CN106538387B - 一种苦蘵的组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苦蘵的组织培养方法，该方法包括以下步骤：种子无菌萌发、诱导愈伤组织、愈伤组织分化、生根培养和炼苗及移栽。本发明的方法用于苦蘵的组织培养，具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状，不受季节的限制的优点。

Description

一种苦藤的组织培养方法

技术领域

[0001]本发明涉及植物组织培养技术领域，具体的是一种苦藤的组织培养方法。

背景技术

[0002] 苦藤(Physalis angulata L.)又名灯笼泡、灯笼草，为前科酸楽属一年生草本，分 布于我国华东、华中、华南及西南；日本、印度、澳大利亚和美洲亦有。常生于海拔500-1500 米的山谷林下及村边路旁。苦藤以果、根或全草入药，性味苦、寒，主治咽喉肿痛，腮腺炎，急 慢性气管炎，肺脓疡，痢疾，小便不利，外用治脓泡疮等。研究发现苦藤主要有醉茄内酯、酸 浆苦素、黄酮、生物碱及留醇等化学成分，其中酸浆苦素和谷留醇具有多种体内外的抗癌活 性，对于宫颈癌和皮肤癌都具有明显疗效。苦藤作为一种药用植物，具有潜在抗癌效果，而 且还具有生长周期短、单株种子多、近缘物种(番茄、马铃薯、辣椒和茄子)参考基因组多等 特点，便于进行遗传转化和基因功能研究，在作为药用植物基因工程受体模式植物方面具 有广阔的前景。

[0003] 目前关于苦藤的研究报道主要集中在有效成分分析及药理研究方面。苦藤种子的 发芽率普遍较低，采用常规的种子繁殖方法速度慢。组织培养技术具有繁殖速度快、繁殖系 数大，繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状，不受季节的限制等优点，虽然同属 植物酸浆和毛酸浆的组织培养研究较多，但对苦藤组织培养的研究和应用微乎其微。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种苦藤的组织培养方法，解决了苦藤因种子发芽率较低而 繁殖速度慢的问题。本发明的方法用于苦藤快速繁殖，具有繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖 后代整齐一致，移栽成活率高的优点。

[0005] 本发明所提供的技术方案是：

[0006] —种苦藤的组织培养方法，包括以下步骤：

[0007] (1)种子无菌萌发:选用饱满的苦藤种子，经酒精、次氯酸钠及吐温灭菌，然后无菌 水冲洗，最后均匀播种在1/2MS培养基上，种子萌发出小苗；

[0008] 培养条件是无菌环境下，培养温度为25 土 TC，光周期为16h光照/8h黑暗，培养时 间为12〜14天；

[0009] (2)诱导愈伤:将种子萌发后小苗的子叶切下，切去叶子两端，然后接种在含有6-BA和NAA的改良MS培养基上，得到愈伤组织；

[0010] 培养条件是无菌环境下，培养温度为25 土 TC，光周期为16h光照/8h黑暗，培养时 间为35〜42天；

[0011] ⑶愈伤组织分化:将获得的愈伤组织接种在含6-BA和NAA的改良MS培养基上，得 到组培小苗；

[0012] 培养条件是无菌环境下，培养温度为25 土 TC，光周期为16h光照/8h黑暗，培养时 间为14〜16天；

[0013] (4)生根培养:待愈伤上的不定芽长到2-3cm时，用剪刀剪下小苗，转接在1/2MS培 养基上，得到根系较为发达的组培苗，主根约有3-4条，根长约为3-5cm。

[0014] 培养条件是无菌环境下，温度为25± TC，光周期为16h光照/8h黑暗，培养时间为 12〜15天。

[0015] ⑸炼苗及移栽:待小苗长出白色且粗壮的根后，进行驯化移栽；

[0016] 具体驯化移栽过程是首先在培养室将瓶盖打开炼苗2-3天，然后取出植株，洗净根 部培养基，移栽。炼苗培养条件为往组培瓶中加入〇. 5-lcm蒸馏水，打开瓶盖，置于培养温度 为25± TC，光周期为16h光照/8h黑暗的培养室中炼苗2-3天。移栽条件是采用体积比为2:1 〜3:1营养花卉土与蛭石的混合物作为培养基质，置于26°C光照培养箱，光周期为16h光照/ 8小时黑暗。

[0017] 其中，步骤（1)中所述灭菌方法为混合消毒剂灭菌，具体是种子先在95%乙醇（即 上述的酒精）中浸泡3-6分钟，再加入15-25%酒精体积的次氯酸钠、0.1-0.2%酒精体积的 吐温20,浸泡15-25分钟。

[0018] 其中，步骤⑵中所述改良MS培养基的配制方法为:配置IL培养基是将MS培养基固 体粉末4 · 74g、2_吗啉乙横酸(MES, 2- [N-morphoIino] ethansulfonic acid) lg、鹿糖30g，溶 解于蒸馏水中，然后将pH值调至5.8〜6.0后定容至IL，最后加入一定浓度的6-BA和NAA，以 及8g琼脂粉。

[0019] 其中，步骤⑴和(4)中所述1/2MS培养基的配制方法为:配置IL培养基是将MS培养 基固体粉末2.37g、蔗糖30g，溶解于蒸馏水中，然后将pH值调至5.8〜6.0后定容至1L，最后 加入8g琼脂粉。

[0020] 其中，步骤⑵和⑶中所用诱导愈伤和不定芽的不同浓度培养基为15+6-8六(1.0-3 · Omg/L) +NAA (0 · 05-0 · 2mg/L)。

[0021] 其中，步骤⑷中所述生根组培苗为真叶已长出，主根约有3-4条，根长约为3-8cm 的苗。

[0022] 本发明的优点是：

[0023] 1.本发明的方法具有繁殖速度快、繁殖系数大的优点。

[0024] 2.本发明的方法具有繁殖后代整齐一致，能保持原有品种的优良性状的优点。

[0025] 3.本发明的方法具有不受季节限制的优点。苦藤在野外为一年生草本，花果期5-12月，而在实验室，通过组织培养得到的组培苗，栽种在培养室一年四季均可开花结果。

附图说明

[0026] 图1为本发明苦藤组织培养体系不同阶段；其中A:苦藤种子0天;B:苦藤2周的小 苗;C:叶盘0天;D:叶盘21天;E:叶盘32天;F:芽生根培养12天;G:幼苗;H:苦藤组培植株;I: 组培苗花与果，图中标尺为lcm。

[0027] 图2为本发明实施例中9个激素组合的出芽率情况;其中9个组合的基本培养基均 为MS培养基。

具体实施方式

[0028] 下面结合具体例对本发明作进一步详细的说明。

[0029] 实施例I:

[0030] 以饱满苦藤种子为试验材料，材料为浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重 点实验室收集的浙江浦江野生种源，种植在杭州师范大学下沙校区试验地，取成熟果实后 剥开，洗出种子，硅胶干燥并保存于实验室4°C冰箱备用，并按照如下所述步骤进行培养，如 图1具体步骤如下：

[0031] (1)种子无菌萌发:选取颗粒饱满的种子进行试验。种子在95%乙醇中摇晃浸泡 5min。再加入20 %酒精体积的次氯酸钠，0.1 %酒精体积的吐温20，继续浸泡20min。倒净液 体后，用无菌的ddH20清洗种子3-5次。将种子均匀播种在含1/2MS培养基的玻璃培养皿上， 用Paraf i Im膜封口后置于培养室中进行培养，培养温度为25 ± 1°C，光周期为16h光照/8h黑 暗，培养2周左右，待长出真叶，获得无菌苗，用于后续实验。

[0032] (2)愈伤诱导分化培养:选取苦藤种子萌发2周时的幼苗子叶为外植体。用剪刀剪 去子叶两端，接种于培养基MS+6-BA (lmg/L-3mg/L) +NAA (0.05mg/L-0· 2mg/L)上。植物激素 6-BA和NAA组合共设9个梯度，每梯度设3个重复，每重复接种30个叶盘。置于培养室中进行 培养，培养条件同上。1周左右叶盘开始加厚，进一步培养3周左右，愈伤组织表面开始分化 出绿色芽点，并进一步发育形成不定芽。40天后统计愈伤诱导率和愈伤出芽率。

[0033] (3)生根培养:待愈伤上的不定芽长到2-3cm时，用剪刀剪下小苗，转接在1/2MS培 养基上，生根率可达100 %。2周左右植株即可形成粗壮的根系，主根3-5条，长3-8cm。

[0034] ⑷炼苗及移栽:待小苗长出白色且粗壮的根后，进行驯化移栽，。首先在培养室将 瓶盖打开炼苗2-3天，然后取出植株，洗净根部培养基，移栽。移栽条件:营养花卉土:蛭石体 积比为3:1，光照培养箱，16h光照，8小时黑暗，26°C。

[0035] 上述实施例中所涉及的公式如下：

[0036] 诱导率（％)=诱导出愈伤的叶盘数/接种的叶盘数X 100%

[0037] 出芽率（％)=长出芽的愈伤数/接种的愈伤数X 100%

[0038] 表1

[0040] *9个组合的基本培养基为MS培养基，表中不同小写字母表示各处理间差异显著水 平(P〈0.05)。

[0041] 本研究结果表明苦藤种子在1/2MS培养基中萌发可培养出适于后续试验的健康子 叶；诱导愈伤和不定芽的最佳培养基为MS+6BA (3mg/L) +NAA (0.05mg/L)，愈伤诱导率达 100%，愈伤出芽率为78% ;将生长良好的2-3cm的不定芽插在1/2MS生根培养基中，两周左 右可形成较好的根系，生根率可达100% (图2)。

[0042] 实施例2:

[0043] 以饱满苦藤种子为试验材料，材料为浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重 点实验室收集的浙江浦江野生种源，种植在杭州师范大学下沙校区试验地，取成熟果实后 剥开，洗出种子，硅胶干燥并保存于实验室4°C冰箱备用，并按照如下所述步骤进行培养，具 体步骤如下：

[0044] (1)种子无菌萌发:选取颗粒饱满的种子进行试验。种子在95%乙醇中摇晃浸泡 5min。再加入20 %酒精体积的次氯酸钠，0.1 %酒精体积的吐温20，继续浸泡20min。倒净液 体后，用无菌的ddH20清洗种子3-5次。将种子均匀播种在含1/2MS培养基的玻璃培养皿上， 用Paraf i Im膜封口后置于培养室中进行培养，培养温度为25 ± 1°C，光周期为16h光照/8h黑 暗，培养12天左右，待长出真叶，获得无菌苗，用于后续实验。

[0045] (2)愈伤诱导分化培养:选取苦藤种子萌发2周时的幼苗子叶为外植体。用剪刀剪 去子叶两端，接种于培养基MS+6-BA (3mg/L) +NAA (0.05mg/L)上，培养35天左右，愈伤组织表 面开始分化出绿色芽点，并进一步发育形成不定芽。

[0046] (3)生根培养:待愈伤上的不定芽长到2-3cm时，用剪刀剪下小苗，转接在1/2MS培 养基上，生根率可达100%。12天左右植株即可形成粗壮的根系，主根3-5条，长3-8cm。

[0047] (4)炼苗及移栽:待小苗长出白色且粗壮的根后，进行驯化移栽。首先在培养室将 瓶盖打开炼苗2-3天，然后取出植株，洗净根部培养基，移栽。移栽条件是营养花卉土 :蛭石 体积比为2:1，光照培养箱，16h光照/8小时黑暗，26°C。

[0048] 本研究结果表明苦藤种子在1/2MS培养基中萌发可培养出适于后续试验的健康子 叶；愈伤诱导率达100%，愈伤出芽率为81%;将生长良好的2-3cm的不定芽插在1/2MS生根 培养基中，两周左右可形成较好的根系，生根率可达100%。

[0049] 实施例3:

[0050] 以饱满苦藤种子为试验材料，材料为浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重 点实验室收集的浙江浦江野生种源，种植在杭州师范大学下沙校区试验地，取成熟果实后 剥开，洗出种子，硅胶干燥并保存于实验室4°C冰箱备用，并按照如下所述步骤进行培养，具 体步骤如下：

[0051] (1)种子无菌萌发：选取颗粒饱满的种子进行试验。种子在95%乙醇中摇晃浸泡 5min。再加入20 %酒精体积的次氯酸钠，0.1 %酒精体积的吐温20，继续浸泡20min。倒净液 体后，用无菌的ddH20清洗种子3-5次。将种子均匀播种在含1/2MS培养基的玻璃培养皿上， 用Paraf i Im膜封口后置于培养室中进行培养，培养温度为25 ± 1°C，光周期为16h光照/8h黑 暗，培养13天左右，待长出真叶，获得无菌苗，用于后续实验。

[0052] (2)愈伤诱导分化培养:选取苦藤种子萌发2周时的幼苗子叶为外植体。用剪刀剪 去子叶两端，接种于培养基MS+6BA (3mg/L) +NAA (0.05mg/L)上，培养42天左右，愈伤组织表 面开始分化出绿色芽点，并进一步发育形成不定芽。

[0053] (3)生根培养:待愈伤上的不定芽长到2-3cm时，用剪刀剪下小苗，转接在1/2MS培 养基上，生根率可达100%。12天左右植株即可形成粗壮的根系，主根3-5条，长3-8cm。

[0054] (4)炼苗及移栽:待小苗长出白色且粗壮的根后，进行驯化移栽。首先在培养室将 瓶盖打开炼苗2-3天，然后取出植株，洗净根部培养基，移栽。移栽条件是营养花卉土 :蛭石 体积比为2.5:1，光照培养箱，16h光照/8小时黑暗，26°C。

[0055] 本研究结果表明苦藤种子在1/2MS培养基中萌发可培养出适于后续试验的健康子 叶；愈伤诱导率达100%，愈伤出芽率为74%;将生长良好的2-3cm的不定芽插在1/2MS生根 培养基中，两周左右可形成较好的根系，生根率可达100%。

[0056] 上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合 本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1. 一种苦藤的组织培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤： (1) 种子无菌萌发:苦藤种子经酒精、次氯酸钠及吐温灭菌，然后无菌水冲洗，最后均匀 播种在I /2MS培养基上，种子萌发出小苗； 培养条件是无菌环境下，培养温度为25± TC，光周期为16h光照/8h黑暗，培养时间为 12〜14天； (2) 诱导愈伤组织:将种子萌发后小苗的子叶切下，切去叶子两端，然后接种在含有6-BA和NAA的改良MS培养基上，得到愈伤组织； 培养条件是无菌环境下，培养温度为25± TC，光周期为16h光照/8h黑暗，培养时间为 35〜42天； (3) 愈伤组织分化:将获得的愈伤组织接种在含6-BA和NAA的改良MS培养基上，得到组 培小苗； 培养条件是无菌环境下，培养温度为25± TC，光周期为16h光照/8h黑暗，培养时间为 14〜16天； ⑷生根培养:待愈伤上的不定芽长到2-3cm时，用剪刀剪下小苗，转接在1/2MS培养基 上，得到生根组培苗； 培养条件是无菌环境下，温度为25± TC，光周期为16h光照/8h黑暗，培养时间为12〜 15天； ⑸炼苗及移栽:待小苗长出白色且粗壮的根后，进行驯化移栽； 具体驯化移栽过程是首先在培养室将瓶盖打开炼苗2-3天，然后取出植株，洗净根部培 养基，移栽;炼苗培养条件为往组培瓶中加入0.5-1 cm蒸馏水，打开瓶盖，置于培养温度为25 ± TC，光周期为16h光照/8h黑暗的培养室中炼苗2-3天;移栽条件是采用花卉营养土与蛭 石的混合物作为培养基质，置于26°C光照培养箱，光周期为16h光照/8小时黑暗； 所述步骤⑵、⑶改良MS培养基的配制方法为：配置IL培养基是将MS培养基固体粉末 4.74g、2-吗啉乙磺酸lg、鹿糖30g，溶解于蒸馏水中，然后将pH值调至5.8〜6.0后定容至IL， 最后加入1.0-3.011^/1684和0.05-0.211^/1熟4，以及88琼脂粉。

2. 如权利要求1所述的一种苦藤的组织培养方法，其特征在于步骤（1)中所述灭菌方法 为混合消毒剂灭菌，具体是种子先在酒精中浸泡3-6分钟，再加入15-25%酒精体积的次氯 酸钠、O. I-0.2 %酒精体积的吐温20，浸泡15-25分钟。

3. 如权利要求1所述的一种苦藤的组织培养方法，其特征在于步骤（1)和(4)中所述1/ 2MS培养基的配制方法为:配置IL培养基是将MS培养基固体粉末2.37g、蔗糖30g，溶解于蒸 馏水中，然后将pH值调至5.8〜6.0后定容至1L，最后加入8g琼脂粉。

4. 如权利要求1所述的一种苦藤的组织培养方法，其特征在于步骤(4)中所述的生根组 培苗为真叶已长出，主根有3-4条，根长为3-8cm的苗。

5. 如权利要求1所述的一种苦藤的组织培养方法，其特征在于6BA的浓度为3. Omg/L; NAA的浓度为0.05mg/L。

6. 如权利要求1所述的一种苦藤的组织培养方法，其特征在于步骤(5)移栽培养基为体 积比为2:1〜3:1的花卉营养土与蛭石混合物。