CN103493738B - 一种朱顶红标准化离体培养种苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种朱顶红标准化离体培养种苗的方法，将朱顶红杂交株系的小鳞茎经消毒灭菌，再纵剖成块接种于不定芽培养基中进行诱导培养至生成不定芽，然后将不定芽切块后，置于增殖苗培养基中进行继代培养得到增殖苗，再将增殖苗切分成单株后，置于生根苗培养基中进行生根培养，得到生根苗，最后生根苗经驯化后定植得到移栽苗，成活率达95%以上。本发明解决了朱顶红繁殖效率低无法实现工厂化生产的问题，并高效诱导出朱顶红不定芽，筛选出繁殖系数达3的培养基配方，摸索出不同培养阶段的切苗方法，缩短了朱顶红繁殖的周期。
Description
技术领域
本发明提供一种朱顶红标准化离体培养种苗的方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术
朱顶红(HippeastrumvittatumHerb.)是单子叶亚纲石蒜科（Amaryllidaceae）朱顶红属（HippeastrumHerb.）所有种类的总称，原产于中南美洲，即从阿根廷北部到墨西哥以及加勒比海。朱顶红花枝亭亭玉立，4～6朵喇叭形花朵着生于顶端，给人华贵之感，叶片狭长如君子兰，即使在无花期也有很高的观赏价值。朱顶红一般通过分球繁殖，但繁殖率很低，无法满足生产与市场的需要。因此，离体培养朱顶红种苗可以大幅提高其繁殖系数，具有很好的现实意义。
朱顶红组织培养技术自20世纪80年代就开始研究，多年来国内外科研工作者经过不懈努力已有了一定的发展，但是真正要运用组培技术实现标准化工厂化育苗，还有待突破。
发明内容
为解决运用组培技术实现朱顶红的标准化育苗问题，本发明从标准化离体培养朱顶红种苗的角度出发，以朱顶红杂交优良株系的鳞茎为试验材料，以MS为基础培养基附加不同浓度的激素即ZT、NAA来诱导不定芽、继代增殖及生根，并提供一种诱导、继代及生根时的切苗方法及培养条件，以实现标准化工厂育苗。
本发明通过下列技术方案实现：一种朱顶红标准化离体培养种苗的方法，其特征在于经过下列各步骤：
（1）将朱顶红杂交株系的小鳞茎依次在质量浓度为75-80%的酒精中消毒灭菌20～40秒、质量浓度为0.1-0.15%的氯化汞溶液中消毒灭菌10～20分钟、、质量浓度为2-3%的次氯酸钠溶液中消毒灭菌5～10分钟，然后用无菌水漂洗3次；
（2）将步骤（1）消毒后的小鳞茎在无菌工作环境中纵剖成块后，再接种于下列培养基中：MS培养基+2.0～5.0mg/L的ZT+0.1～0.3mg/L的NAA+100～300mg/L的活性炭+30～40g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.6～5.8，并在温度为22～26℃、光照强度为1500～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下，进行诱导培养至生成不定芽；
（3）将步骤（2）所得不定芽在无菌工作环境中切块后，置于下列培养基中：MS培养基+3.0～5.0mg/L的ZT+0.1～0.5mg/L的NAA+100～300mg/L的活性炭+20～60mg/L的硫酸腺嘌呤+30～40g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.6～5.8，并在温度为22～26℃、光照强度为1500～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下，进行继代培养，每30天继代一次，每次继代更换一次上述培养基，并对不定芽进行纵剖，继代培养直至得到增殖苗；
（4）将步骤（3）所得增殖苗切分成单株后，置于下列培养基中：MS培养基+0.3～0.5mg/L的IBA+0.3～0.5mg/L的NAA+100～300mg/L的活性炭+30～40g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.6～5.8，并在温度为22～26℃、光照强度为1500～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下，进行生根培养20～30天，得到生根苗；
（5）将步骤（4）所得生根苗置于塑料大棚苗床上，于自然光照下驯化15～20天，再将生根苗洗净后，置于质量浓度为0.1-0.2%的甲基托布津中浸泡1min，然后置于下列基质中定植：腐殖土:珍珠岩的体积比=3:1，待30～40天后得到移栽苗。
所述步骤（2）的纵剖成块是将小鳞茎纵剖成带有基盘的块状。
所述步骤（3）中对不定芽进行纵剖是将大的不定芽纵剖四分切，小的不定芽纵剖二分切。
本发明通过采取朱顶红杂交优良株系的鳞茎诱导不定芽、继代增殖、生根培养及炼苗后获得朱顶红种苗，以朱顶红杂交优良株系的鳞茎为试验材料，以MS为基础培养基附加不同浓度的激素即ZT、NAA来诱导不定芽、继代增殖及生根、炼苗后最终获得种苗，解决了朱顶红繁殖效率低无法实现工厂化生产的问题。本发明在标准化离体培养朱顶红种苗的过程中，主要解决了下列难题：高效诱导出朱顶红不定芽，筛选出繁殖系数达3的培养基配方，摸索出不同培养阶段的切苗方法，缩短了朱顶红繁殖的周期。本发明具备下列优点和效果：
（1）提供了获得朱顶红不定芽的技术，实现了朱顶红无性系的诱导方法；
（2）针对朱顶红继代增殖率低的问题，采用适宜的培养基配方及切苗方法提高了朱顶红离体培养的效率；
（3）提供了标准化离体培养朱顶红种苗的培养基、切苗方法及培养条件，实现了朱顶红种苗的标准化生产。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
（1）将朱顶红杂交株系的小鳞茎依次在质量浓度为75%的酒精中消毒灭菌30秒、质量浓度为0.1%的氯化汞溶液中消毒灭菌10分钟、质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中消毒灭菌10分钟，然后用无菌水漂洗3次；
（2）将步骤（1）经消毒后的小鳞茎在无菌工作环境中纵剖成带有基盘的块状后，再接种于下列培养基中：MS培养基+5.0mg/L的ZT+0.2mg/L的NAA+200mg/L的活性炭+30g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.8，并在温度为24℃、光照强度为2200Lx、光照时间为15h/天的条件下，进行诱导培养至生成不定芽；
（3）将步骤（2）所得不定芽在无菌工作环境中切块后，置于下列培养基中：MS培养基+3.0mg/L的ZT+0.5mg/L的NAA+200mg/L的活性炭+40mg/L的硫酸腺嘌呤+40g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.6，并在温度为26℃、光照强度为1500Lx、光照时间为16h/天的条件下，进行继代培养，每30天继代一次，每次继代更换一次上述培养基，并对不定芽进行纵剖，大的不定芽纵剖四分切，小的不定芽纵剖二分切，继代培养直至得到增殖苗；
（4）将步骤（3）所得增殖苗切分成单株后，置于下列培养基中：MS培养基+0.3mg/L的IBA+0.4mg/L的NAA+300mg/L的活性炭+30g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.7，并在温度为26℃、光照强度为1800Lx、光照时间为16h/天的条件下，进行生根培养25天，得到生根苗；
（5）将步骤（4）所得生根苗置于塑料大棚苗床上，于自然光照下驯化20天，再将生根苗洗净后，置于质量浓度为0.1%的甲基托布津中浸泡1min，然后置于下列基质中定植：腐殖土:珍珠岩的体积比=3:1，待35天后得到移栽苗，成活率达95%以上。
实施例2
（1）将朱顶红杂交株系的小鳞茎依次在质量浓度为75%的酒精、质量浓度为0.1%的氯化汞溶液、质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中，分别消毒灭菌20秒、15分钟、5分钟，然后用无菌水漂洗3次；
（2）将步骤（1）经消毒后的小鳞茎在无菌工作环境中纵剖成带有基盘的块状后，再接种于下列培养基中：MS培养基+3.0mg/L的ZT+0.3mg/L的NAA+300mg/L的活性炭+35g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.7，并在温度为22℃、光照强度为1500Lx、光照时间为16h/天的条件下，进行诱导培养至生成不定芽；
（3）将步骤（2）所得不定芽在无菌工作环境中切块后，置于下列培养基中：MS培养基+4.0mg/L的ZT+0.3mg/L的NAA+100mg/L的活性炭+60mg/L的硫酸腺嘌呤+35g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.8，并在温度为24℃、光照强度为1800Lx、光照时间为14h/天的条件下，进行继代培养，每30天继代一次，每次继代更换一次上述培养基，并对不定芽进行纵剖，大的不定芽纵剖四分切，小的不定芽纵剖二分切，继代培养直至得到增殖苗；
（4）将步骤（3）所得增殖苗切分成单株后，置于下列培养基中：MS培养基+0.4mg/L的IBA+0.5mg/L的NAA+200mg/L的活性炭+35g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.8，并在温度为22℃、光照强度为1500Lx、光照时间为14h/天的条件下，进行生根培养30天，得到生根苗；
（5）将步骤（4）所得生根苗置于塑料大棚苗床上，于自然光照下驯化15天，再将生根苗洗净后，置于质量浓度为0.1%的甲基托布津中浸泡1min，然后置于下列基质中定植：腐殖土:珍珠岩的体积比=3:1，待40天后得到移栽苗，成活率达95%以上。
实施例3
（1）将朱顶红杂交株系的小鳞茎依次在质量浓度为75%的酒精、质量浓度为0.1%的氯化汞溶液、质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中，分别消毒灭菌40秒、20分钟、8分钟，然后用无菌水漂洗3次；
（2）将步骤（1）经消毒后的小鳞茎在无菌工作环境中纵剖成带有基盘的块状后，再接种于下列培养基中：MS培养基+2.0mg/L的ZT+0.1mg/L的NAA+100mg/L的活性炭+40g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.6，并在温度为26℃、光照强度为1800Lx、光照时间为12h/天的条件下，进行诱导培养至生成不定芽；
（3）将步骤（2）所得不定芽在无菌工作环境中切块后，置于下列培养基中：MS培养基+5.0mg/L的ZT+0.1mg/L的NAA+300mg/L的活性炭+20mg/L的硫酸腺嘌呤+30g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.7，并在温度为22℃、光照强度为2200Lx、光照时间为12h/天的条件下，进行继代培养，每30天继代一次，每次继代更换一次上述培养基，并对不定芽进行纵剖，大的不定芽纵剖四分切，小的不定芽纵剖二分切，继代培养直至得到增殖苗；
（4）将步骤（3）所得增殖苗切分成单株后，置于下列培养基中：MS培养基+0.5mg/L的IBA+0.3mg/L的NAA+100mg/L的活性炭+40g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.6，并在温度为25℃、光照强度为2200Lx、光照时间为12h/天的条件下，进行生根培养20天，得到生根苗；
（5）将步骤（4）所得生根苗置于塑料大棚苗床上，于自然光照下驯化18天，再将生根苗洗净后，置于质量浓度为0.1%的甲基托布津中浸泡1min，然后置于下列基质中定植：腐殖土:珍珠岩的体积比=3:1，待30天后得到移栽苗，成活率达95%以上。
本发明经不同培养基试验对比研究，对各培养基的效果有如下结果及结论：
培养方法与实施例相同，不定芽的培养基参数及其结果见表1：
表1不同激素组合对不定芽诱导的影响
从表1可以看出，当NAA浓度为0.1时，随着ZT浓度的升高，朱顶红优良株系的诱导出芽率都呈现出逐渐升高的趋势。当ZT为5mg/L、NAA为0.1mg/L时，所有优良株系的出芽率都达到了85%以上，因此最适宜诱导朱顶红出不定芽的培养基配方是MS+ZT5mg/L+NAA0.1mg/L。
增殖苗的继代培养基参数及其结果见表2：
表2不同激素组合对朱顶红不定芽繁殖系数的影响
从表2可看出，当NAA浓度为0.1mg/L时，随着ZT浓度的升高，朱顶红优良株系的繁殖系数不断上升，而随着硫酸腺嘌呤浓度的增加，朱顶红优良株系的繁殖系数也呈上升趋势，但当ZT3mg/L、NAA0.1mg/L、硫酸腺嘌呤浓度为40mg/L时的增殖效果最明显，增殖系数均为3.5以上，因此最适宜的不定芽的增殖培养基配方是MS+ZT3mg/L+NAA0.1mg/L+硫酸腺嘌呤40mg/L。
生根苗的继代培养基参数及其结果见表3：
表3不同激素组合对朱顶红生根的影响
从表3可看出，朱顶红优良株系在所有激素组合的培养基上都能生根，且生根率达90%以上，说明朱顶红是易生根的植物，而朱顶红在繁殖苗阶段也可见部分小苗长根，因此相对来说，最适宜的生根培养基配方是MS+IBA0.5mg/L+NAA0.5mg/L。
下面通过对比试验例对本发明的优点和效果做进一步说明。
1、试验对象：朱顶红杂交优良株系鳞茎。
2、试验方法：与实施例1相同，试验例采用本发明实施例1步骤（2）的培养基培养不定芽，而对比例采用常规方法并采用下列培养基培养不定芽：MS培养基+1mg/L的6-BA+2mg/L的NAA+100～300mg/L的活性炭+30～40g/L的糖+6g/L的琼脂。
3、其结果见表4：
表4不定芽诱导结果
从表4可以看出，对比例使用的培养基其出芽率为81.6%，而用本发明实施例1步骤（2）的诱导培养基其出芽率达93%。另外，用朱顶红的无菌小鳞茎进行切割试验发现，四分切要比二分切的增殖系数高，但其培养的时间较长需要70d以上；而本发明提供的增殖培养基配方增值系数为3.5以上，且本发明将继代过程中的无菌鳞茎分为大小两类，大的四分切，小的二分切，大大缩短了培养时间，30d继代一次，加快了朱顶红组织培养的进度，有利于实现朱顶红的规模化及标准化生产。
Claims (1)
1.一种朱顶红标准化离体培养种苗的方法，其特征在于经过下列各步骤：
（1）将朱顶红杂交株系的小鳞茎依次在质量浓度为75-80%的酒精中消毒灭菌20～40秒、质量浓度为0.1-0.15%的氯化汞溶液中消毒灭菌10～20分钟、质量浓度为2-3%的次氯酸钠溶液中消毒灭菌5～10分钟，然后用无菌水漂洗3次；
（2）将步骤（1）消毒后的小鳞茎在无菌工作环境中纵剖成块后，再接种于下列培养基中：MS培养基+2.0～5.0mg/L的ZT+0.1～0.3mg/L的NAA+100～300mg/L的活性炭+30～40g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.6～5.8，并在温度为22～26℃、光照强度为1500～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下，进行诱导培养至生成不定芽；所述纵剖成块是将小鳞茎纵剖成带有基盘的块状；
（3）将步骤（2）所得不定芽在无菌工作环境中切块后，置于下列培养基中：MS培养基+3.0～5.0mg/L的ZT+0.1～0.5mg/L的NAA+100～300mg/L的活性炭+20～60mg/L的硫酸腺嘌呤+30～40g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.6～5.8，并在温度为22～26℃、光照强度为1500～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下，进行继代培养，每30天继代一次，每次继代更换一次上述培养基，并对不定芽进行纵剖切块，继代培养直至得到增殖苗；所述不定芽纵剖切块是将大的不定芽纵剖四分切，小的不定芽纵剖二分切；
（4）将步骤（3）所得增殖苗切分成单株后，置于下列培养基中：MS培养基+0.3～0.5mg/L的IBA+0.3～0.5mg/L的NAA+100～300mg/L的活性炭+30～40g/L的糖+6g/L的琼脂，控制pH为5.6～5.8，并在温度为22～26℃、光照强度为1500～2200Lx、光照时间为12～16h/天的条件下，进行生根培养20～30天，得到生根苗；
（5）将步骤（4）所得生根苗置于塑料大棚苗床上，于自然光照下驯化15～20天，再将生根苗洗净后，置于质量浓度为0.1-0.2%的甲基托布津中浸泡1min，然后置于下列基质中定植：腐殖土:珍珠岩的体积比=3:1，待30～40天后得到移栽苗。
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| CN104585034B (zh) * | 2015-01-20 | 2016-04-20 | 广东省农业科学院环境园艺研究所 | 一种朱顶红花瓣组织诱导再生植株的方法 |
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- 2013-10-14 CN CN201310478138.8A patent/CN103493738B/zh active Active
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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