到待培育白术苗；
(2)将所述待培育白术苗移栽至育苗基质中，培育6～8d，得到白术待移栽苗；
所述白术试管苗为按照权利要求1～3任意一项所述的培养方法培养得到的白术试管苗；
所述育苗基质由如下质量比的组分组成：蛭石：营养土：河沙为1：1～2：0～2。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述炼苗的光照强度为2500～3000Lx；
所述炼苗的光照时间为11～13h/d。
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