CN103053425A - 一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法 - Google Patents

一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，属于石斛人工栽培技术领域。其方法包括以下步骤：外植体准备、腋芽及原球茎诱导、增殖培养和生根壮苗培养。本发明的有益效果是：能很好地解决铁皮石斛无性繁殖中外植体灭菌不充分，污染率高，无菌培养无法进行，原球茎分化慢，分化少，繁殖周期长，生产成本高等技术难度，相比现有方法，能实现快速繁殖，其繁殖周期能减少60天以上。另其种苗遗传性状稳定，变异小，能较好地保持母本特征、特性，其品种纯正，从而为铁皮石斛种植产业的发展提供了优质的种苗保证，具有较好的经济效益和社会效益。

Description

一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法
技术领域
本发明属于石斛人工栽培技术领域，具体涉及一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法。
背景技术
铁皮石斛种苗生产中，一般以果实（种子）作为外植体进行快速繁殖。但该方法繁育的种苗，母体性状受限，性状差异大，品种杂，变异大，容易退化，品质难以保证，优良种性难以保持。而以茎尖或茎段作为繁殖材料，进行组培无性快繁时，虽然可以得到目标性选择强，性状一致，品质一致，纯度高的种苗，但存在着外植体基数小，不易消毒，原球茎分化慢，繁殖周期长，增殖倍数低，无菌体系建立难等技术问题，因此在实际生产中应用不多。
发明内容
本发明的主要目的是提供了一种不仅能保持母体的优良性状，还能实现快速繁殖的铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法。
本发明所采取的技术方案是一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
a、外植体准备：将外植体整段鲜条洗涤后风干，使鲜条内的水份脱去35～45%；然后在无菌条件下，用75%的酒精浸泡外植体30秒，再用升汞溶液灭菌15分钟，然后用无菌水冲洗后，取无菌滤纸吸去外植体表面水份，在酒精灯火焰上灼烧后，切成带一个节的茎段；
b、腋芽及原球茎诱导：将所述茎段切去两端，接种到下列诱导培养基中：1/2MS+0.5～1.0mg/L6-BA+0.2～0.5mg/LNAA+马铃薯汁10g/L+香蕉汁10g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L+活性炭0.5g/L，PH值为5.2～5.6；其中培养温度为22～28℃，光照强度为1600～2000Lux，光照时间为8小时/天，培养30～40天，至茎节处萌生腋芽形成芽丛，茎部产生大量原球茎；
c、增殖培养：将所述芽丛转接到下列增殖培养基中：1/2MS+0.2～0.5mg/L6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁10g/L+活性炭0.5g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L，反复切割培养实现芽的增殖，得到高度为2～3cm的种苗；将所述原球茎转接到下列增殖培养基中：1/2MS+0.1～0.2mg/L6-BA+0.2～0.4mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁10g/L+活性炭0.5g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L，实现芽及原球茎的同时增殖，得到高度为2～3cm的种苗；其中，培养温度为22～28℃，光照强度为2000～2500Lux，光照时间为8小时/天；
d、生根壮苗培养：将上述种苗转接到下列生根壮苗培养基中：1/2MS+0.2～0.4mg/L1-BA+0.2～0.6mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁15g/L+活性炭0.5g/L+琼脂25g/L+蔗糖25g/L，PH值为5.2～5.6；其中，培养室的温度为22～28℃，培养90天后出瓶移栽即可。
作为优选，所述步骤a中的外植体选择生长健壮、长势旺、性状好、杆型好、抗病强的单株茎干。
作为优选，所述步骤a中鲜条内的水份脱去40%。
作为优选，所述步骤a中升汞溶液的重量百分比浓度为0.1%。
作为优选，所述步骤a中无菌水冲洗的次数为6次。
作为优选，所述步骤b中诱导培养基的PH值为5.4。
作为优选，所述步骤d中生根壮苗培养基的PH值为5.4。
作为优选，所述步骤d中培养90天中前60天的光照强度为2000～2500Lux，光照时间为8小时/天；后30天的光照强度为3500～4000Lux，光照时间为14小时/天。
本发明的有益效果在于：（1）采用本发明繁殖方法，能很好地解决铁皮石斛无性繁殖中外植体灭菌不充分，污染率高，无菌培养无法进行，原球茎分化慢，分化少，繁殖周期长，生产成本高等技术难度；（2）相比现有方法，本发明繁殖方法能实现快速繁殖，其繁殖周期能减少60天以上；（3）采用发明繁殖方法，所得到的种苗遗传性状稳定，变异小，能较好地保持母本特征、特性，其品种纯正；（4）采用本发明繁殖方法，由于对外植体灭菌彻底，为建立良好的无菌体系提供了基础，从而保证了种苗的质量；（5）本发明繁殖方法，可在实际生产中进行广泛应用，从而为铁皮石斛种植产业的发展提供了保障，具有较好的经济效益和社会效益。
具体实施方式
为使本领域技术人员详细了解本发明的生产工艺和技术效果，下面以具体的生产实例来进一步介绍本发明的应用和技术效果。
实施例一：
选择生长健壮、长势旺、性状好、杆型好和抗病强的单株茎干作为外植体，整段鲜条洗涤后风干，使鲜条内的水份脱去40%；然后在无菌条件下，用75%的酒精浸泡外植体30秒，再用重量百分比浓度为0.1%的升汞溶液灭菌15分钟，然后用无菌水冲洗6次后，取无菌滤纸吸去外植体表面的水份，在酒精灯火焰上灼烧后，切成带一个节的茎段；将茎段切去两端，接种到下列诱导培养基中：1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+马铃薯汁10g/L+香蕉汁10g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L+活性炭0.5g/L，PH值为5.4；其诱导培养时的培养温度为22℃，光照强度为1600Lux，光照时间为8小时/天，培养时间为40天，至茎节处萌生腋芽形成芽丛，茎部产生大量原球茎；将芽丛转接到下列增殖培养基中：1/2MS+0.2mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁10g/L+活性炭0.5g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L，反复切割培养实现芽的增殖，得到高度为2～3cm的种苗；将原球茎转接到下列增殖培养基中：1/2MS+0.1mg/L6-BA+0.4mg/LNAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁10g/L+活性炭0.5g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L，实现芽及原球茎的同时增殖，得到高度为2～3cm的种苗；其中，芽丛和原球茎增殖时的培养温度为22℃，光照强度为2000Lux，光照时间为8小时/天；然后将种苗转接到下列生根壮苗培养基中：1/2MS+0.3mg/L1-BA+0.4mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁15g/L+活性炭0.5g/L+琼脂25g/L+蔗糖25g/L，PH值为5.4；其生根壮苗时的培养温度为25℃，培养90天后出瓶移栽即可，其中前60天培养的光照强度为2000Lux，光照时间为8小时/天，后30天培养的光照强度为3500Lux，光照时间为14小时/天。
实施例二：
选择生长健壮、长势旺、性状好、杆型好和抗病强的单株茎干作为外植体，整段鲜条洗涤后风干，使鲜条内的水份脱去35%；然后在无菌条件下，用75%的酒精浸泡外植体30秒，再用重量百分比浓度为0.1%的升汞溶液灭菌15分钟，然后用无菌水冲洗6次后，取无菌滤纸吸去外植体表面水份，在酒精灯火焰上灼烧后，切成带一个节的茎段；将茎段切去两端，接种到下列诱导培养基中：1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+马铃薯汁10g/L+香蕉汁10g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L+活性炭0.5g/L，PH值为5.6；其诱导培养时的培养温度为28℃，光照强度为2000Lux，光照时间为8小时/天，培养时间为30天，至茎节处萌生腋芽形成芽丛，茎部产生大量原球茎；将芽丛转接到下列增殖培养基中：1/2MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁10g/L+活性炭0.5g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L，反复切割培养实现芽的增殖，得到高度为2～3cm的种苗；将原球茎转接到下列增殖培养基中：1/2MS+0.2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+马铃薯汁5gL+香蕉汁10g/L+活性炭0.5g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L，实现芽及原球茎的同时增殖，得到高度为2～3cm的种苗；其中，芽丛和原球茎增殖时的培养温度为28℃，光照强度为2500Lux，光照时间为8小时/天；然后将种苗转接到下列生根壮苗培养基中：1/2MS+0.2mg/L1-BA+0.6mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁15g/L+活性炭0.5g/L+琼脂25g/L+蔗糖25g/L，PH值为5.6；其生根壮苗时的培养温度为25℃，培养90天后出瓶移栽即可，其中前60天培养的光照强度为2200Lux，光照时间为8小时/天，后30天培养的光照强度为3800Lux，光照时间为14小时/天。
实施例三：
选择生长健壮、长势旺、性状好、杆型好和抗病强的单株茎干作为外植体，整段鲜条洗涤后风干，使鲜条内的水份脱去45%；然后在无菌条件下，用75%的酒精浸泡外植体30秒，再用重量百分比浓度为0.1%的升汞溶液灭菌15分钟，然后用无菌水冲洗6次后，取无菌滤纸吸去外植体表面水份，在酒精灯火焰上灼烧后，切成带一个节的茎段；将茎段切去两端，接种到下列诱导培养基中：1/2MS+0.8mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+马铃薯汁10g/L+香蕉汁10g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L+活性炭0.5g/L，PH值为5.2；其诱导培养时的培养温度为25℃，光照强度为1800Lux，光照时间为8小时/天，培养时间为35天，至茎节处萌生腋芽形成芽丛，茎部产生大量原球茎；将芽丛转接到下列增殖培养基中：1/2MS+0.8mg/L6-BA+0.3mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁10g/L+活性炭0.5g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L，反复切割培养实现芽的增殖，得到高度为2～3cm的种苗；将原球茎转接到下列增殖培养基中：1/2MS+0.1mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+马铃薯汁5gL+香蕉汁10g/L+活性炭0.5g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L，实现芽及原球茎的同时增殖，得到高度为2～3cm的种苗；其中，芽丛和原球茎增殖时的培养温度为26℃，光照强度为2300Lux，光照时间为8小时/天；然后将种苗转接到下列生根壮苗培养基中：1/2MS+0.3mg/L1-BA+0.4mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁15g/L+活性炭0.5g/L+琼脂25g/L+蔗糖25g/L，PH值为5.6；其生根壮苗时的培养温度为25℃，培养90天后出瓶移栽即可，其中前60天培养的光照强度为2500Lux，光照时间为8小时/天，后30天培养的光照强度为4000Lux，光照时间为14小时/天。

Claims (8)

1.一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
a、外植体准备：将外植体整段鲜条洗涤后风干，使鲜条内的水份脱去35～45%；然后在无菌条件下，用75%的酒精浸泡外植体30秒，再用升汞溶液灭菌15分钟，然后用无菌水冲洗后，取无菌滤纸吸去外植体表面水份，在酒精灯火焰上灼烧后，切成带一个节的茎段；
b、腋芽及原球茎诱导：将所述茎段切去两端，接种到下列诱导培养基中：1/2MS+0.5～1.0mg/L6-BA+0.2～0.5mg/L NAA+马铃薯汁10g/L+香蕉汁10g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L+活性炭0.5g/L，PH值为5.2～5.6；其中培养温度为22～28℃，光照强度为1600～2000Lux，光照时间为8小时/天，培养30～40天，至茎节处萌生腋芽形成芽丛，茎部产生大量原球茎；
c、增殖培养：将所述芽丛转接到下列增殖培养基中：1/2MS+0.2～0.5mg/L6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁10g/L+活性炭0.5g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L，反复切割培养实现芽的增殖，得到高度为2～3cm的种苗；将所述原球茎转接到下列增殖培养基中：1/2MS+0.1～0.2mg/L6-BA+0.2～0.4mg/LNAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁10g/L+活性炭0.5g/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L，实现芽及原球茎的同时增殖，得到高度为2～3cm的种苗；其中，培养温度为22～28℃，光照强度为2000～2500Lux，光照时间为8小时/天；
d、生根壮苗培养：将上述种苗转接到下列生根壮苗培养基中：1/2MS+0.2～0.4mg/L1-BA+0.2～0.6mg/L NAA+马铃薯汁5g/L+香蕉汁15g/L+活性炭0.5g/L+琼脂25g/L+蔗糖25g/L，PH值为5.2～5.6；其中，培养室的温度为22～28℃，培养90天后出瓶移栽即可。
2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤a中的外植体选择生长健壮、长势旺、性状好、杆型好、抗病强的单株茎干。
3.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤a中鲜条内的水份脱去40%。
4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤a中升汞溶液的重量百分比浓度为0.1%。
5.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤a中无菌水冲洗的次数为6次。
6.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤b中诱导培养基的PH值为5.4。
7.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤d中生根壮苗培养基的PH值为5.4。
8.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤d中培养90天中前60天的光照强度为2000～2500Lux，光照时间为8小时/天；后30天的光照强度为3500～4000Lux，光照时间为14小时/天。
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