CN105230489A

CN105230489A - 一种铁皮石斛的组培快繁方法

Info

Publication number: CN105230489A
Application number: CN201510725916.8A
Authority: CN
Inventors: 黄忠勤
Original assignee: DAXIN COUNTY PRODUCTIVITY PROMOTION CENTER
Current assignee: DAXIN COUNTY PRODUCTIVITY PROMOTION CENTER
Priority date: 2015-11-02
Filing date: 2015-11-02
Publication date: 2016-01-13

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛的组培快繁方法，通过外植体的建立、外植体处理、初代培养、继代培养、生根培养、炼苗和移栽等步骤实现，针对初代培养、继代和生根培养选择了专用的培养基组成，合理的炼苗措施使铁皮石斛移栽后生长快，成活率高，达到了繁殖系数高，繁殖效果好的目的。同时本发明方法生产成本低廉，得到的组培苗遗传状一致，是铁皮石斛组培快繁的有效途径，且适用范围广。

Description

一种铁皮石斛的组培快繁方法

技术领域

本发明涉及植物种植，特别涉及一种铁皮石斛的组培快繁方法。

背景技术

铁皮石斛，为兰科多年生附生草本植物。生于海拔达1600米的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。一般均能耐－5℃的低温。石斛可分为黄草、金钗、马鞭等数十种，铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛具有独特的药用价值，以其茎入药，中药名：石斛，属补益药中的补阴药，《中国药典》：益胃生津，滋阴清热。铁皮石斛等少数品种之嫩茎，扭成螺旋状或弹簧状，晒干，商品称为耳环石斛，又名枫斗。

从组培室到设施或田间栽培之前一定要经过炼苗这一重要环节，传统的炼苗方法通常是瓶苗先经过室内环境适应一段时间（一般5-10天），逐渐打开瓶盖进行过渡（3-5天），然后再出瓶、洗掉培养基，给予高湿（90%以上湿度）、弱光处理进行正常栽培前的过渡炼苗。组织培养（TissueCulture）是在无菌条件下，分离并在培养基中培养离体植物组织的技术，它具有以下重要意义：（1）促进优良遗传材料的快速繁殖；（2）脱毒良种苗的培养和无病毒苗的大量繁殖；（3）特殊育种材料的快速繁殖；（4）基因工程植株的快速繁殖；（5）离体保存种质的快速繁殖。

有关针对铁皮石斛组织培养和快速繁殖的公开文献报道也有很多，经检索摘录如下：

1、【题名】铁皮石斛组织培养与快速繁殖研究进展【作者】魏丽芳；于桂芬；冯国宝；杨亚平【机构】潞安矿业（集团）有限责任公司林业处【刊名】安徽农业科学，2013，41(35)【文摘】铁皮石斛（DendrobiumcandidumWall.exLindl．）是我国传统名贵中药材，自然繁殖率低，野生资源稀缺，近些年对其人工快繁技术研究进展较快。从外植体、原球茎增殖与分化、生根与壮苗、移栽等方面对铁皮石斛组织培养与快速繁殖研究进行了综述。提出当前研究存在的问题：种苗培养周期较长，成本较高；大田移栽技术研究相对薄弱，移栽后的种苗成活率较低；对于种苗培养过程中药用有效成分积累规律的研究较少。针对当前研究存在的不足，指出今后的研究方向：加强光照、温度、湿度等环境条件与原球茎增殖分化相关性研究，缩短种苗培养周期，提高生产效率；加强大田移栽技术基础研究，提高移栽成活率；加强组织培养过程中种苗药用有效成分积累规律以及与培养条件关系研究，提高种苗药用有效成分含量。该研究可为铁皮石斛规模化生产提供参考。

2、【题名】铁皮石斛组织快繁及移栽培养【作者】翟明恬；刘红霞；王亚妮【机构】潞安矿业（集团）有限责任公司林业处【刊名】东北林业大学学报，2015年第43卷第1期【文摘】摘要为了筛选出铁皮石斛的最佳组织培养培养基、最佳移栽基质、最适菌剂种类和施用方式，选取具有1-2片叶片的铁皮石斛分化苗在3种常用组培培养基上培养．11周后，统计平均株高、茎粗、根长、鲜质量的增长量、平均产生新根数、新孽数：选取相同长势的铁皮石斛组培苗，在2种常用兰科植物培养基质上移栽，将3株优良兰科菌根真菌制成4g．L-1的单一液体菌剂，对铁皮石斛移栽苗分别进行蘸根、灌根，90d后，统计成活率、平均鲜质量、株高、茎粗增长量、平均新根数。结果显示：MS+0.349．L。'KNO，+1009．L-1土豆提取液+2.49．L“植物凝胶+309．L-I蔗糖培养基上生长的铁皮石斛苗平均株高增长量、平均鲜质量增长量、平均新根数、平均分蘖数极显著大于其他两组处理；移栽于V（珍珠岩）：V（仙土）：矿（松树皮）：V（活苔藓1=l：l：1：2基质上的铁皮石斛幼苗除平均新芽数略低于移栽于V（花生壳）：V（石灰岩）：V（蛭石）：V（活苔藓）=1：1：1：2基质上的铁皮石斛幼苗外，其他生长指标均高于后者，其中新根数显著高于后者：施用Dh57茵剂的铁皮石斛幼苗在成活率、平均新根数、生长量方面显著高于施用Do60、Ph03茵剂的铁皮石斛幼苗。在株高、茎粗增长量方面极显著高于另外4组处理：施用Ph03菌剂的铁皮石斛幼苗平均新芽数极显著高于施用Dh57、Do60茵剂的处理组：同一菌剂蘸根处理的幼苗生长指标均高于灌根处理。

可见，目前虽然对于铁皮石斛组织培养技术研究较多，但有目的性的针对铁皮石斛的优良性状进行扩繁，同时能有效推广应用的组培快繁方法还有很多工作需要摸索，由于铁皮石斛是珍贵药材，对于其的快速繁殖，满足市场供应，提高其经济效益具有重要意义。

发明内容

本发明目的是克服现有铁皮石斛繁殖方法不足之处，提供一种操作难度低、繁殖系数高、防治周期短、能稳定遗传且成活率高的铁皮石斛的组培快繁方法。

本发明一种铁皮石斛的组培快繁方法,其特征在于：它包括以下步骤：

①外植体的建立：选择3年龄，生长健壮、株茎粗大、无病虫害的优良植株，从离地面8-12cm处截断，取茎部上段，再将茎段切成长度为3-5cm,带有1-2个腋芽的小茎段作为外植体材料；为减少材料污染源，采取茎段时，应选择连续三天以上晴好天气后进行；将采回的茎段去除大部分叶片后，用自来水冲洗10min，0.5%洗衣液溶液浸泡20min，再用自来水冲洗干净；

②外植体消毒：步骤①得到的外植体用75％的酒精浸泡30S，无菌水冲洗4-5次，沥干水，然后置于0.1％的升汞溶液中消毒15min，无菌水冲洗4-5次；

③初代培养：将步骤②处理过的茎段在无菌条件下接种到初代培养基，初代培养基成分为：MS+NAA1.5mg/L+6-BA2mg/L+5%糖蜜，培养基pH5.6；光照强度1500Lux，培养温度25±2℃，培养时间45天；

④继代培养：初代培养至腋芽萌发成丛芽，取丛芽进行继代培养，继代培养基成分为：MS+6-BA6mg/L+NAA0.5mg/L+0.05%氨基寡糖素+8%糖蜜+150mg/L土豆；培养温度25±2℃，光照时间15h/d，培养基pH5.6-5.8；光照强度2000Lux，培养30天，形成2cm长的具有3个茎节的芽条，将其切成带茎节的切段，每个芽分割成2段；每30天如此继代一次，扩繁试管苗；

⑤生根培养：待步骤④扩繁的试管苗取出，转入生根培养，生根培养基成分为：MS+NAA0.5mg/L+6-BA4mg/L+2.0%氨基寡糖素+18%糖蜜+200mg/L土豆；光照强度为3000Lux，培养温度25±2℃，培养至25天，根长至2cm，苗长高3cm时出瓶；

⑥炼苗：选择健壮、株茎粗壮的试管苗出瓶，清水清洗根部，移栽在泥炭土：椰糠配比为1:3的营养基质中，保持空气湿度85-95%，光照12000lux；

⑦移栽：炼苗15天后移到露天培养。

所述的铁皮石斛的组培快繁方法还包括组培苗移栽后的管理，具体为：移栽前，将组培苗在定根水中浸泡1-2h；施足基肥，及时追肥，并及时防治病虫害。

所述定根水组成为：3%甲霜灵+3%恶霉灵+0.05%吲哚丁酸+0.05%萘乙酸钠+0.5%聚丙烯酸钠+纯净水余量。

所述防治病虫害为：防治病害是黄斑病、炭疽病、叶枯病或花叶病；防治虫害是石斛菲盾蚊、蜗牛或地老虎。

本发明与已有技术相比，其突出的实质性特点和显著的进步是：

1、本发明铁皮石斛的组培快繁方法操作难度低、生产成本低，易于在大范围内推广使用。在大规模组织培养过程中，培养基使用糖蜜作为重要成分，替代了蔗糖，直接降低了培养基的成本；同时，培养基中氨基寡糖素在培养基中的适量使用有效抑制了杂菌侵染，减少组培风险，是较为成熟可靠安全的组培快繁方法。

2、本发明铁皮石斛的组培快繁方法生产的组培苗成活率高，铁皮石斛组培苗成活率在98%以上。

具体实施方式

以下是结合实施例对本发明进一步详细说明：

实施例一：

①外植体的建立：选择3年龄，生长健壮、株茎粗大、无病虫害的优良植株，从离地面8-12cm处截断，取茎部上段，再将茎段切成长度为3cm,带有1-2个腋芽的小茎段作为外植体材料；为减少材料污染源，采取茎段时，应选择连续三天以上晴好天气后进行；将采回的茎段去除大部分叶片后，用自来水冲洗10min，0.5%洗衣液溶液浸泡20min，再用自来水冲洗干净；

②外植体消毒：步骤①得到的外植体用75％的酒精浸泡30S，无菌水冲洗4次，沥干水，然后置于0.1％的升汞溶液中消毒15min，无菌水冲洗4次；

④继代培养：初代培养至腋芽萌发成丛芽，取丛芽进行继代培养，继代培养基成分为：MS+6-BA6mg/L+NAA0.5mg/L+0.05%氨基寡糖素+8%糖蜜+150mg/L土豆；培养温度25±2℃，光照时间15h/d，培养基pH5.6；光照强度2000Lux，培养30天，形成2cm长的具有3个茎节的芽条，将其切成带茎节的切段，每个芽分割成2段；每30天如此继代一次，扩繁试管苗；

⑥炼苗：选择健壮、株茎粗壮的试管苗出瓶，清水清洗根部，移栽在泥炭土：椰糠配比为1:3的营养基质中，保持空气湿度85%，光照12000lux；

⑦移栽：炼苗15天后移到露天培养。

实施例二：

①外植体的建立：选择3年龄，生长健壮、株茎粗大、无病虫害的优良植株，从离地面8-12cm处截断，取茎部上段，再将茎段切成长度为4cm,带有1-2个腋芽的小茎段作为外植体材料；为减少材料污染源，采取茎段时，应选择连续三天以上晴好天气后进行；将采回的茎段去除大部分叶片后，用自来水冲洗10min，0.5%洗衣液溶液浸泡20min，再用自来水冲洗干净；

②外植体消毒：步骤①得到的外植体用75％的酒精浸泡30S，无菌水冲洗5次，沥干水，然后置于0.1％的升汞溶液中消毒15min，无菌水冲洗5次；

③初代培养：将步骤②处理过的茎段在无菌条件下接种到初代培养基，初代培养基成分为：MS+NAA1.5mg/L+6-BA2mg/L+5%糖蜜，培养基pH5.7；光照强度1500Lux，培养温度25±2℃，培养时间45天；

④继代培养：初代培养至腋芽萌发成丛芽，取丛芽进行继代培养，继代培养基成分为：MS+6-BA6mg/L+NAA0.5mg/L+0.05%氨基寡糖素+8%糖蜜+150mg/L土豆；培养温度25±2℃，光照时间15h/d，培养基pH5.7；光照强度2000Lux，培养30天，形成2cm长的具有3个茎节的芽条，将其切成带茎节的切段，每个芽分割成2段；每30天如此继代一次，扩繁试管苗；

⑥炼苗：选择健壮、株茎粗壮的试管苗出瓶，清水清洗根部，移栽在泥炭土：椰糠配比为1:3的营养基质中，保持空气湿度90%，光照12000lux；

⑦移栽：炼苗15天后移到露天培养。

实施例三：

①外植体的建立：选择3年龄，生长健壮、株茎粗大、无病虫害的优良植株，从离地面8-12cm处截断，取茎部上段，再将茎段切成长度为5cm,带有1-2个腋芽的小茎段作为外植体材料；为减少材料污染源，采取茎段时，应选择连续三天以上晴好天气后进行；将采回的茎段去除大部分叶片后，用自来水冲洗10min，0.5%洗衣液溶液浸泡20min，再用自来水冲洗干净；

④继代培养：初代培养至腋芽萌发成丛芽，取丛芽进行继代培养，继代培养基成分为：MS+6-BA6mg/L+NAA0.5mg/L+0.05%氨基寡糖素+8%糖蜜+150mg/L土豆；培养温度25±2℃，光照时间15h/d，培养基pH5.8；光照强度2000Lux，培养30天，形成2cm长的具有3个茎节的芽条，将其切成带茎节的切段，每个芽分割成2段；每30天如此继代一次，扩繁试管苗；

⑥炼苗：选择健壮、株茎粗壮的试管苗出瓶，清水清洗根部，移栽在泥炭土：椰糠配比为1:3的营养基质中，保持空气湿度95%，光照12000lux；

⑦移栽：炼苗15天后移到露天培养。

在铁皮石斛生长过程中防治病虫害及使用药剂如下：对黄斑病采用75%百菌清可湿性粉剂1000倍液+70%甲基硫菌灵可湿性粉剂1000倍液进行喷洒；对炭疽病采用80%多菌灵可湿性粉剂600倍液进行喷洒，每周一次；对叶枯病采用75%百菌清可湿性粉剂1000倍液进行喷洒，每周一次，连续三次；对花叶病及时清除病株、改善环境卫生、科学消毒用具，以防止蔓延，常用消毒液有2%福尔马林和2%氢氧化钠水溶液；对石斛菲盾蚊采用40%乐果乳油1000倍液进行喷杀；对蜗牛用麸皮拌敌百虫，撒在蜗牛经常活动的地方进行毒饵诱杀；对地老虎可在早春或初秋使用辛硫磷2000倍液灌施预防。节省工时，提高工效，保证了铁皮石斛的丰产。

以下为本发明方法得到的铁皮石斛组培苗繁育结果：

	组培苗数	生根率（%）	成活率（%）
				实施例一	20000	99.2	98.5
实施例二	20000	99.5	99
				实施例三	20000	100	99.3

可以看出，本发明铁皮石斛组培快繁方法，繁殖系数高，生根率达99%以上，成活率在98%以上，组培苗移栽后能迅速适应露天环境，生长迅速，抗外界不良环境能力强，创造了较大的经济效益和社会效益。

Claims

1.一种铁皮石斛的组培快繁方法,其特征在于：它包括以下步骤：

⑦移栽：炼苗15天后移到露天培养。

2.根据权利要求1所述的铁皮石斛的组培快繁方法，其特征在于：还包括组培苗移栽后的管理，具体为：移栽前，将组培苗在定根水中浸泡1-2h；施足基肥，及时追肥，并及时防治病虫害。

3.根据权利要求2所述的铁皮石斛的组培快繁方法，其特征在于：所述定根水组成为：3%甲霜灵+3%恶霉灵+0.05%吲哚丁酸+0.05%萘乙酸钠+0.5%聚丙烯酸钠+纯净水余量。

4.根据权利要求2所述的铁皮石斛的组培快繁方法，其特征在于：所述防治病虫害为：防治病害是黄斑病、炭疽病、叶枯病或花叶病；防治虫害是石斛菲盾蚊、蜗牛或地老虎。