CN111837961A - 一种铁皮石斛育苗培养基及育苗方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛育苗培养基及育苗方法，涉及中药材育苗技术领域。本发明铁皮石斛育苗培养基包括液体培养基和椰糠混合而成。将铁皮石斛种子悬浮液点播在上述培养基上进行铁皮石斛育苗。椰糠具有吸水、透气、遮光的特性，且价格低廉，节约了生产成本，获得铁皮石斛种苗适应性强，移栽成活率高。将铁皮石斛种子撒到营养液中制成种子悬浮液，通过控制密度解决了试管苗在培养基中生长空间不足带来的转接问题，省掉了种苗生产过程中的转接环节，大大节约了劳动力成本；同时还解决了以往生产过程中由于悬浮液污染导致接种的组培苗大量污染的问题。

Description

一种铁皮石斛育苗培养基及育苗方法

技术领域

本发明属于中药材育苗技术领域，涉及一种铁皮石斛育苗培养基及育苗方法。

背景技术

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo为兰科石斛属多年生附生草本植物，别名黑节草，俗称铁皮枫斗，以新鲜或干燥的茎段入药，具有滋阴清热、益胃生津的功效，是我国传统名贵大宗中药材，应用历史悠久，自古就有“药中黄金”的美誉。现代药理研究表明，铁皮石斛多糖、芪类、黄酮类、生物碱类和挥发性成分为其主要药效物质，具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、降血糖、保肝护胃等多种功效。

铁皮石斛由于种子极为细小，胚胎发育不完全，没有胚乳，自然环境下只有与真菌共生才能萌发，所以自然萌发率极低(不到3％)。近年来，随着石斛资源的药用价值和观赏价值的不断开发，野生铁皮石斛资源濒危灭绝，为了保护铁皮石斛野生资源，同时满足日益严重的供不应求的问题，国内外科研人员用铁皮石斛嫩芽、茎段、叶片、根尖、腋芽、茎尖、种子、种胚等材料为外植体，做了大量研究并都培育出了铁皮石斛试管苗，其中，用种子诱导的原球茎质量高、分化能力强，可以短时间内快速繁殖铁皮石斛种苗。虽然铁皮石斛工厂化育苗体系已经建立，但组培工厂生产成本高、技术要求高依然是制约铁皮石斛产业发展的一大难题。

发明内容

有鉴于此，本发明的第一目的在于提供铁皮石斛育苗培养基，降低培育铁皮石斛组培工厂生产成本，有利于石斛根的发育。

本发明的第二目的在于提供铁皮石斛育苗的方法，能够提高种子萌发、育苗质量以及降低污染率。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种铁皮石斛育苗培养基，包括液体培养基和椰糠混合而成。

优选的，液体培养基的配方如下：MS+0.2～0.4mg·L^-1NAA+0.8～1.2mg·L^-16-BA+4～6％香蕉汁+9～11％马铃薯汁+4～6％椰汁+28～32g·L^-1蔗糖。

优选的，液体培养基与椰糠混合的体积质量比为1L：95～110g。

本发明还提供了一种铁皮石斛育苗的方法，包括如下步骤：

(1)配制铁皮石斛种子悬浮液；

(2)将铁皮石斛种子悬浮液静置培养后，点播到上述铁皮石斛育苗培养基上，培养成苗。

优选的，铁皮石斛种子悬浮液的配方为：N6 1/2+13～17g·L^-1蔗糖，pH5.8～5.9。

优选的，种子悬浮液中的种子密度为25～35粒·ml^-1。

优选的，铁皮石斛育苗培养的培养条件为：温度24±1℃，湿度80±5％，光照强度2000～2500Lx，光照12h/d。

优选的，铁皮石斛育苗方法还包括炼苗：所述炼苗温度控制在15～25℃，湿度60～70％，遮光度65～75％。

优选的，育苗方法还包括移栽：冲洗种苗根部的椰糠，放到杀菌剂中浸泡，晾至根部变白进行移栽。

优选的，移栽的基质配方为：松树皮：椰糠的体积比为3～10:1。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明的铁皮石斛育苗培养基，用椰糠代替琼脂做培养基中的支持物培育铁皮石斛种苗，相比传统培养基用琼脂做支持物，椰糠具有透气、吸水的特性，更有利于兰科植物气生根的生长；此外，椰糠是黑褐色，可以起到根部遮光作用，有利于石斛根的发育，且椰糠对石斛根的粘着性弱，洗苗更方便；椰糠价格低廉，可以大大降低生产成本。

本发明的铁皮石斛育苗方法，将种子撒到营养液中制成种子悬浮液，通过控制密度解决了试管苗在培养基中生长空间不足带来的转接问题，省掉了种苗生产过程中的转接环节，大大节约了劳动力成本；用营养液做种子悬浮液代替无菌水，可以监控悬浮液是否被污染，解决了以往生产过程中由于悬浮液污染导致接种的组培苗大量污染的问题。

附图说明

图1本发明铁皮石斛育苗方法种苗长势情况；

图2本发明铁皮石斛育苗方法根系长势情况；

图3本发明铁皮石斛育苗方法种苗的苗高情况；

图4本发明铁皮石斛育苗方法移栽后的长势情况。

具体实施方式

本发明提供一种铁皮石斛育苗培养基，该培养基包括液体培养基和椰糠混合而成。本发明用椰糠代替琼脂做培养基中的支持物培育铁皮石斛种苗，相比传统培养基用琼脂做支持物，椰糠具有透气、吸水的特性，更有利于兰科植物气生根的生长；添加椰糠后的培养基为黑褐色，不透光，可以为根起到遮光作用，有利于石斛根的发育；且椰糠对石斛根的粘着性弱，移栽洗苗更方便，减少对根部的损伤。

本发明铁皮石斛育苗培养基中的液体培养基可以为现有已知培育铁皮石斛的培养基，也可以优选为以下配方的培养基：MS+0.2～0.4mg·L^-1NAA+0.8～1.2mg·L^-16-BA+4～6％香蕉汁+9～11％马铃薯汁+4～6％椰汁+28～32g·L^-1蔗糖。本发明中在液体培养基中添加了NAA、6-BA、香蕉汁、马铃薯汁和椰汁，其中NAA和6-BA是植物生长调节剂，在培养基中添加能够起到调节铁皮石斛增殖、分化以及生根的作用；香蕉汁可以起到促进芽苗的生长、分化，使根系生长粗壮的作用；马铃薯汁对铁皮石斛原球茎的萌发、分化和增殖有促进作用；椰汁对铁皮石斛有促进增殖的效果，增殖率高，苗粗壮，叶色浓绿，生长整齐。更优选的，本发明的液体培养基为MS+0.3～0.4mg·L^-1NAA+1.0～1.2mg·L^-16-BA+5～6％香蕉汁+10～11％马铃薯汁+5～6％椰汁+29～31g·L^-1蔗糖。

本发明的铁皮石斛育苗培养基配置方法为：每1000ml的MS培养基中含有4～6％香蕉汁、9～11％马铃薯汁、4～6％椰汁、0.2～0.4mg NAA、0.8～1.2mg 6-BA、28～32g蔗糖，最后加入95～110g的椰糠。本发明中的椰糠为干燥后的椰糠粉末。本发明制备的铁皮石斛育苗培养基pH为5.8～5.9。

本发明还提供一种铁皮石斛育苗的方法：配制铁皮石斛种子悬浮液；将铁皮石斛种子悬浮液静置培养后，点播到铁皮石斛育苗培养基上，培养成苗。

本发明的铁皮石斛种子为保存或新鲜采集的铁皮石斛种子。铁皮石斛种子采集方法优选为，以成熟未开裂的铁皮石斛蒴果为外植体，清洗干净并消毒后，将蒴果前端剖开一个小口，用镊子夹住蒴果果柄，将种子散落采集种子。

本发明对铁皮石斛蒴果消毒的方式没有特殊限定，采用本领域中的常规消毒方式即可。作为一种可实施的方式，本发明对采摘的铁皮石斛蒴果用洗手液清洗表面后再用流水冲洗，滤纸擦干净转移到超净工作台中。先用70％的酒精消毒，消毒时间为20～40s，消毒完后用无菌水漂洗3～5次；再用升汞消毒，消毒时间为8～10min，无菌水漂洗3～5次，用无菌滤纸擦干后放到接种盘中。

本发明将铁皮石斛种子配制为铁皮石斛种子悬浮液，优选配制种子悬浮液的密度为25～35粒·ml^-1，进一步优选为27～32粒·ml^-1。本领域技术人员可用移液枪吸取1ml种子悬浮液放到载玻片上观察种子数，计算铁皮石斛种子悬浮液中铁皮石斛种子的密度。具体方式为：将铁皮石斛种子分次、微量抖落到营养液中，每次抖落后摇匀，检测悬浮液中种子密度。

本发明优选种子营养液配方为N6 1/2+13～17g·L^-1蔗糖，pH为5.8～5.9。营养液中N6培养基为铁皮石斛的生长提供基本营养元素，蔗糖提供碳源。用营养液做种子悬浮液代替无菌水，不仅可以为种子变成原球茎提供生长所需的营养，还可以监控悬浮液是否被污染，解决了以往生产过程中由于悬浮液污染导致接种的组培苗大量污染的问题。

本发明将铁皮石斛种子悬浮液静置培养后开始接种，本发明优选铁皮石斛种子悬浮液静置培养的时间为25～35d，更优选为28～32d。由于种子本身只有胚，缺少胚乳，直接萌发会出现萌发率低的问题，而种子经过静置培养后，会变成原球茎，更有利于种子的萌发，大大解决了种子萌发率低的问题。本发明将铁皮石斛种子悬浮液点播到上述铁皮石斛育苗培养基上。具体方法可选的为，先摇匀种子悬浮液，然后用移液枪吸取悬浮液均匀点播到本发明铁皮石斛育苗培养基上。本领域技术人员视铁皮石斛的生长情况合理调节移液枪吸取溶液的体积和点播密度。点播完后进行培养，培养条件优选为：温度24±1℃，湿度80±5％，光照强度2000～2500Lx，光照12h/d。本发明优选培养在培养室中进行。

待铁皮石斛种苗生长至苗高5～6cm、带有4～5条根时，本发明将培养出的铁皮石斛苗进行炼苗，优选炼苗在温室大棚中进行。本发明优选炼苗温度控制在15～25℃，湿度60～70％，遮光度65～75％。本发明优选炼苗在温室大棚中先闭盖炼苗15～20天，再开盖炼苗5～10天。

本发明炼苗后将铁皮石斛苗进行移栽。可选的，先将炼苗完成的种苗根部的椰糠冲洗干净，经杀菌剂浸泡后进行移栽。本领域技术人员可选择已知杀菌剂进行浸泡消毒，在本发明具体实施例中，采用多菌灵对铁皮石斛苗进行浸泡，优选多菌灵稀释倍数为500～1000倍，进一步优选为600～800倍；浸泡时间优选为15～30min，进一步优选为20～25min。浸泡完晾至根部变白后移栽到育苗基质中。本发明育苗基质优选为松树皮和椰糠的混合物，优选两者的体积比为3～10:1，进一步优选为5～7:1。本发明移栽的育苗基质中优选添加缓释肥，以促进铁皮石斛苗的生长。优选每公斤育苗基质中添加80～100g缓释肥。移栽后适时喷施叶面肥进行追肥。

移栽后的苗期管理：育苗基质含水量保持50～60％，空气相对湿度70％左右，刚移栽的种苗遮光率应为70％以上，后期遮光率60～70％。大棚内温度控制在25～30℃，夜间10～15℃，夏季高温，及时通风，中午温度高时不可以浇水降温，可选择早晚喷雾降温。冬季密封大棚，可适当覆盖保温膜或用加温设备，保持最低温在0℃以上。及时除去杂草。移栽后如发现死苗应及时拔除，补苗。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

配制液体培养基，其液体培养基的配方为：MS+0.3mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-16-BA+5％香蕉汁+10％马铃薯汁+5％椰汁+30g·L^-1蔗糖，每升配好的液体培养基添加100g干燥后的椰糠粉末，pH为5.8～5.9，得到铁皮石斛育苗培养基。

实施例2

配制液体培养基，其液体培养基的配方为：MS+0.4mg·L^-1NAA+1.1mg·L^-16-BA+6％香蕉汁+9％马铃薯汁+4％椰汁+29g·L^-1蔗糖，每升配好的液体培养基添加90g干燥后的椰糠粉末，pH为5.8～5.9，得到铁皮石斛育苗培养基。

实施例3

配制液体培养基，其液体培养基的配方为：MS+0.2mg·L^-1NAA+1.2mg·L^-16-BA+4％香蕉汁+11％马铃薯汁+6％椰汁+31g·L^-1蔗糖，每升配好的液体培养基添加110g干燥后的椰糠粉末，pH为5.8～5.9，得到铁皮石斛育苗培养基。

实施例4

采用实施例1中的培养基进行铁皮石斛的育苗，本实施例的育苗步骤按如下进行。

种子的采集与消毒：采摘成熟未开裂的铁皮石斛蒴果为外植体，洗手液清洗表面后用流水冲洗，滤纸擦干净转移到超净工作台中。先用70％的酒精消毒30s，消毒完后用无菌水漂洗5次；再用升汞消毒10min，无菌水漂洗5次，用无菌滤纸擦干后放到接种盘中。

配置铁皮石斛种子悬浮液：将蒴果前端剖开一个小口，用镊子夹住蒴果果柄，将种子分次、微量抖落到N6 1/2+15g·L^-1蔗糖，pH为5.8～5.9的营养液中，每次抖落后摇匀，然后用移液枪吸取1ml种子悬浮液放到载玻片上观察种子数，观察5次求平均值，制成密度为30粒·ml^-1的铁皮石斛种子悬浮液。

接种与培养：将铁皮石斛种子悬浮液静置培养30d后开始接种，先摇匀种子悬浮液，然后用移液枪吸取1ml液体，均匀点播到实施例1的育苗培养基上，然后转移到温度24±1℃，湿度80±5％，光照强度2000～2500Lx，光照12h/d，的培养室培养。

炼苗：待种苗生长至苗高5cm、带有5条根时，转移到温度控制在15～25℃，湿度60～70％，遮光度70％的温室大棚先闭盖炼苗15天，再开盖炼苗7天。

移栽：将炼苗完成的种苗流水冲洗干净根部的椰糠，然后放到800倍稀释多菌灵溶液中浸泡20min，捞出控干水分，隔空放到苗床上，晾至根部变白后移栽到装有体积比为松树皮：椰糠＝5:1的育苗基质的2.5寸的规格(底径50mm、口径80mm、高度80mm)的育苗袋中。

移栽后苗期管理：使基质含水量保持50～60％，空气相对湿度70％左右，刚移栽的种苗遮光率应为70％以上，后期遮光率60～70％。大棚内温度控制在25～30℃，夜间10～15℃，夏季高温，及时通风，中午温度高时不可以浇水降温，可选择早晚喷雾降温。冬季密封大棚，可适当覆盖保温膜或用加温设备，保持最低温在0℃以上。移栽时每公斤基质中添加90g奥绿1号缓释肥，移栽后每15天用稀释900倍花多多1号叶面肥追肥一次，并及时除去杂草。移栽后如发现死苗应及时拔除，补苗。

对比例1

育苗培养基用琼脂做支持物，具体配方：MS+0.3mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-16-BA+5％香蕉汁+10％马铃薯汁+5％椰汁+30g·L-1蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8～5.9。

对比例2

配置液体培养基，具体配方：1/2MS+0.3mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-16-BA+5％香蕉汁+10％马铃薯汁+5％椰汁+30g·L^-1蔗糖，每升配好的液体培养基添加100g干燥后的椰糠粉末，pH为5.8～5.9。

对比例3

培养基的基础培养基用N6，具体配方：N6+0.3mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-16-BA+5％香蕉汁+10％马铃薯汁+5％椰汁+30g·L^-1蔗糖，每升配好的液体培养基添加100g干燥后的椰糠粉末，pH为5.8～5.9。

对比例4

培养种子的营养液为无菌水。

其余步骤与实施例1相同。

表1采用不同培养基进行铁皮石斛育苗的品质对比

注：小写字母表示在0.01水平上差异显著。

表1的试验结果表明，用营养液静置培养一个月较用无菌水浸泡一个月可以显著提高铁皮石斛种子的萌发数；用椰糠做培养基中支持物培育的铁皮石斛试管苗的移栽成活率要优于对比例1中的琼脂作为支持物培养基，而选择MS作为基础培养基可以显著提高种苗的苗高、根数和平均根长。可见，用本发明的铁皮石斛育苗的方法，铁皮石斛种苗生长迅速，成苗较快。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种铁皮石斛育苗培养基，其特征在于，包括液体培养基和椰糠混合而成。

2.根据权利要求1所述的铁皮石斛育苗培养基，其特征在于，所述液体培养基的配方如下：MS+0.2～0.4mg·L^-1NAA+0.8～1.2mg·L^-16-BA+4～6％香蕉汁+9～11％马铃薯汁+4～6％椰汁+28～32g·L^-1蔗糖。

3.根据权利要求1所述的铁皮石斛育苗培养基，其特征在于，所述液体培养基与椰糠混合的体积质量比为1L：95～110g。

4.一种铁皮石斛育苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)配制铁皮石斛种子悬浮液；

(2)将铁皮石斛种子悬浮液静置培养后，点播到权利要求1～3任意一项所述铁皮石斛育苗培养基上，培养成苗。

5.根据权利要求4所述的铁皮石斛育苗方法，其特征在于，所述铁皮石斛种子悬浮液的配方为：N61/2+13～17g·L^-1蔗糖，pH为5.8～5.9。

6.根据权利要求4所述的铁皮石斛育苗方法，其特征在于，所述种子悬浮液中的种子密度为25～35粒·ml^-1。

7.根据权利要求4所述的铁皮石斛育苗方法，其特征在于，步骤(2)中所述培养的条件为：温度24±1℃，湿度80±5％，光照强度2000～2500Lx，光照12h/d。

8.根据权利要求4所述的铁皮石斛育苗方法，其特征在于，所述方法还包括炼苗：所述炼苗温度控制在15～25℃，湿度60～70％，遮光度65％～75％。

9.根据权利要求4或8所述的铁皮石斛育苗方法，其特征在于，所述方法还包括移栽：冲洗种苗根部的椰糠，放到杀菌剂中浸泡，晾至根部变白进行移栽。

10.根据权利要求9所述的铁皮石斛育苗方法，其特征在于，所述移栽的基质配方为：松树皮：椰糠的体积比为3～10:1。

Images