CN106718942A - 华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术 - Google Patents

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孙喜云
常通
丁芳
孙凤岭
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Abstract

本发明提供了一种华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，利用“铁皮石斛”的茎段进行组培与快繁，筛选适宜铁皮石斛培养的最佳培养基以及铁皮石斛组培与快繁所需最佳环境条件，并模拟铁皮石斛野外生长环境，在华北地区进行组培苗驯化，降低了生产成本，实现铁皮石斛在华北地区批量生产，为优质铁皮石斛的推广提供了强有力的技术保障。

Description

华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术
技术领域
本发明涉及中药材种植技术领域，具体涉及华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术。
背景技术
铁皮石斛为兰科石斛属植物，是传统名贵中药材。铁皮石斛是我国最珍贵的中药材之一，被尊列为“中华九大仙草”(铁皮石斛、天山雪莲、三两重人参，百二十年首乌、花甲之茯苓、苁蓉、深山灵芝、海底珍珠、冬虫夏草)之首，素有“药中黄金”之美称。铁皮石斛的应用，早在东汉末年的《神农本草经》中就有记载，《本草纲目》、《中药大词典》等我国古代多部医学著作中都记载了铁皮石斛的药用功能。具有益胃生津、滋阴清热、止咳润肺的功效。现代药理研究表明，石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力和扩张血管的作用。
野生铁皮石斛对自然生态条件要求极其苛刻，自然繁殖率又极低，早在上个世纪八十年代，铁皮石斛就被国家列为重点保护的珍惜濒危药用植物。由于石斛自然繁殖力低，种子需与真菌共生才能萌发，加上长期采挖，而且生长环境要求苛刻，使得野生铁皮石斛资源日渐枯竭，成为濒危植物，被列为国家重点保护的野生药材品种。为了满足市场的需求，国内许多科研人员进行了铁皮石斛组织培养技术的研究。组织培养技术使大规模人工栽培成为可能。植物组织培养是指植物的所有器官、组织和细胞，在人为的控制条件下，放入含有植物营养和调节剂等组成的培养基中，让其生长、分化形成完整植株的过程。其优势在于快速繁殖和保持种植资源，人为的创造环境让适于南方山里地带生长的珍稀中药材在华北地区进行栽培驯化，可以在短期内生产出大量的铁皮石斛苗并为进一步研究提供理论依据。
采取组织培养和快速繁殖并模拟铁皮石斛野外生长环境，在华北地区进行驯化的新技术，是解决铁皮石斛在北方生产和市场对其大量需求的一个有效途径。我们通过研究，找到了影响铁皮石斛生长和增殖的关键因素，探索了铁皮石斛的组培快繁以及在华北地区栽培的一整套技术体系。其一，利用铁皮石斛茎段进行组培与快繁；其二，筛选适宜铁皮石斛培养的最佳培养基；其三，筛选出了铁皮石斛的组培与快繁所需最佳环境条件，以及适宜的扦插基质与管理方法，降低了污染率；其四，模拟铁皮石斛野外生长环境，在华北地区进行驯化，提高了成活率，为优质铁皮石斛的推广发展提供了强有力的技术保障。
发明内容
本发明的目的是提供一种华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，具体技术方案如下：
华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，工艺步骤如下：
（一）灭菌入瓶
从正在生长的植株中，选择生长健壮，无病虫，具有本品种特征特性的植株，在流动的自来水中冲洗干净，拮干水分，在无菌室内的超净工作台上，剪取1.0-1.5cm长含有1-2个腋芽的茎段用75%的酒精浸泡20 s，0.1%的升汞溶液灭菌8 min，无菌水冲洗5-8遍，快速接种到诱导培养基中；然后在温度（22±1）℃，日照时数12 h，光照强度1800-2200 lx的条件下培养，28-35 d后培养瓶内茎段萌发的侧芽长出3-5片叶，除去病苗弱苗，其余的进行编号并快繁一次；
（二）增殖培养
在超净工作台上，将组培快繁无菌苗剪成1~1.5 cm的带节间的茎段转接到增殖培养基中进行增殖培养，pH5.6~5.8，在温度22-25 ℃，光照12 h/d，光照强度1800-2200 lx，湿度65%-70%的环境条件下进行培养，7-10 d形成愈伤组织，15-20 d愈伤组织逐渐减少，形成丛生芽，25-30 d生长高度3-5 cm，即可在同一培养基上继代繁殖，继代周期为28-30 d，循环往复，增殖倍数5-10；
（三）生根培养
选取生长势强、健壮的无菌芽苗切成含有生长点的茎段长1.0-1.5 cm转入生根培养基中，25-28 d，植株长出3-5条0.3-3 cm长的根，展开叶3-5片，待苗长至30-35 d时，即可炼苗出瓶。培养温度(22±2) ℃，湿度65-75%，光照强度1800-2200 lx，光照时间10-12h/d；
（四）炼苗与出瓶
炼苗前首先揭开培养瓶的封口膜，炼苗时间为5-7天，炼苗时在保证温、湿度的条件下，逐步接近自然环境，以提高成活率，然后小心取出，用自来水冲洗净苗基部的培养基，并灭菌；
（五）驯化栽培
将冲洗干净的组培苗移栽至驯化基质，在驯化基质上挖小坑，将铁皮石斛组培苗的根须放入小坑，用基质盖好，不用压实，前期适当遮阴并保持湿度在90％，逐步降至70-80％，定期喷洒40％多菌灵800倍液杀菌，7-10天一次，15天后去掉薄膜罩，直至新长出3-4 片新叶，叶色深绿，根须达5 条以上，得合格驯化苗。
华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，所用培养基组分及配比如下：
基本培养基为1/2MS，生长调节物质有6-苄基腺嘌呤（6-BA﹚、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D﹚﹑α-奈乙酸﹙NAA﹚﹑玉米素(ZT)；
诱导培养基1/2MS+6-BA1.0-4.5 mg/L+NAA0.5-1.5 mg/L+2.4-D0.5-1.5 mg/L+ZT0.2-0.5 mg/L+苹果汁100-200 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L；
增殖培养基1/2MS+6-BA2.0 mg/L+ NAA0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6.5 g/L；
生根培养基1/2MS+ NAA0.5-2.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L。
优选的，华北地区铁皮石斛组织培养及驯化栽培技术，所用培养基组分及配比如下：
诱导培养基1/2MS+6-BA2.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+2.4-D1.2 mg/L+ZT0.3 mg/L +苹果汁100-200 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L，侧芽出芽率最高；
增殖培养基1/2MS+6-BA2.0 mg/L+ NAA0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6.5 g/L，丛生苗的增殖系数较大；
生根培养基1/2MS+ NAA1.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L，pH5.8，组培苗平均根数最多和平均根长最长。
优选的，华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，驯化栽培条件：驯化棚为遮光的日光塑料膜棚，驯化基质为石子和发酵松树皮松鳞以1:3的比例混合，松树皮要用水浸泡一周排酸，杀菌后使用；温度20-25 ℃，空气湿度70-80%，驯化时间40~60天。
本发明常用的设备和材料如下：
1. 电子天平：0.0001 g、0.001 g、0.01 g。
2. 培养室及工作室。
3. 高压锅。
4. 蒸馏器。
5. 超净工作台。
6. 培养架。
7. 培养瓶。
8. 玻璃制品溶液瓶、试管等。
9. 操作所用物品：滤纸、解剖刀、手术剪、酒精灯等。
与现有技术相比，本发明的积极效果有：
1.本发明利用铁皮石斛的茎段进行组织培养，可保证原品种全部的遗传性和该品种品质的一致性，有利于保持其种植资源；
2.快繁克服了传统的子苗繁殖速度慢的弊端，不受季节限制，实现多次、快速、大量繁殖，1年内1个茎段可增殖8~10万株、1个人1年内可快繁10~15万个与母体生理特征完全一致的小植株，可实现工厂化育苗、高效率生产；
3.可人为地控制培养生长条件，不受自然条件的影响，取材量小，培养材料经济，生长周期短，繁殖系数大，管理方便，利于自动化生产和产业化生产；
4.培养基质用石子和发酵松树皮松鳞颗粒，模拟铁皮石斛野外生长环境，在华北地区进行驯化，既经济又有效，降低了生产成本，驯化成活率大于96%，实现了铁皮石斛在华北地区批量生产。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例进行详细描述。
实施例1
华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，工艺步骤如下：
（一）灭菌入瓶
从正在生长的植株中，选择生长健壮，无病虫，具有本品种特征特性的植株，在流动的自来水中冲洗干净，拮干水分，在无菌室内的超净工作台上，剪取1.0-1.5cm长含有1-2个腋芽的茎段用75%的酒精浸泡20 s，0.1%的升汞溶液灭菌8 min，无菌水冲洗5-8遍，快速接种到诱导培养基中；然后在温度（22±1）℃，日照时数12 h，光照强度1800-2200 lx的条件下培养，28-35 d后培养瓶内茎段萌发的侧芽长出3-5片叶，除去病苗弱苗，其余的进行编号并快繁一次；
（二）增殖培养
在超净工作台上，将组培快繁无菌苗剪成1~1.5 cm的带节间的茎段转接到增殖培养基中进行增殖培养，pH5.6~5.8，在温度22-25 ℃，光照12 h/d，光照强度1800-2200 lx，湿度65-70%的环境条件下进行培养，7-10 d形成愈伤组织，15-20 d愈伤组织逐渐减少，形成丛生芽，25-30 d生长高度3-5 cm，即可在同一培养基上继代繁殖，继代周期为28-30 d，循环往复，增殖倍数5-10；
（三）生根培养
选取生长势强、健壮的无菌芽苗切成含有生长点的茎段长1.0-1.5 cm转入生根培养基中，25-28 d，有95%以上的植株长出3-5条0.3-3 cm长的根，展开叶3-5片，待苗长至30-35 d时，即可炼苗移栽。培养温度（22±2）℃，湿度65-75%，光照强度1800-2200 lx，光照时间10-12 h/d；
（四）炼苗与出瓶
炼苗前首先揭开培养瓶的封口膜，炼苗时间为5-7天，炼苗时在保证温、湿度的条件下，逐步接近自然环境，以提高成活率，然后小心取出，用自来水冲洗净苗基部的培养基，并灭菌；
（五）驯化栽培
将冲洗干净的组培苗移栽至驯化基质，在驯化基质上挖小坑，将铁皮石斛组培苗的根须放入小坑，用基质盖好，不用压实，前期适当遮阴并保持湿度在90％，逐步降至70-80％，定期喷洒40％多菌灵800倍液杀菌，7-10天一次，15天后去掉薄膜罩，直至新长出3-4 片新叶，叶色深绿，根须达5 条以上，得合格驯化苗。
华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，所用培养基组分及配比如下：
基本培养基为1/2MS，生长调节物质有6-苄基腺嘌呤（6-BA﹚、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D﹚﹑α-奈乙酸﹙NAA﹚﹑玉米素(ZT)；
诱导培养基1/2MS+6-BA2.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+2.4-D1.2 mg/L+ZT0.3 mg/L+苹果汁100-200 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L；
增殖培养基1/2MS+6-BA2.0 mg/L+ NAA0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6.5 g/L；
生根培养基1/2MS+ NAA1.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L，pH5.8。
华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，驯化栽培条件：驯化棚为遮光的日光塑料膜棚，驯化基质为石子和发酵松树皮松鳞以1:3的比例混合，松树皮要用水浸泡一周排酸，杀菌后使用；温度20-25℃，空气湿度70-80%，驯化时间40~60天。
驯化苗移栽后，成活率97.2%。
实施例2
本实施例中其他步骤与实施例1相同，区别步骤是华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，所用培养基组分及配比如下：
基本培养基为1/2MS，生长调节物质有6-苄基腺嘌呤（6-BA﹚、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D﹚﹑α-奈乙酸﹙NAA﹚﹑玉米素(ZT)；
诱导培养基1/2MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+2.4-D0.5 mg/L+ZT0.2 mg/L +苹果汁100 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L；
增殖培养基1/2MS+6-BA2.0 mg/L+ NAA0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6.5 g/L；
生根培养基1/2MS+ NAA0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L，pH5.8。
驯化苗移栽后，成活率96.7%。
实施例3
本实施例中其他步骤与实施例1相同，区别步骤是华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，所用培养基组分及配比如下：
基本培养基为1/2MS，生长调节物质有6-苄基腺嘌呤（6-BA﹚、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D﹚﹑α-奈乙酸﹙NAA﹚﹑玉米素(ZT)；
诱导培养基1/2MS+6-BA4.5 mg/L+NAA1.5 mg/L+2.4-D1.5 mg/L+ZT0.5 mg/L +苹果汁200 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L；
增殖培养基1/2MS+6-BA2.0 mg/L+ NAA0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6.5 g/L；
生根培养基1/2MS+ NAA2.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L，pH5.8。
驯化苗移栽后，成活率97.3%。
实施例4
本实施例中其他步骤与实施例1相同，区别步骤是华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，所用培养基组分及配比如下：
基本培养基为1/2MS，生长调节物质有6-苄基腺嘌呤（6-BA﹚、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D﹚﹑α-奈乙酸﹙NAA﹚﹑玉米素(ZT)；
诱导培养基1/2MS+6-BA2.5 mg/L+NAA1.2 mg/L+2.4-D0.8 mg/L+ZT0.4 mg/L +苹果汁150 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L；
增殖培养基1/2MS+6-BA2.0 mg/L+ NAA0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6.5 g/L；
生根培养基1/2MS+ NAA1.7 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L，pH5.8。
驯化苗移栽后，成活率98.1%。
由以上实施例可知，本发明提供的华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，从取材灭菌入瓶到驯化苗长成最快仅需128 d，驯化苗移栽后成活率大于96%。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，其特征在于，工艺步骤如下：
（一）灭菌入瓶
从正在生长的植株中，选择生长健壮，无病虫，具有本品种特征特性的植株，在流动的自来水中冲洗干净，拮干水分，在无菌室内的超净工作台上，剪取1.0-1.5cm长含有1-2个腋芽的茎段用75%的酒精浸泡20 s，0.1%的升汞溶液灭菌8 min，无菌水冲洗5-8遍，快速接种到诱导培养基中；然后在温度（22±1）℃，日照时数12 h，光照强度1800-2200 lx的条件下培养，28-35 d后培养瓶内茎段萌发的侧芽长出3-5片叶，除去病苗弱苗，其余的进行编号并快繁一次；
（二）增殖培养
在超净工作台上，将组培快繁无菌苗剪成1~1.5 cm的带节间的茎段转接到增殖培养基中进行增殖培养，pH5.6~5.8，在温度22-25 ℃，光照12 h/d，光照强度1800-2200 lx，湿度65-70%的环境条件下进行培养，7-10 d形成愈伤组织，15-20 d愈伤组织逐渐减少，形成丛生芽，25-30 d生长高度3-5 cm，即可在同一培养基上继代繁殖，继代周期为28-30 d，循环往复，增殖倍数5-10；
（三）生根培养
选取生长势强、健壮的无菌芽苗切成含有生长点的茎段长1.0-1.5 cm转入生根培养基中，pH5.8，培养25-28 d，植株长出3-5条0.3-3 cm长的根，展开叶3-5片，待苗长至30-35 d时，即可炼苗，培养温度（22±2）℃，湿度65-75%，光照强度1800-2200 lx，光照时间10-12h/d；
（四）炼苗与出瓶
练苗前首先揭开培养瓶的封口膜，练苗时间5-7 d，练苗时在保证温、湿度的条件下，逐步接近自然环境，以提高成活率，然后小心取出，用自来水冲洗净苗基部的培养基，并灭菌；
（五）驯化栽培
将冲洗干净的组培苗移栽至驯化基质，在驯化基质上挖小坑，将铁皮石斛组培苗的根须放入小坑，用基质盖好，不用压实，前期适当遮阴并保持湿度在90％，逐步降至70-80％，定期喷洒40％多菌灵800倍液杀菌，7-10天一次，15天后去掉薄膜罩，直至新长出3-4 片新叶，叶色深绿，根须达5 条以上，得合格驯化苗。
2.根据权利要求1所述的华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，其特征在于，所用培养基组分及配比如下：
基本培养基为1/2MS，生长调节物质有6-苄基腺嘌呤（6-BA﹚、2.4-二氯苯氧乙酸（2.4-D﹚﹑α-奈乙酸﹙NAA﹚﹑玉米素(ZT)；
诱导培养基1/2MS+6-BA1.0-4.5 mg/L+NAA0.5-1.5 mg/L+2.4-D0.5-1.5 mg/L+ZT0.2-0.5 mg/L+苹果汁100-200 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L；
增殖培养基1/2MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6.5 g/L；
生根培养基1/2MS+NAA0.5-2.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L。
3.根据权利要求1所述的华北地区铁皮石斛组织培养及驯化栽培技术，其特征在于，所用培养基组分及配比如下：
诱导培养基1/2MS+6-BA2.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+2.4-D1.2 mg/L+ZT0.3 mg/L+苹果汁100-200 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L；
增殖培养基1/2MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6.5 g/L；
生根培养基1/2MS+NAA1.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L。
4.根据权利要求1所述的华北地区铁皮石斛的组培快繁及驯化栽培技术，其特征在于，驯化栽培条件：驯化棚为70%遮光的日光塑料膜棚，驯化基质为石子和发酵松树皮松鳞以1:3的比例混合，松树皮要用水浸泡一周排酸，杀菌后使用；温度20-25 ℃，空气湿度70-80%，驯化时间40~60天。
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